一种快速检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种快速检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备。
背景技术：
：在男性不育患者中约有10％～15％是因为精子生成障碍所致的特发性无精子或少精子。引起特发性无精症(idiopathicazoospermia)、特发性严重少精症(idiopathicsevereoligozoospermia)、特发性少精症(idiopathicoligozoospermia)的原因极其复杂，遗传缺陷是其中的重要原因之一。1976年，Tiepolo等在细胞遗传学研究中发现无精症患者有Y染色体长臂的缺失，包括远端的荧光区和与之相连的非荧光区，因此推测Yq11存在着Y染色体精子生成基因或基因家族(azoosper-miafactor，AZF)的微缺失，称为“无精子因子”。目前资料报道，在无精子症和少精子症的患者中，有AZF缺失的约占3％～29％，发生率仅次于Klinefelter综合征(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。Y染色体上存在影响精子发生的无精子因子(AZF)区域，进一步可分为AZFa、AZFb、AZFc和AZFd四个区域。这些区域的缺失将导致精子发生障碍、少精、弱精、无精或畸精等症。第一类现有技术方案是PCR-琼脂糖凝胶电泳法(如CN101575647B，一种Y染色体微缺失的基因检测方法；CN200710074317.X，男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法；CN201210260960.2，一种Y染色体微缺失检测试剂盒；CN201510023696.4，一种Y染色体微缺失快速基因检测的扩增组合物、含有该扩增组合物的试剂盒及其应用)，此类方法有诸多不足之处，一是PCR结束后尚需开管电泳，不仅耗时长而且可能因污染导致假阴性结果；二是灵敏度较低易导致假阳性结果；三是操作繁琐不利于大规模样本检测。第二类现有技术方案是PCR-琼脂糖凝胶电泳法的升级版，以测序仪(CN201210439356.6Y，染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒)、毛细 管电泳(CN201410425722.1，一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒)、DHPLC(CN201310537372.3，检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法)等方法或仪器取代琼脂糖凝胶电泳，此几种方法虽然解决了琼脂糖凝胶电泳的灵敏度低、耗费人工等问题，但仍无法解决PCR后开管操作所带来的污染风险，另外测序仪、毛细管电泳系统或HPLC等仪器不仅价格昂贵，而且仪器操作和结果判读专业性要求较高，不易于推广。第三类现有技术方案是荧光定量PCR法，其中染料法(CN101701248A，Y染色体微缺失SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测试剂盒)的不足之处在于染料不具序列特异性，导致引物二聚体也会产生荧光以及只能单重PCR无法加入内标进行内部质控，同时一个PCR反应仅能检测一个位点导致多位点检测的工作量巨大；采用探针法的几个技术方案(CN102703578BY，染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒；CN201210323595.5，检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法；CN201410489611.7，一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒)的不足之处在于前期需另行提取基因组DNA，不仅增加了试剂成本及时间成本，而且提取过程中有因操作不当引起交叉污染或者样本混淆的风险。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种免提取基因组DNA、方便、快速、准确地检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。第一方面，本发明涉及一种检测人Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，包括样本处理液、至少一种PCR反应液，其中每种PCR反应液包括针对内标基因和至少一个不同的STS位点的引物和探针。第二方面，本发明涉及样本处理液和至少一种PCR反应液在制备检测人Y染色体AZF区微缺失的试剂盒中的用途，其中每种PCR反应液包括针对内标基因和至少一个不同的STS位点的引物和探针。在本发明的优选实施方案中，所述PCR反应液可以为1种、2种、3种、4种或更多种。