本发明属于环保和新技术能源领域，具体涉及一种以布朗葡萄藻生产高品质生物柴油原料的方法。
背景技术：
微藻生物柴油作为石化柴油的替代品，就应该满足石化柴油的使用要求，即其理化性质应该与石化柴油接近，才能保证其燃料特性。衡量生物柴油性质的指标主要包括：密度、运动黏度、闪点、馏程、低温性能、残炭、灰分、十六烷值、甲醇含量、脂含量、磷含量、甘油含量、碘值和游离脂肪酸等，其中以十六烷值来评价生物柴油的燃烧性能。燃烧性能是生物柴油最重要的品质之一，而十六烷值主要是受原料的影响。此外，生物柴油生产原料中不饱和脂肪酸的种类和数量很大程度上决定了生物柴油产品的氧化稳定性。然而，微藻在培养的过程中，其脂肪酸含量和分布容易随环境条件改变而发生变化。如在一般的生长条件下，微藻积累的油脂相对较少，而在环境胁迫条件下，油脂的积累则可成倍增长。影响微藻油脂含量的因素有很多，例如化学因素、物理因素以及微藻自身的不同生长阶段等。目前，国内外对微藻生物柴油研究，主要集中在如何提高油脂含量和如何将油脂催化转化成生物柴油上，而在微藻的培养阶段，如何在提高油脂含量的基础上，同时也能改善油脂的品质方面几乎成为空白。
因此，如何从微藻的培养环境和工艺方面着手，设计一种以布朗葡萄藻生产高品质生物柴油的原料方法，即成为本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，以克服现有技术中微藻生物油脂含量低的缺陷。
本发明的目的是这样实现的，一种以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将无菌布朗葡萄藻种子接种于密闭的光生物反应器中进行扩大再培养；光源为led灯或荧光灯，光质为白光或蓝光，光照强度为8-10klux；种子培养基成分为：海盐24-34g/l，ch3coona0.3-0.5g/l，nano3200-300mg/l，nah2po450-100mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，维生素b10.006-0.06mg/l，维生素b20.00005-0.0005mg/l；培养初始ph为6.0-8.0，通气强度为0.2-0.7vvm，co2浓度为0-0.5％，培养温度为23-26℃，培养6-8天，直到细胞生长到对数期；
(2)对步骤(1)产出的布朗葡萄藻种子进行收集；
(3)在开发式光生物反应器中对步骤(2)收集的布朗葡萄藻种子进行光自养培养；光源为led灯或荧光灯，光照强度为8-10klux，光质为白光或蓝光；光自养培养基成分为：海盐28-34g/l，nano3350-550mg/l，nah2po430-80mg/l，na2edta10-30mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.03-0.06mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.05mg/l，mncl2·4h2o0.2-0.6mg/l，na2moo4·2h2o0.1-0.3mg/l，维生素b10.006-0.06mg/l，维生素b20.00005-0.0005mg/l，生物素0.00005-0.0005mg/l，其中氮磷元素之比为15-25；培养初始ph为6.0-8.0，通气强度为0.5-1.0vvm，co2浓度为1.0-2.0％，培养温度为22-30℃；
(4)对步骤(3)生产的布朗葡萄藻进行采收；以及
(5)破碎步骤(4)所得到的布朗葡萄藻细胞，进行油脂提取。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤(2)中，优选采用离心或气浮的采集技术进行种子收集。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤(3)中，光自养培养的接种密度优选为1.0×107-2.0×107个/l。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤(4)中，优选以离心、化学絮凝或气浮采收藻液，得到藻泥。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述化学絮凝优选使用硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝或壳聚糖作为化学絮凝剂。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤 (5)中，优选采用酶法、超声法或液氮法破碎布朗葡萄藻细胞。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述酶法使用的酶优选包括纤维素酶、中心蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、破壁酶、蜗牛酶和脂肪酶中的一种或者几种。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤(5)中，优选采用有机萃取法进行常温油脂提取，有机溶剂优选为等体积比例的氯仿、甲醇和水，或者等体积比例的乙醚、正己烷和水。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，优选的是，还包括：
步骤(6)对萃取出来的油脂的含量进行气相色谱-质谱分析；
