本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种棉花启动子GbU6-5PS及应用。
背景技术：
基因组编辑技术是一种研究基因功能的重要工具，它能精确修饰受体细胞染色体特定位点的基因，可以高效产生特定基因的功能失活突变体，能为生物功能基因组研究提供优质的遗传材料。所以该技术自诞生以来，就受到广大生物学家的青睐。II型CRISPR/Cas9基因组编辑系统是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)之后，另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术。sgRNA和Cas9是该技术系统的两个必要元件，其中sgRNA在CRISPR/Cas9基因组编辑过程中起到靶向结合目的基因位点的功能。在CRISPR/Cas9技术系统中，sgRNA的转录通常由U6启动子驱动完成，因为其转录活性相对较高，而且都有着明确的转录起始位点，精确起始转录具有靶向功能的sgRNA能消除无关DNA序列的转录，从而大大减少脱靶效应的产生。
U6启动子虽然具有高效转录的特点，但是它在同源关系较远的不同物种之间不一定适用，而且同一物种基因组中存在多个U6启动子，这些启动子的转录效率也不相同。另外由于Cas9基因巨大(大于4000bp)，而且驱动Cas9基因表达的35S启动子长度也在1000bp左右，这两个片段上分布着绝大多数常用的限制性内切酶位点。因此在构建sgRNA和Cas9共表达载体时，可用于sgRNA重组片段连接的酶切位点非常少。所以这就要求U6启动子上不能再出现这些酶切位点，而只有更短的片段才有可能满足这个要求。因此克隆的U6启动子片段越短越便于CRISPR/Cas9载体的构建。
棉花是我国重要的经济作物和纺织工业原料。其基因组中至少有10种U6启动子。克隆适用于棉花CRISPR/Cas9基因组编辑技术系统的、高转录效率的、短片段的U6启动子，对于利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行棉花分子育种具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种棉花启动子GbU6-5PS及其制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述棉花启动子GbU6-5PS的应用。
本发明的再一目的在于提供包含上述棉花启动子GbU6-5PS的表达载体及应用。
本发明是这样实现的，一种棉花启动子GbU6-5PS，该启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该启动子互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的棉花启动子GbU6-5PS由105个核苷酸组成，含有USE和TATA作用元件。
或者在严格条件下与上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
或者与上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
优选的，所述严格条件为：在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
本发明进一步提供了上述棉花启动子GbU6-5PS的制备方法，该方法包括以下步骤：
第一步进行第一轮PCR扩增获得覆盖全长GbU6-5启动子序列的片段，第一轮PCR的程序为：94℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环，然后72℃10min；最后克隆测序验证，正确的克隆质粒被命名为GbU6-5P。
所用引物为：GbU6-5PF:CCGAAGCCAAAGCTCACAAT；
GbU6-5PR:ACAGACCGAACCCAGTAAAC；
第二步进行第二轮PCR扩增，以GbU6-5P为供体质粒模板，以AtU6-26SK为受体质粒模板，采用Transfer PCR方法对GbU6-5P启动子进行截短克隆，获得的截短启动子被命名为GbU6-5PS，其中，Transfer PCR的程序为：95℃1min；95℃30s，60℃1min，72℃40s，13个循环；95℃30s，67℃1min，72℃4min，20个循环；72℃8min；所用引物：
T-GbU6-5PS F:CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAAGGACGTGGTAGCATACTTC；
T-GbU6-5PS R:CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC。
本发明进一步提供了上述棉花启动子GbU6-5PS在驱动GUS基因转录方面的应用。
优选的，所述棉花启动子GbU6-5PS的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动GUS基因转录方面的应用。
优选的，所述棉花启动子GbU6-5PS驱动GUS基因在棉花花粉中的高效转录。
本发明进一步提供了一种GUS融合表达载体，该表达载体是通过将所述棉花启动子GbU6-5PS与GUS基因连接后，克隆至植物表达载体制备得到。