在本发明的优选实施方案中，每种PCR反应液可以包含针对1个、2个、3个、4个或更多个不同的STS位点的引物和探针。在本发明的优选实施方案中，两种以上不同的PCR反应液中所包含的针对不同的STS位点的引物和探针可以自由组合。在本发明的优选实施方案中，两种以上不同的PCR反应液中所包含的针对不同的STS位点的引物和探针可以与针对不同内标的引物和探针自由组合。在本发明的优选实施方案中，所述样本处理液包括金属离子、Tris缓冲液和表面活性剂，优选地，所述样本处理液包括NaCl、Tris、TritonX-100、SDS，优选地，NaCl浓度为100nmol/L，Tris浓度为10mmol/L，TritonX-100体积浓度为1％，SDS质量浓度为10％。在本发明的另一优选实施方案中，所述PCR反应液包括的引物和探针分别针对AZFa、AZFb、AZFc、AZFd区的至少各2个STS位点，优选所述STS位点为AZFa区的sy84位点、sy86位点，AZFb区的sy127位点、sy134位点，AZFc区的sy254位点、sy255位点，AZFd区的sy145位点、sy152位点，优选所述内标基因分别为通用内标基因和性别内标基因，优选所述通用内标基因为β-actin基因或锌指蛋白基因(ZFX/ZFY)，优选所述性别内标基因为SRY基因。在本发明的另一优选实施方案中，所述PCR反应液包括PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4，所述PCR反应液1包括针对β-actin基因、sY84位点、sY86位点的引物和探针；所述PCR反应液2包括针对SRY基因、sY127位点、sY152位点的引物和探针；所述PCR反应液3包括针对SRY基因、sY134位点、sY254位点的引物和探针；所述PCR反应液4包括针对SRY基因、sY145位点、sY255位点的引物和探针。在本发明的另一优选实施方案中，所述引物的序列如序列表SEQIDNO:1-20所示；所述探针的序列如序列表SEQIDNO:21-30所示。在本发明的另一优选实施方案中，所述PCR反应液还包括：KCl、MgCl2、Tris、dNTPMixture，优选地，其中KCl浓度为50mmol/L，MgCl2浓度为1.5mmol/L，Tris浓度为10mmol/L，dNTP浓度为200μmol/L。在本发明的另一优选实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应酶，所述PCR反应酶优选为热启动Taq酶，浓度优选为5U/μL。在本发明的另一优选实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品优选为正常男性基因组DNA，浓度优选为10ng/μL；所述阴性对照品优选为正常女性基因组DNA，浓度优选为10ng/μL。第三方面，本发明涉及利用本发明的试剂盒检测人Y染色体AZF区微缺失的方法，包括以下步骤：1)采用样本处理液与全血直接混合的方式一步处理样本；2)利用特异性引物通过PCR反应分别检测AZF区中的STS位点。表1引物信息引物名称引物序列SRY-FAGATGCTGCCGAAGAATTGCSRY-RGTTGCACTTCGCTGCAGAGTACβ-actin-FTCGCCGATAGGATGCAGAAβ-actin-RAGGAGCAGTGATCTTGATCTTCATTsY84-FAGACATATAAGCTGATAGTCCTGGsY84-RAAGGGCCCATATGGGCACsY86-FCTCACTTTGCAGGACAGAGACTTGGsY86-RAGATGCTGTCTTCTCCCTGTGTCCTCsY127-FGAAAAAGATAGCACCCACTGGAsY127-RAAAAGAGAAGAAACTTTTTCATGsY134-FGGTCAAAGGAAATAAATAGATGGGGsY134-RGCACTTCAGAAACTTAGCsY254-FTGGAGGTTTAGAATTGCTTTTAGGTTsY254-RCCAGCAGCCCTTTGTCAAAsY255-FGGATTCGGCGTGATTTGGsY255-RAACGTCTGGCGGAATCCAsY145-FCAACACAAAAACACTCATATACTCGsY145-RTTGAGAATAATTGTATGTTACGGGsY152-FTGCCATGTTTCAGCTCTTTGAsY152-RTTCTGAGATTTGGTGTTCCTGTCTT表2探针信息探针名称探针序列SRY-PCy5-TTTGCTTCCCGCAGATCCCGC-BHQ3β-actin-PCy5-CCACCCTGGCGCCCAGCA-BHQ3sY84-PJOE-TGGCTCTACCTCCTTCCCCCAGTGC-BHQ1sY86-PFAM-AATCCCAAAGACTGGGCCCCTTAAACA-BHQ1sY127-PFAM-ATCTACCAAAGCCCACTGTGTTCATG-BHQ1sY134-PJOE-AACATCTGGAACATTCTACTTGAAGCG-BHQ1sY254-PFAM-CCCATAGGTACTAAAAAT-MGBsY255-PVIC-CTGCAGGTAGGTTTC-MGBsY145-PFAM-ACTCGACTTTTGGCTGGGCTGACTACC-BHQ1sY152-PVIC-AACAAAATTCATGCTGAAAC-MGB本发明的关键点和欲保护点在于：1，采用样本处理液与全血直接混合的方式一步处理样本；2，检测4个AZF区共计8个STS位点；采用β-actin、SRY作为通用内标基因和性别内标基因。