一种生物柴油原料油的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和可再生能源技术领域，更具体的说，涉及一种生物柴油原 料油的生产方法。
【背景技术】
[0002] 生物柴油又称为生质柴油，是用未加工过的或者使用过的植物油、动物脂肪、餐饮 垃圾油等为原料油，通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。随着化石 燃料的逐渐枯竭以及环境问题的不断恶化，作为清洁环保的可再生能源，生物柴油受到越 来越多的关注。
[0003] 现目前，主要用来制作生物柴油的原料包括植物油下脚料，城市地沟油、泔水油， 微藻油等，植物油下脚料及城市地沟油、泔水油等废弃油脂用作生物柴油的原料油来制取 生物柴油的方式大大减少了对环境及人类健康的危害，同时又可以变废为宝，但是，植物油 下脚料这种作为生物柴油的原料油资源总量有限，远远不能满足生物柴油产业快速发展对 原料的需要；城市地沟油、泔水油油脂资源成分复杂，来源不稳定，导致以其为原料生产的 生物柴油产品质量不稳定；通过微藻来获取生物柴油的方法具有较大的发展潜力，因为其 清洁而又环保的生产技术被大家广泛关注，但是现阶段由于其生长周期长达5~10天，生 物量也仅能达到20-100克每升，含油量约为20%~50%，且发酵过程中需要维持光照和通 入二氧化碳，从而致使生产成本大大增加。因此研究、开发和利用新型生物柴油原料油资 源，是生物柴油产业发展所面临的核心问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于，提供一种生物柴油原料油的生产方法，克服了 裂殖壶菌只能用于生产多不饱和脂肪酸的问题。
[0005] 本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种生物柴油原料油的生产方法，克服 了现有发酵工艺生产生物柴油原料油的周期长、产量低、工艺复杂等缺点。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案在于：提供一种生物柴油原料油的生产方 法，所述方法使用裂殖壶菌经过发酵培养生产油脂，得到的所述油脂中饱和脂肪酸大于 50%〇
[0007] 在本发明的方法中，得到的所述油脂中饱和脂肪酸大于70%。
[0008] 在本发明的方法中，所述方法包括以下步骤：
[0009]S1、将裂殖壶菌的菌种使用种子培养基培养成种子液；
[0010]S2、将种子液按照体积百分比3%~10%接入发酵培养基中进行培养，培养温度 28°C至40°C，通气3m3/h~15m3/h并保持搅拌；
[0011] S3、发酵培养20h~24h后，控制发酵温度在30°C~40°C，通气8m3/h~16m3/h， 发酵过程中流加补充碳源、氮源；
[0012] S4、发酵培养80h~120h后，收集菌体。
[0013] 在本发明的方法中，所述步骤SI中使用的种子培养基包括：葡萄糖40.Og/L~ 60.Og/L，酵母粉 5.Og/L~10.Og/L，蛋白胨I.Og/L~5.Og/L，硫酸镁 0. 5g/L~2.Og/L，碳 酸氢 1丐 0. 2g/L~I. 0g/L，磷酸二氢钾I. 0g/L~3. 0g/L，氯化钠I. 0g/L~5. 0g/L。
[0014] 在本发明的方法中，所述步骤SI中所述种子液的培养条件为：向种子培养基中 接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为2%~5%，在摇床转速180rpm~300rpm、培养温度 32°C~35°C的条件下进行摇瓶培养20h~24h，获得种子液。
[0015] 在本发明的方法中，所述步骤S2中使用的发酵培养基包括：葡萄糖80. 0g/L~ 150. 0g/L，玉米浆 10. 0g/L~30. 0g/L，谷氨酸钠 8. 0g/L~20. 0g/L，硫酸镁 0? 5g/L~3.Og/ L，碳酸氢|丐I. 0g/L~5. 0g/L，磷酸二氢钾I. 0g/L~3. 0g/L，硝酸钠 5. 0g/L~10. 0g/L。
