本发明属于生物医学领域，涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生成素激动作用的二硫键修饰的促红细胞生成素拟肽衍生物的结构类似物，本发明还涉及该结构类似物在治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用。
背景技术：
：人体中的促红细胞生成素是由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。服用促红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度(即增加血液中红细胞百分比)。各种贫血的特征是血液携带氧的容量下降，从而具有类似的表现和症状，包括皮肤和粘膜苍白、虚弱、头昏眼花、容易疲劳、嗜睡，导致生活质量下降。重症贫血患者表现为呼吸困难和心功能失常。贫血通常与血液缺乏红血细胞或血红素(hemoglobin)有关。贫血常见源因包括缺乏铁、维生素B12和叶酸。贫血还可由慢性疾病(例如炎症，包括骨髓受炎症抑制造成的疾病等)发展而成。贫血还可由失血(例如由于事故、外科手术或药物如阿司匹林和布洛吩引起的肠胃出血)引起。连续的失血还见于月经周期严重失血的女性，以及胃溃疡十二指肠溃疡、痔疮或胃癌或肠癌等病人。各种情况可能破坏红血球(溶血)，从而导致贫血。例如，对细胞毒素的过敏反应和各种化学制剂(例如磺酰胺和苯)的过敏反应可导致溶血。溶血性贫血通常由化学性毒物、寄生虫、传染或镰状细胞贫血症引起。另外，还有一些非常见情况，由于机体产生自身红血球的抗体而导致溶血。骨髓疾病或损伤可导致贫血，因为骨髓是生成红血球(即红血球合成)的组织。射线辐照、疾病或各种化学制剂也可能导致骨髓破坏，产生再生障碍性贫血。进行化疗的癌症病人常患有再生障碍性贫血。贫血还与肾功能不全有关，贫血的程度与肾功能不全的程度高度相关。大多数进行肾透析的肾衰竭病人患有慢性贫血除了由肾脏产生以外，红细胞生成素还可由星形细胞和中枢神经系统(CNS)中的神经细胞产生，并且红细胞生成素和红细胞生成素受体表达在脑周边界面的毛细管上。此外，在大脑和脊椎局部失血、机械外伤、癫痫症、excitotoxins和神经炎症时，全身给药的红细胞生成素可穿过血-脑屏障并降低神经细胞的损失。美国国家科学学会会报(ProcNatlAcadSciUSA)98：4044-404)。在八十年代后期，Amgen介绍了一种经基因工程产生的红细胞生成素用于治疗慢性肾衰竭病人的贫血。还可将红细胞生成素给予待进行化疗和/或放疗的癌症病人，以降低对输血的需求。红细胞生成素可用于治疗与HIV感染或叠氮胸苷(AZT)治疗有关的贫血。尽管红细胞生成素治疗的市场扩大了，但是将来的销售受到产品高成本的不利影响。另外，重组红细胞生成素治疗需要每周1-3次静脉内给药红细胞生成素，治疗期长达12个星期，这是一种限制自己服药的治疗方案，使病人感到不方便。此外，由于在重组人体红细胞生成素中广泛的不同程度的糖基化作用不易重复，因此人体血清红细胞生成素的分子大小存在异质性性肾衰竭病人的贫血。还可将红细胞生成素给予待进行化疗和/或放疗的癌症病人，以降低对输血的需求。红细胞生成素可用于治疗与HIV感染或叠氮胸苷(AZT)治疗有关的贫血。促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作用来调节。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能剌激促红细胞生成素细胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间，因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制。虽然，二硫键是多肽和蛋白质一级结构的组成部分，但它在天然的情况下却是继蛋白质的二级、甚至三级结构形成之后形成的，二硫键修饰广泛存在于多肽蛋白质药物之中，对多肽和蛋白质的二级结构和三级结构具有重要影响。二硫键还原之后得到具有高反应活性的巯基，然后通过重建三碳桥的方法替代了二硫键对蛋白质结构的作用。实验证明，通过二硫键对多肽或者蛋白质进行定点修饰的方法，具有反应效率高、产物易于分离、多肽和蛋白质的生物活性满足临床使用等优点，具有广泛的应用前景技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的促红细胞生成素拟肽衍生物。本发明所涉及的非常见氨基酸如下表1：表1本发明涉及的非常见氨基酸一方面，本发明的目的是提供一种具有长效促红细胞生成功能的促红细胞生成素模拟肽衍生物。再一方面，本发明还提供了本发明促红细胞生成素模拟肽衍生物的制备方法以及其在用于制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。本发明所述序列如下：即EPO模拟肽单体通过二硫键形成二聚体，但是本发明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。优选地，所述制备方法还包括将制得的多肽的纯化，经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉的步骤；优选地，所述纯化使用HPLCC18半制备柱进行，流动相为乙腈。本发明还提供了所述促红细胞生成素模拟肽衍生物在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用。优选地，所述以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病选自末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。与现有技术相比,本专利涉及的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长药物在体内的半衰期。促红细胞生成素模拟肽衍生物和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1促红细胞生成素模拟肽衍生物的合成以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本发明的促红细胞生成素模拟肽衍生物为多肽，其制备可使用Fmoc固相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS336X型仪器进行本发明的多肽的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。其具体方法参见Fmocsolidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach,2000,OxfordUniversityPress。并通过氧化方法形成单体内二硫键，例如20％DMSO氧化法以及碘氧化法。将制得的多肽使用HPLCC18半制备柱进行纯化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。实施例2.促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠的作用采用小鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白对小鼠红细胞生成的影响。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，均为雌性小鼠，试验中各组动物数：10只，分为3组。其中，1组小鼠皮注射促红细胞生成素模拟肽衍生物，1组小鼠注射促红细胞生成素蛋白，1组小鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，剂量均为4.5mg/kg，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。结果如表2所示，发现促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们剌激红细胞生成(见表2)。表2促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠网织红细胞生成的影响名称剂量网织红细胞数目空白PBS缓冲液123.34±2.55衍生物4.5mg/kg658.32±2.15EPO4.5mg/kg532.32±2.63实施例4.促红细胞生成素模拟肽衍生物对大鼠的作用采用大鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白对大鼠红细胞生成的影响。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；SD大鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，均为雌性大鼠，试验中各组动物数：10只，分为3组。其中，1组大鼠皮注射促红细胞生成素模拟肽衍生物，1组大鼠注射促红细胞生成素蛋白，1组大鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，剂量均为4.5mg/kg，单次给药后，连续三天取血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数，并计算衍生物的长效性，结果发现衍生物1在单次给药后2周内依然具有刺激红细胞生成作用，结果见表3。表3促红细胞生成素模拟肽衍生物对大鼠网织红细胞生成的影响当前第1页1 2 3