本发明的优点：1，一步法处理样本，避免交叉污染以及操作失误导致的样 本混淆；2，除业内公认的3个AZF区(AZFa、AZFb、AZFc)的6个STS位点外，还新增加AZFd区的2个STS位点，可以为临床检测提供更多参考意义。可能的替代方案：1，样本处理液的主要成分为金属离子、Tris缓冲液和表面活性剂组成，可以被能够达到样本处理液的离子强度、缓冲效果和表面活性剂效果的其它试剂替换；2，内标的选择是本领域的普通技术知识，通用内标基因和性别内标基因可以被能够达到相同作用的其它基因替换；在保证每管必须有一个内标的前提下，本发明中所有STS位点与内标可自由组合；3，在所用荧光标记和配套荧光定量PCR仪的检测通道数允许的前提下，每管中STS位点数可根据实验需要调整，例如1个、2个、3个、4个或更多；4，本发明的多管PCR反应中，每管的多个位点的组合(含内标)，可以被能够达到相同作用的其它组合替换；5，所有的引物、探针序列可以被左右平移几个碱基或反向互补序列或反向互补序列左右平移几个碱基的序列替代；6，本发明中的所有成分的浓度值、pH值等，均可以被能够达到相同效果的其它值替换。附图说明图1A至图1E示出本发明实施例中不同样本的荧光定量PCR检测结果：图1A，正常男性样本；图1B，正常女性样本；图1C，AZFa、b、c、d区全缺失样本；图1D，AZFa区缺失样本；图1E，AZFb区缺失样本。具体实施方式在详细描述本发明的示例性实施方案之前，对理解本发明很重要的术语给出定义。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或其任何其它变体，旨在涵盖非排他性的包括。如本文所用，术语“扩增”及其变体包括用于产生多核苷酸的至少某一部分的多个拷贝或互补物的任何过程，所述多核苷酸通常被称作“模板”。模板多核苷酸可以是单链或双链的。给定模板的扩增可导致多核苷酸扩增产物群的产生，所述多核苷酸扩增产物群共同地被称作“扩增子”。扩增子的多核苷酸可以是单链或双链或两种的混合物。通常地，模板将包含靶序列，并且所产生的扩 增子将包含具有与靶序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，特定扩增子的多核苷酸彼此是基本上相同或基本上互补的；或者，在一些实施方案中，给定扩增子内的多核苷酸可具有彼此不同的核苷酸序列。扩增可以以线性或指数性的方式进行，并且可包括给定模板的重复和连续的复制以形成两个或更多个扩增产物。一些典型的扩增反应包括基于模板的核酸合成的连续和重复循环，导致多个子多核苷酸的形成，所述子多核苷酸包含模板的核苷酸序列的至少某一部分并且与模板享有至少某一程度的核苷酸序列同一性(或互补性)。在一些实施方案中，每一个核酸合成(其可被称作扩增的“循环”)包括引物退火和引物延伸步骤；任选地，还可包括其中模板被部分或完全变性的另外的变性步骤。在一些实施方案中，一个扩增回合包括单个扩增循环的给定的重复次数。例如，扩增回合可包括特定循环的5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或更多次重复。在一个示例性实施方案中，扩增包括其中特定多核苷酸模板经历两个连续的核酸合成循环的任何反应。合成可包括模板依赖性核酸合成。核酸合成的每一个循环任选地包括单个引物退火步骤和单个延伸步骤。在一些实施方案中，扩增包括等温扩增。如本文所用，“多重扩增”是指在同一个扩增反应内，对两个或两个以上靶序列的选择性和非随机扩增。在一些实施方案中，多重扩增是这样进行的，使得一些或所有的靶序列在单个反应容器内被扩增。如本文所用，“扩增条件”及其衍生词，通常是指适合扩增一个或多个核酸序列的条件。这样的扩增可以是线性的或指数的。在一些实施方案中，所述扩增条件可以包括等温条件或备选地可以包括热循环条件或等温和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适合扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链式反应(PCR)条件。典型地，所述扩增条件是指足以扩增核酸(如一个或多个靶序列)或扩增被连接至一个或多个接头的扩增的靶序列(例如，接头连接的扩增的靶序列)的反应混合物。通常，所述扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂(例如，聚合酶)、与要被扩增的所述核酸具有某种程度的互补性的引物和促进一旦与所述核酸杂交的引物的延伸的核苷酸(如脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs))。