优选的，所述植物表达载体为pCAMBIA 1300。
本发明进一步提供了上述GUS融合表达载体在驱动GUS基因转录方面的应用。
U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件。本发明提供了一种棉花启动子GbU6-5PS及应用。在本发明中，将已经克隆获得的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1787bp)(参考文献：雷建峰，伍娟，陈晓俊，於添平，倪志勇，李月，张巨松，刘晓东.棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析.中国农业科学,2015,48(19):3794-3802.)，采用Transfer PCR方法成功地截短出105bp长的棉花启动子GbU6-5PS，并构建启动子驱动的GUS融合表达载体GbU6-5PS::GUS-P1300。将构建好的GbU6-5PS::GUS-P1300与阳性对照CaMV35S::GUS-P1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转化棉花花粉。经GUS组织化学染色显示：克隆得到的105bp的棉花启动子GbU6-5PS能驱动GUS基因在棉花花粉中转录，棉花花粉被染成显著深蓝色。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明的棉花启动子GbU6-5PS不仅适合用于棉花，而且片段很短，长度只有105bp，符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求，能显著提高sgRNA的转录水平，进而可能提高基因组编辑效率。
附图说明
图1是本发明实施例中GbU6-5P启动子的第一轮PCR扩增结果图；
图2是本发明实施例中棉花启动子GbU6-5PS的Transfer PCR扩增结果图；
图3是本发明实施例中棉花启动子GbU6-5PS驱动GUS在棉花花粉中的瞬时表达结果图，参见附图3A所示，图B、C分别是阳性对照CaMV35S强启动子驱动GUS基因表达和阴性对照pCAMBIA 1300转化花粉染色的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、试验材料
试验所用AtU6-26SK(参考文献：Feng Z Y,Zhang B,DingW,LiuX D,Yang D L,Wei P,Cao F,Zhu S,Zhang F,Mao Y,Zhu J K.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.Cell Research,2013,23(10):1229-1232.)、pBI101载体、农杆菌GV3101、棉花品种新海16均为新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存。
各种限制性内切酶购于Fermentas公司；T4DNA连接酶、Blunt Zero平端载体、Trans1-T1感受态细胞、胶回收试剂盒、Taq DNA Polymerase、RNase A、KD Plus DNA Polymerase、1Kb Plus DNA Ladder均购自于北京全式金生物技术有限公司；Phusion超保真DNA聚合酶购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司；其它常规试剂均为国产分析纯；引物合成及测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。
2、GbU6-5PS启动子的克隆
(1)第一轮PCR
通过PCR扩增(参考文献：雷建峰，伍娟，陈晓俊，於添平，倪志勇，李月，张巨松，刘晓东.棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析.中国农业科学,2015,48(19):3794-3802.)。获得棉花品种新海16覆盖全长GbU6-5启动子序列的片段，PCR的程序为：94℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环，然后72℃10min；最后克隆测序验证，正确的克隆质粒被命名为GbU6-5P；所用引物为GbU6-5P F:CCGAAGCCAAAGCTCACAAT；GbU6-5P R:ACAGACCGAACCCAGTAAAC。克隆结果如图1所示。
(2)第二轮PCR
本发明第二轮PCR是精确克隆截短的棉花启动子GbU6-5PS，以第一轮PCR克隆的GbU6-5P启动子质粒为供体质粒模板，以拟南芥AtU6-26SK的质粒为受体质粒模板进行由两轮PCR组成的Transfer PCR(参考文献：Erijman A,Shifman J M,Peleg Y.A single-tube assembly of DNA using the transfer-PCR(TPCR)platform.Methods in Molecular Biology,2014,1116:89-101.)，对GbU6-5P启动子进行截短。