[0016] 在本发明的方法中，所述步骤S3中流加补充的所述碳源为葡萄糖和/或糖蜜，流 加补充的所述氮源为玉米浆和/或谷氨酸钠，维持发酵液中碳源浓度为20. 0g/L~50.Og/ L，氮源浓度为3. 0g/L~5. 0g/L。
[0017] 在本发明的方法中，所述培养温度为30°C至35°C，通气速度为IOm3A~12m3/h。
[0018] 在本发明的方法中，所述步骤S4中收集菌体的方式包括：自然沉降、离心、膜分离 中的任意一种及其组合。
[0019] 实施本发明的有益效果在于，发酵过程中不需要光照和通入二氧化碳，只需控制 发酵温度、通气条件并流加补料，使其在3~5天的发酵周期内，生物量可达120g/L~ 150g/L，油脂含量超过75 %，具有效率高，生产成本低，且易于工业化生产等优点。
【具体实施方式】
[0020] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0021] 生物柴油作为一种清洁环保的可再生能源，受到越来越多的关注，但是受制于原 料油的来源和价格，生物柴油的应用推广进度缓慢，因为植物油下脚料、地沟油、泔水油等 不仅制得的生物柴油产品质量不稳定，而且回收油的资源总量有限，远远不能满足生物柴 油产业快速发展对原料的需要。发酵培养微藻可以连续大量的提供生物柴油原料油，但是 其高昂的成本使得根本无法商业化使用。本发明的主要创新点在于：使用裂殖壶菌作为培 养菌种，通过综合优化培养基和培养条件，能在较短的发酵周期内获得较高的生物量，油脂 含量高，且获得的油脂种类以饱和脂肪酸为主，克服现有工艺都使用裂殖壶菌生产不饱和 脂肪酸的问题，裂殖壶菌在发酵培养过程无需光照和通入二氧化碳，培养工艺简单。
[0022] 本发明生物柴油原料油的生产方法，使用裂殖壶菌经过发酵培养生产油脂，得到 的所述油脂中饱和脂肪酸大于50%。优选的，得到的油脂中饱和脂肪酸大于70%。裂殖 壶菌（Schizochytriumsp),为富含油脂的大型海洋真菌,被广泛的应用于生产多不饱和脂 肪酸例如二十二碳六烯酸（DHA)等，但是以生产多不饱和脂肪酸为目的的发酵培养过程其 生物量不高，一般为30-80克每升，油脂含量40 % -50 %，不饱和脂肪酸含量占所得油脂的 60%以上，目标产物如DHA含量占所得油脂的20-50%。这样的发酵工艺控制过程，虽然由 于DHA的价格较高可以获得较好的经济价值，但是总油脂得率不高使其无法作为生产生物 柴油原料油的方法。本发明通过优化培养基和发酵培养的控制条件，使得发酵周期缩短、发 酵成本降低的同时，产物中不饱和脂肪酸的含量大大降低，饱和脂肪酸的含量大大提高至 超过50 %，甚至提高至70 %，同时使得生物量和油脂量都显著提高，生物量可达120-150克 每升，油脂含量在75%以上。
[0023] 优选的，本发明的生物柴油原料油的生产方法包括以下步骤：
[0024]S1、将裂殖壶菌的菌种使用种子培养基培养成种子液。将保藏的裂殖壶菌的活化， 例如采用传代保藏的斜面培养、穿刺培养等，使用固体培养基一次活化后用液体培养基二 次活化或者液体培养基活化；采用长时间冷冻干燥保藏例如液氮保藏的，使用固体培养基 一次活化后用液体培养基二次活化或者液体培养基一次活化甚至二次活化；采用短时间冷 冻干燥的例如冷冻甘油管保藏的，也可以直接置于常温，甘油管融化后即活化完成。将活 化后的种子接入种子培养基，培养成种子液备用。优选的，使用的种子培养基包括：葡萄糖 40.Og/L~60.Og/L，酵母粉 5.Og/L~10.Og/L，蛋白胨I.Og/L~5.Og/L，硫酸镁 0? 5g/L~ 2. 0g/L，碳酸氢|丐 0. 2g/L~I. 0g/L，磷酸二氢钾I. 0g/L~3. 0g/L，氯化钠I. 0g/L~5.Og/ L。优选的，培养条件为：向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为2%~5%，在 摇床转速180rpm~300rpm、培养温度32°C~35°C的条件下进行摇瓶培养20h~24h。