所述扩增条件可以需要引物与核酸的杂交或退火、所述引物的延伸和其中所延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离的变性步骤。典型地，但不是必须的，扩增条件可以包括热循环；在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环， 其中退火、延伸和分离步骤被重复。典型地，所述扩增条件包括阳离子(如Mg2+或Mn2+(例如，MgCl2等))并且还可以包括离子强度的各种改性剂。如本文所用，“靶序列”或“感兴趣的靶序列”或“目标序列”及其衍生词，通常是指可根据本公开内容被扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括疑似或预期存在于样品中的任何核酸序列。在一些实施方案中，所述靶序列以双链形式存在并且在加入靶特异性引物或所附接头之前包括要被扩增或合成的特定核苷酸序列的至少部分或其互补序列。靶序列可包括在扩增或合成反应中有用的引物可以在延伸之前通过聚合酶与其杂交的核酸。如本文所用，“样品”或“样本”及其衍生词，以其最广泛的含义使用并包括疑似包括靶标的任意标本、培养物等。在一些实施方案中，所述样品包含DNA、RNA、PNA、LNA、嵌合、杂交或多元形式的核酸。所述样品可以包括含有一个或多个核酸的任何基于生物学的、临床的、外科的、农学的、大气的或水生的标本。该术语还包括任意分离的核酸样品，如基因组DNA、新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋的核酸标本。如本文所用，术语“引物”及其衍生词通常是指能够与感兴趣的靶序列杂交的任意多核苷酸。在一些实施方案中，所述引物也可以用来引发核酸合成。典型地，所述引物作为核苷酸可以通过聚合酶被聚合到其上的底物发挥功能。所述引物包括核苷酸或其类似物的任意组合，其可以任选地被连接形成任意合适长度的线性聚合物。所述引物任选天然存在的，如在纯化的限制性酶消化物中，或可以被合成产生。在一些实施方案中，所述引物可以包括一个或多个核苷酸类似物。所述靶特异性引物的确切长度和/或组成(包括序列)可以影响多个性质，包括解链温度(Tm)、GC含量、二级结构的形成、重复的核苷酸基序、所预测的引物延伸产物的长度、跨感兴趣的核酸分子的覆盖程度、在单个扩增或合成反应中存在的引物的数目、在所述引物内核苷酸类似物或修饰的核苷酸的存在等。如本文所用，“特异性引物”及其衍生词，通常是指单链或双链多核苷酸，典型地是寡核苷酸，其包括与包括靶序列的核酸分子的至少部分至少50％互补、典型地至少75％互补或至少85％互补、更典型地至少90％互补、更典型地至少95％互补、更典型地至少98％或99％互补或相同的至少一个序列。在这样的情况下，所述靶特异性引物和靶序列被描述为“相应”于彼此。在一些实施方案 中，所述靶特异性引物能够与其相应的靶序列(或与所述靶序列的互补序列)的至少部分进行杂交；这样的杂交可以任选地在标准杂交条件下或在严格杂交条件下进行。如本文所用，“聚合酶”及其衍生词，通常是指能够催化核苷酸(包括其类似物)成为核酸链的聚合的任何酶。典型地但不是必须的，这样的核苷酸聚合可以模板依赖性的形式发生。这样的聚合酶可以包括但不限于天然存在的聚合酶及其保留催化这样的聚合的能力的任何亚基和截短形式、突变体聚合酶、变体聚合酶、重组体、融合或其它方式工程化的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组装体及其任何类似物、衍生物或片段。任选地，所述聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变体聚合酶，所述突变涉及一个或多个氨基酸置换为其它氨基酸、聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失、或两个或更多个聚合酶的部分的连接。典型地，所述聚合酶包含一个或多个活性位点，其中核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化可以发生。一些示例性的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶和RNA聚合酶。如本文所用，术语“聚合酶”及其变体，也是指包含互相连接的至少两部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸称为核酸链的聚合的肽并且与包括报告酶或增强持续合成能力的结构域的第二部分连接。任选地，所述聚合酶可以具有5'外切酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，所述聚合酶可以任选地被再活化，例如通过使用热、化学品或向反应混合物加入新的量的聚合酶。在一些实施方案中，所述聚合酶可以包括热启动聚合酶或基于适配体的聚合酶，其任选地可以被再活化。