步骤(7)对萃取出来的油脂的燃烧性能进行评价。
本发明所述的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，其中，所述步骤(7)中，燃烧性能评价优选以十六烷值来评价。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种以布朗葡萄藻生产高品质生物柴油原料的方法，其中以普通布朗葡萄藻为藻种，采用较温和的光照和光质、充足的营养及适宜的氮磷比、和适宜的温度等条件，促进微藻细胞的快速生长、油脂的积累和油脂品质的稳定和改善；
本发明不仅能够提高布朗葡萄藻油脂的产量，还能有效的改善油脂的品质，最终得到藻细胞的油脂含量在30％以上，cn值稳定在50以上，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例在1.5-2.5，本发明从源头原料上有效的调节了生物柴油的产量和品质，满足了微藻生物柴油工业化的应用化要求，是一种较好的生产高品质微藻生物柴油的方法。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
本发明提供的以布朗葡萄藻生产生物柴油原料的方法，还可以具体表述如下：
(1)种子培养
将装有普通布朗葡萄藻的三角摇瓶接种至无菌光生物反应器，在已灭好菌培养基中光照培养；光生物反应器系鼓泡式密闭反应器，包括co2储气瓶、混气装置和气体流量计；种子培养基及培养条件如下：海盐24-34g/l，ch3coona0.3-0.5g/l，nano3200-300mg/l，nah2po450-100mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，vitaminb10.006-0.06mg/l，vitaminb20.00005-0.0005mg/l，光源采用荧光灯或led，光照强度为8-10klux，光质为白光或蓝光，初始ph为6.0-8.0，通气强度为0.2-0.7vvm，co2浓度为0-0.5％，培养温度为23-26℃，培养6-8天，直到对数期，收集种子准备下一阶段发酵。
(2)种子收集
细胞收集采用离心或气浮等采集技术，以离心为例，在转速为4000-12000rmp情况下，常温下离心1-10min，得到藻泥后，并用清水清洗2-3次，再在相同条件下，离心得到的藻泥，然后，用少量的清水均匀重悬，即为后续培养的种子。
(3)光自养培养
将准备好的种子接到装有培养基的光生物反应器中，该反应器为室内开放式系统，包括co2储气瓶、混气装置和气体流量计；该培养阶段的培养基及培养条件如下：海盐28-34g/l，nano3350-550mg/l，nah2po430-80mg/l，na2edta10-30mg/l，feso4·7h2o2.5-5.0mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.03-0.06mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.05mg/l，mncl2·4h2o0.2-0.6mg/l，na2moo4·2h2o0.1-0.3mg/l，vitaminb10.006-0.06mg/l，vitaminb20.00005-0.0005mg/l，生物素0.00005-0.0005mg/l，其中氮磷元素之比为15-25，光源采用荧光灯或led灯，其光照强度为8-10klux，光质为白光或蓝光，初始ph为6.0-8.0，通气强度为0.5-1.0vvm，co2浓度为1.0-2.0％，培养温度为22-30℃。
(4)微藻采收
采收可采用离心、化学絮凝和气浮等，以化学絮凝为例，絮凝剂采用硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝、壳聚糖等，将培养好的藻液收集在容器中，并向容器中按藻液比例加一定剂量的絮凝剂，如向藻液中加于fecl320-80mg/l，待絮凝完全，倾去上层水层，得到藻泥。
(5)油脂提取
采用先破碎后提取的办法，破碎可采用酶法破碎、超声破碎和液氮破碎，其中酶法破碎的的酶涉及纤维素酶、中心蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、破壁酶、蜗牛酶和脂肪酶，酶法中以纤维素酶和蛋白酶共同破碎效果最好，在以上所有的破碎中，以液氮法和酶法效果最好；油脂提取采用有机萃取法，采用氯仿/甲醇/水(体积比1：1：1)或乙醚/正己烷/水(体积比1：1：1)体系常温萃取。
(6)油脂分析
油脂采用gc-ms进行分析，取一定量的油脂加于2ml离心管中，再依次加于1.5ml的正己烷和0.2ml的0.4mol/l氢氧化钾甲醇溶液；摇匀，静置10分钟左右；取上清液0.5ml到1.5ml的离心管中，同时加入0.3ml的去离子水，摇匀后，再在4500rmp条件下，离心3min；最后，取适量上层正己烷层，用色谱纯的正己烷进行稀释，并加入无水硫酸钠，预处理结束，准备进样。色谱条件：thermofinnigantracedsq型气相色谱-质谱联用仪，采用db-5ms毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。起始柱温50℃,以20℃/min升温到250℃,保持2min。进样温度200℃,载气为氦气，载气流速1ml/min，不分流进样。总运行时间为12min。萃取头在进样口于200℃下脱附5min。质谱检测条件：ei源70ev，离子源温度250℃，传输线温度250℃，扫描范围50～400aum。