[0025]S2、将种子液按照体积百分比3%~10%接入发酵培养基中进行培养，培养温度 28°C至40°C，通气3m3/h~15m3/h并保持搅拌，发酵过程中流加补充碳源、氮源。优选的， 所使用的发酵培养基包括：葡萄糖80. 0g/L~150. 0g/L，玉米浆10. 0g/L~30. 0g/L，谷氨 酸钠8. 0g/L~20. 0g/L，硫酸镁0. 5g/L~3. 0g/L，碳酸氢|丐I. 0g/L~5. 0g/L，磷酸二氢钾 I. 0g/L~3. 0g/L，硝酸钠 5. 0g/L~10. 0g/L。
[0026]S3、发酵培养20h~30h后，控制发酵温度在30°C~40°C，通气8m3/h~16m3/h，发 酵过程中流加补充碳源、氮源。20h~30h后，菌体生长进入稳定期，规模化生产过程中主要 表现为溶氧度不再明显下降，稳定期为富集油脂的主要时期，此时发酵已经经过较长时间， 需要流加补充碳源、氮源以补充油脂合成中所需要的营养。优选的，所述培养温度为30°C至 35°C，通气速度为IOm3A~12m3/h。优选的，流加补充的所述碳源为葡萄糖和/或糖蜜，流 加补充的所述氮源为玉米浆和/或谷氨酸钠，维持发酵液中碳源浓度为20. 0g/L~50.Og/ L，氮源浓度为3. 0g/L~5. 0g/L，例如，具体生产实践中，从发酵进行第30小时开始，每隔8 小时补料一次，按照每次每升发酵液补充碳源25. 0g、氮源2g，基本可以维持上述碳源和单 元浓度。当然也可以采取定时取样检测的方式，在碳源浓度低于20. 0g/L时流加补充的碳 源，在氮源浓度低于3g/L时流加补充的氮源。
[0027]S4、发酵培养80h~120h后，收集菌体。培养时间达到80h~120h，油脂合成基 本完成，应该菌体进入衰亡期之前停止发酵过程，收集菌体以提取油脂。收集菌体的方式包 括：自然沉降、离心、膜分离中的任意一种及其组合。
[0028] 实施例1
[0029] 生物柴油原料油的生产方法，包括以下步骤：
[0030] (1)配制种子培养基，灭菌备用
[0031] 种子培养基包括：葡萄糖40. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨I. 0g/L，硫酸镁0. 5g/L， 碳酸氢钙〇. 2g/L，磷酸二氢钾I. 0g/L，氯化钠I. 0g/L。
[0032] (2)配制发酵培养基，灭菌备用
[0033] 发酵培养基包括：葡萄糖80.Og/L，玉米浆10.Og/L，谷氨酸钠8.Og/L，硫酸镁 0. 5g/L，碳酸氢|丐I.Og/L，磷酸二氢钾I.Og/L，硝酸钠5.Og/L。
[0034] (3)制备种子液
[0035] 向种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量体积百分比为2%，在摇床转速300rpm、培 养温度28°C的条件下进行摇瓶培养24h，获得种子液。
[0036] ⑷发酵培养
[0037] 将种子液按照体积百分比3 %接入发酵培养基中进行培养，培养温度40°C，通气 15m3/h并保持搅拌，发酵培养24h后，控制发酵温度在4(TC，通气16m3/h，发酵过程中流加 补充葡萄糖作为碳源和玉米楽作为氮源，维持发酵液中碳源浓度为20. 0g/L~50. 0g/L，氮 源浓度为3. 0g/L~5. 0g/L。
[0038] (5)收集菌体、分离油脂
[0039] 发酵培养80h后，收集菌体，干燥菌体后采用溶剂提取的方式萃取油脂，结果如表 1所示，其中生物量是单位体积培养液获得的细胞干重，油脂含量是分离所得的油脂占细胞 干重的质量百分比，饱