如本文所用，术语“核酸”是指天然核酸、人工核酸、其类似物或其组合，包括多核苷酸和寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中互换使用并意味着核苷酸的单链和双链聚合物，包括但不限于由核苷酸间的磷酸二酯键(例如3'-5'和2'-5')、反向键(例如3'-3'和5'-5')、支链结构连接的2'-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，或核酸类似物。多核苷酸具有相关联的抗衡离子，如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。寡核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。寡核苷酸可以由核碱基和糖类似物组成。多核苷酸大小典型地在从几个单体单元(例如5-40个)(当它们在现有技术中被更普遍经常称为寡核苷酸)到几千个单体核苷酸单元(当它们在现有技术中被更普遍称为多核苷酸)的范围内；但是，对于本公开内容 的目的来说，寡核苷酸和多核苷酸二者均可以是任何合适的长度。除非另外表示，否则每当表示寡核苷酸序列时，应理解的是所述核苷酸是以从左到右5'到3'的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷、“T”表示胸苷以及“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸之所以被认为具有“5'端”和“3'端”是因为单核苷酸典型地通过一个核苷酸的5'磷酸或等价基团被连接至它的相邻核苷酸的3'羟基或等价基团而反应形成寡核苷酸，任选地通过磷酸二酯键或其它合适的键。本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。以下是本发明的技术基础：a)利用缓冲液的理化特性处理样本主要研究内容包括：配制含有表面活性剂、一定离子强度以及酸碱度的溶液，一定体积的溶液与一定体积的全血混合，利用其理化特性可裂解全血中的体细胞并使基因组DNA释放，而且可去除全血中的PCR抑制剂的影响；b)利用已知的Y染色体AZF区微缺失的研究成果进行多重PCR的设计及实施主要研究内容包括：根据NCBI中关于Y染色体AZF区微缺失的研究文献和相关STS位点序列，设计特异性引物及不同荧光素标记的荧光探针；设计4管反应体系，每管反应体系分别检测2个STS位点以及1个内标基因。c)利用荧光定量PCR仪进行检测将4管反应体系分别加入处理的全血样本后，置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序，即可完成对样本的检测。实施例为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的。本领域技术人员能够清楚地设想本文列出的原理的进一步的修改。实施例1a)样本处理液的配制确定的样本处理液各组分如下：NaCl、Tris、TritonX-100、SDS，其中NaCl浓度为100nM，Tris浓度为10mM，TritonX-100浓度为1％，SDS浓度为10％，pH值为8.0；b)引物探针的设计在NCBI下载各基因或STS位点的序列，使用PrimerExpress3.0软件设计引物、探针，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成后，验证引物、探针的可用性。本试剂盒确定的引物探针见前表。c)反应体系的确定经过大量实验对比验证，确定的STS位点及内标组合及反应体系各组分浓度，见下表。表3反应体系位点组成荧光标记FAMJOE/VICCy5反应液1sY86sY84β-actin反应液2sY127sY152SRY反应液3sY254sY134SRY反应液4sY145sY255SRY表4反应体系各组分浓度d)反应条件的确定经过大量实验对比验证，本试剂盒确定的反应条件如下：表5反应条件实施例2本试剂盒的使用a)预期用途本产品用于定性检测男性全血样本中Y染色体无精子症因子(azoospermiafactor，AZF)区域是否存在缺失。可供选择的STS位点很多，业内一般认为每个区检测2个位点即可，本发明在每个AZF区选择最具代表性的2个位点，具体检测缺失位点为：对于业内公认的3个AZF区，AZFa：sy84、sy86；AZFb：sy127、sy134；AZFc：sy254、sy255；另外还新增加AZFd区的2个STS位点sy145、sy152，可以为临床检测提供更多参考意义。临床研究表明，Y染色体AZF区(AZFa,AZFb,AZFc,AZFd)不同程度的缺失可导致男性的少精症、无精症或精子畸形等症状，从而导致男性不育。本试剂盒的使用可协助对不孕不育患者的病因进行分析，检测结果可供临床参考， 但不能单独用做确诊或排除病例等临床诊断的依据。