(7)燃烧性能评价
燃烧性能以十六烷值(cn)来评价生物柴油的燃烧性能，cn值采用lapuertaetal.(2009)andtongetal.(2010)所提到的模型进行评估，评估模型如下:
对于饱和脂肪酸：
cn＝-107.71+31.126n-2.042n2+0.0499n3
对于单不饱和脂肪酸：
cn＝109-9.292n+0.354n2
对于多不饱和脂肪酸：
cn＝-21.157+(7.965-1.785db+0.235db2)n-0.099n2
对于混合脂肪酸体系：
cn＝1.068∑(cnimi)-6.747
其中，n代表脂肪酸的碳原子数量数，db代表双键的数量。
此外，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例也是一个考核指标，代表生物柴油的氧化稳定性。
本发明方法中所用培养基的溶剂未明确标示时均采用去离子水作为溶剂。
本发明方法中ph调节方式：用1mol/l的硫酸和2mol/l的氢氧化钠调节ph。
本发明不仅能够提高油脂的产量，还能有效的改善油脂的品质，最终得到藻细胞的油脂含量在30％以上，cn值稳定在50以上，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例在1.5-2.5，该发明从源头原料上有效的调节了生物柴油的产量和品质，满足了微藻生物柴油工业化的应用化要求，是一种较好的生产高品质微藻生物柴油的方法。
本发明提出一种布朗葡萄藻生产高品质生物柴油的方法，通过引入十六烷值，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比例等表征生物柴油品质的指标，来培养开始调控藻体的含油量和高油脂品质的藻体细胞，从未生产高质高量的生物柴油打下坚实的基础，为了更好的理解本发明，特举实施例如下：
实施例1：
(1)将装有普通布朗葡萄藻的三角摇瓶接种至无菌光生物反应器，在已灭好菌培养基中光照培养；光生物反应器系鼓泡式密闭反应器，包括co2储气瓶、混气装置和气体流量计；种子培养基及培养条件如下：海盐24g/l，ch3coona0.3g/l，nano3200mg/l，nah2po450mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5mg/l，vitaminb10.006mg/l，vitaminb20.00005mg/l，光源采用荧光灯，光照强度为8klux，光质为白光，初始ph为6.0，通气强度为0.2vvm，co2浓度为0.1％，培养温度为23℃，培养8天，直到对数期，收集种子准备下一阶段发酵。
(2)细胞收集采用离心采集技术，在转速为4000rmp情况下，常温下离心10min，得到藻泥后，并用清水清洗3次，再在相同条件下，离心得到的藻泥，然后，用少量的清水均匀重悬，即为后续培养的种子。
(3)将准备好的种子接到装有培养基的光生物反应器中，该反应器为室内开放式系统，包括co2储气瓶、混气装置和气体流量计；该培养阶段的培养基为：海盐28g/l，nano3400mg/l，nah2po440mg/l，na2edta10mg/l，feso4·7h2o2.5mg/l，cuso4·5h2o0.01mg/l，znso4·7h2o0.04mg/l，cocl2·6h2o0.02mg/l，mncl2·4h2o0.3mg/l，na2moo4·2h2o0.2mg/l，vitaminb10.01mg/l，vitaminb20.0005mg/l，生物素0.0005mg/l，其中氮磷元素之比为20；
光自养培养条件：光质为白光，光照强度为9klux，初始ph为6.5，通气强度为0.6vvm，co2浓度为1.5％，培养温度为25℃。
培养7天后，以硫酸铁为絮凝剂进行絮凝，用超声法超生1h进行破碎，以等体积比例的氯仿、甲醇和水为有机溶剂进行萃取。
对萃取出来的油脂的含量进行气相色谱-质谱分析和燃烧性能评价，油脂含量达到35％，cn值为52.0。
实施例2：
步骤同实施例1，但是光自养培养条件为：光质为蓝光，光照强度为9klux，初始ph为6.5，通气强度为0.6vvm，co2浓度为1.5％，培养温度为25℃。油脂含量达到36％，cn值为53.0。
实施例3：
步骤同实施例1，但是光自养培养条件为：光质为白光，光照强度为10klux，初始ph为7.5，通气强度为1.0vvm，co2浓度为2.0％，培养温度为24℃。油脂含量达到42％，cn值为55.0。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种以布朗葡萄藻生产高品质生物柴油原料的方法，其中以普通布朗葡萄藻为藻种，采用较温和的光照和光质、充足的营养及适宜的氮磷比、和适宜的温度等条件，促进微藻细胞的快速生长、油脂的积累和油脂品质的稳定和改善；
本发明不仅能够提高布朗葡萄藻油脂的产量，还能有效的改善油脂的品 质，最终得到藻细胞的油脂含量在30％以上，cn值稳定在50以上，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例在1.5-2.5，本发明从源头原料上有效的调节了生物柴油的产量和品质，满足了微藻生物柴油工业化的应用化要求，是一种较好的生产高品质微藻生物柴油的方法。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。