根据已克隆的GbU6-5P启动子序列和AtU6-26SK载体序列设计棉花启动子GbU6-5PS的Transfer PCR引物：
T-GbU6-5PS F:CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAAGGACGTGGTAGCATACTTC；
T-GbU6-5PS R:CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC。
以GbU6-5P为供体质粒模板，以AtU6-26SK为受体质粒模板，采用Transfer PCR方法对GbU6-5P启动子进行截短克隆，获得的截短启动子被命名为GbU6-5PS，其中，Transfer PCR的程序为：95℃1min；95℃30s，60℃1min，72℃40s，13个循环；95℃30s，67℃1min，72℃4min，20个循环；72℃8min；PCR产物电泳结果如图2所示。
取酶切产物10μL转化Trans1-T1感受态细胞。对初步获得的截短的质粒采用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定。以上截短的启动子质粒经BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定与预期目标片段大小相符(图略)。
酶切正确的质粒进行测序验证，经测序比对为预期的截短GbU6-5PS启动子，GbU6-5PS启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该启动子互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示测定序列。。
3、GUS融合表达载体GbU6-5PS::GUS-P1300的构建
将已克隆的GUS基因经BbsⅠ酶切，并与同样酶切后的GbU6-5PS质粒连接、转化，挑单克隆进行菌落PCR初步鉴定和酶切鉴定。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pCAMBIA 1300和构建好的GbU6-5PS::GUS的融合表达载体，分别回收目标片段，T4DNA连接酶4℃连接过夜。转化，提质粒。
再用HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆，将酶切鉴定正确的质粒命名为：GbU6-5PS::GUS-P1300质粒。
经酶切鉴定正确后，转入农杆菌感受态GV3101，28℃倒置培养两天，挑取阳性克隆于LB培养基(含50μg·mL-1kan和25μg·mL-1Rif)培养至对数生长期，用于下一步侵染。
4、农杆菌真空渗透转化棉花花粉
将构建好的GbU6-5PS::GUS-P1300以及阳性对照CaMV35S::GUS和阴性对照pCAMBIA1300空载体的农杆菌按1:100比例接种于LB培养基(含50g·mL-1kan和25g·mL-1Rif)中活化。28℃，180rpm摇菌，摇至菌液的OD600＝0.6-1.2时，分别吸取不同体积的活化菌液接种到6mL LB培养基(含50μg·mL-1kan和25μg·mL-1Rif)中，使得每个处理起始OD值相同，再次28℃，180rpm摇菌，统一摇至菌液的OD600＝1.6时，12000rpm离心5min收集菌体，弃上清液，重悬于花粉萌发培养基(参考文献：张燕红,黄乐平,周小云,王冬梅.农杆菌真空渗透法转化棉花花粉的初步研究.棉花学报,2008,05:354-358.)中(0.1％H3BO3、0.3％Ca(NO3)2、0.2％MgSO4·7H2O、0.1％KNO3、45％蔗糖)，收集新鲜棉花花粉，等量分成多份。每份各加入上述不同的农杆菌重悬液，并在-0.05MPa压力下抽真空30min。每种农杆菌转化进行技术重复三次，生物学重复两次。
5、GbU6-5PS::GUS在棉花花粉中的瞬时表达分析
将抽完真空后的棉花花粉悬浮液100rpm离心1min，弃上清液，收集转化后的花粉，并用蒸馏水漂洗4-5次，除去农杆菌。加入适量的GUS染液(0.5mol·L-1磷酸缓冲液，pH 7.0；0.5mol·L-1EDTA，pH 8.0；10％Triton X-100；20mmol·L-1X-Gluc)，37℃，180rpm震荡染色3～4h，100rpm离心5min，吸取上清GUS染液保留备用。用蒸馏水漂洗转化后的花粉4～5次，100rpm离心5min确保去除残留的GUS染液。收集的花粉在体式显微镜下观察拍照。同时取处理转化后GUS染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值。
通过GUS组织化学染色发现：截短的棉花启动子GbU6-5PS能驱动GUS基因的表达，棉花花粉被染成蓝色且染色相对较深，接近于阳性对照，而阴性对照pCAMBIA1300转化的花粉未被染蓝色(如图3所示)。
6、结论
本发明的棉花启动子GbU6-5PS不仅适合用于棉花，而且片段很短，长度只有105bp，符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求，能显著提高sgRNA的转录水平，进而可能提高基因组编辑效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。