b)检测原理本试剂盒以Y染色体AZF区的8个STS位点为靶序列，设计特异性引物及荧光探针，配以耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分，采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，对每个待检样本进行4个三重PCR反应，每个PCR反应体系中含一个内标和两个位点的特异性引物和特异性探针，从而快速检测样本中Y染色体AZF区的8个位点是否缺失。c)试剂盒组成试剂盒各组分见下表：表6试剂盒组分d)储存条件及有效期-20±5℃以下保存，有效期12个月；2-8℃运输，72小时内送达实验室；冻融次数<5次。e)适用仪器RocheLightCycler480II、ABIPrism7500、Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪。f)样本要求i.适用样本类型EDTA抗凝全血ii.样本采集采用加有EDTA抗凝剂的真空采血管，采集患者血样2mL，立即颠倒混合后密封送检。iii.样本保存及运送样本可立即用于检测；或2-8℃保存，2周内检测；或-20℃保存，3个月内检测。2-8℃冷藏运输。g)检测方法i.样本处理取抗凝全血10μL置于1.5mL离心管中，加入200μL样本处理液，振荡混匀；ii.反应液配制阴性对照品、阳性对照品和待检样本DNA分别用4种PCR反应液进行检测，每种PCR反应液如下配制：取n×23μL(n为被检样本数、阴性对照和阳性对照总和)的PCR反应液，再加入n×0.3μL的PCR反应酶，振荡混匀后分装至PCR反应管，23μL/管。iii.加样向对应PCR反应管中分别加入2μL处理的样本或对照品，混匀后瞬时离心数秒。iv.PCR扩增将各反应管放入荧光PCR扩增仪的反应槽内，设置反应体系为25μL，按对应顺序设置对照品、样品名称。按表5反应程序进行PCR扩增。1.RocheLightCycler480II荧光设置：DetectionFormats选择3ColorHydrolysisProbe；2.ABIPrism7500荧光设置：报告基团选择FAM、JOE/VIC、Cy5，淬灭基团选择none；PassiveReference选项设为none；3.Bio-RadCFX96荧光设置：荧光基团选择FAM、VIC、Cy5。h)结果分析条件设定反应结束后仪器自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline(或Background)的Start值、End值以及Threshold值(Start值可设在3～10，End值可设在10～15，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准)。i)质量控制i.阴性对照品：阴性对照品反应液1的Cy5通道有S型扩增曲线且Ct值≤26，其余所有通道均Ct值＞28或无Ct值显示；ii.阳性对照品：阳性对照品4种反应液的所有通道均有S型扩增曲线且Ct值≤26；以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。iii.待检样本的反应液1的Cy5通道(β-actin)应呈S型扩增曲线且Ct值≤28。若某一样品不满足条件5.2.3，应重新处理该样本后再次检测。j)结果判定i.若待测样本的反应液2、3、4的SRY均无S型扩增曲线或Ct值＞28，建议该患者进行染色体核型检查；若某一反应液的SRY无S型扩增曲线或Ct值＞28，应使用此反应液复检；ii.若待测样本的sY127、sY134、sY152、sY254、sY255位点无明显S型扩增曲线或Ct值＞24，则判定相应位点缺失；iii.若待测样本的sY84、sY86、sY145位点无明显S型扩增曲线或Ct值＞28，则判定相应位点缺失；k)阳性判断值按照临床试验结果统计分析，本试剂盒sY127、sY134、sY152、sY254、sY255位点的阳性判断值为Ct值＞24；sY84、sY86、sY145位点的阳性判断值为Ct值＞28。l)检验结果的解释试验结果仅供临床参考，不作为治疗或其它临床管理的唯一依据；不合理的样本采集、转运及处理、样本中白细胞浓度过低均有可能导致假阴性结果；检测靶序列的变异会导致假阴性结果；未经验证的其它干扰因素，如操作失误等可能会导致假阴性结果。m)检验方法的局限性样本检测结果与样本收集、处理、运输及保存状况以及检测过程的交叉污染控制有关，如过程中出现失误易导致假阴性或假阳性结果。n)产品性能指标本试剂盒最低检测限为：10ng基因组DNA/test；精密度：CV≤5％；检测准确性为100％；高血红素、高脂血样本及过量抗凝剂对检测结果无干扰。o)检测结果图1A至图1E示出本发明实施例中不同样本的荧光定量PCR检测结果：图1A，正常男性样本；图1B，正常女性样本；图1C，AZFa、b、c、d区全缺失样本；图1D，AZFa区缺失样本；图1E，AZFb区缺失样本。其中相应AZF区的缺失通过操作反应仪器的配套软件来确定。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3