背景技术：
：新生儿Fc-受体(FcRn)对于IgG类抗体在体内的代谢命运是重要的。FcRn起从溶酶体降解途径中挽救IgG的作用，导致降低的清除率和延长的半衰期。它是由两个多肽：50kDaI类主要组织相容性复合物样蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异源二聚体蛋白。FcRn以高亲和力结合IgG类抗体的Fc区的CH2-CH3部分。IgG类抗体和FcRn之间的相互作用是pH依赖性的并且以1:2化学计量发生，即一个IgG抗体分子可以通过其两个重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见，例如Huber,A.H.,等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。Houde,D等人报道了通过氢/氘交换质谱法(Anal.Chem.81(2009)2644-2651)表征IgG1构象和构象动力学。Suzuki,T.等人报道了新生儿FcR在调节含有人IgG1的Fc结构域的治疗性蛋白的血清半衰期中的重要性：单克隆抗体和Fc融合蛋白对人新生儿FcR的亲和力的比较研究(J.Immunol.184(2010)1968-1976)。Wang，W.等人报道了具有相同Fc序列的单克隆抗体可以差异地以药物动力学结果结合FcRn(DrugMetabol.Dispos.39(2011)1469-1477)。Schlothauer，T.等人报道了用于功能表征单克隆抗体的分析性FcRn亲和色谱法(mAbs5(2013)576-586)。Houde，D.等人报道了翻译后修饰差异地影响IgG1构象和受体结合(Mol.CellProteom.9(2010)1716-1728)。在EP14165987.0中报道了体内半衰期的体外预测。在EP2233500中报道了优化的Fc变体。在US2012/028304中报道了具有修饰的等电点的抗体。技术实现要素：已经发现单克隆全长抗体的包含重链中残基1-23、145-174、180-197的区域以及包含轻链中残基55-83的区域(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号))参与全长抗体与人新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用。因此，本文报道的一个方面是用于选择全长抗体的方法，其包括以下步骤：a)通过随机化一个或多个氨基酸残基从亲本全长抗体产生多种全长抗体变体，所述一个或多个氨基酸残基选自以下氨基酸残基的组：重链可变结构域中位置1-23的残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置55-83的残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置145-174的残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置180-197的残基(根据EU索引编号)，b)测定来自多种抗体的每种全长抗体对人新生儿Fc受体(FcRn)的结合强度，以及c)从多种全长抗体变体中选择与亲本全长抗体具有不同的FcRn结合强度的全长抗体。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-73的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，氨基酸残基选自包含重链中氨基酸残基6、162、164、165、191、194、195和196，以及轻链中氨基酸残基57和60(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号)的氨基酸残基的组。在一个实施方案中，重链可变结构域的位置6的氨基酸残基被随机化为Q。在一个实施方案中，重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处的氨基酸残基彼此独立地被随机化为酸性氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变结构域的氨基酸位置57和60中的一处或多处的氨基酸残基彼此独立地被随机化为碱性氨基酸残基。在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，在不存在抗体的相应抗原的情况下测定来自多种抗体的全长抗体的每种与人新生儿Fc受体(FcRn)的结合强度。在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，对游离的，即非抗原复合的抗体测定来自多种抗体的全长抗体的每种与人新生儿Fc受体(FcRn)的结合强度。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。全长抗体包含四条抗体链，两条轻链(第一轻链和第二轻链)和两条重链(第一重链和第二重链)。第一和第二重链以及其独立地，第一和第二轻链在其氨基酸序列方面可以相同或不同。在一个实施方案中，抗体是单臂抗体。单臂抗体包含i)一条全长轻链，ii)与全长轻链配对的一条全长重链，和iii)一条缩短重链，其包含至少一部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域，其与全长重链配对。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，通过用中性氨基酸残基取代带电荷的氨基酸残基或通过用带电荷的氨基酸残基取代中性氨基酸残基，彼此独立地改变一个或多个下列氨基酸位置(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)：重链位置6、16、19、57、66、83、162、164、165、191、194、195、196、轻链位置57、60。在一个实施方案中，通过用中性氨基酸残基取代带电荷的氨基酸残基或通过用带电荷的氨基酸残基取代中性氨基酸残基，彼此独立地改变一个或多个下列氨基酸位置(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)：重链位置6、16、19、162、164、165、191、194、195、196、轻链位置57、60。在一个实施方案中，彼此独立地引入一个或多个以下氨基酸突变(随机化)(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E，和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D，和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链E6Q。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链T164E。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链A162D和S165D。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链G194E。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链S191D和Q196D。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)轻链G57R。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)轻链G57K和S60K。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链T164E，和ii)重链A162D和S165D，和iii)重链G194E，和iv)重链S191D和Q196D。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链E6Q，和ii)重链T164E，和iii)重链A162D和S165D，和iv)重链G194E，S191D和Q196D，和V)轻链G57K和S60K。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)重链E6Q，和/或ii)重链T164E，和/或iii)重链A162D和S165D，和/或iv)重链G194E，和/或v)重链T164E，A162D和S165D，和/或vi)重链G194E，S191D和Q196D，和/或vii)轻链G57R，和/或viii)轻链G57K和S60K。在一个实施方案中，引入以下氨基酸突变(分别根据Kabat可变结构域编号和KabatEU索引编号方案编号)i)第一和/或第二重链中的E6Q，和/或ii)a)第一重链中的T164E，和b)第二重链中的A162D和S165D，和/或iii)a)第一重链中的G194E，和b)第二重链中的S191D和Q196D，和/或iv)a)第一重链中的T164E，A162D和S165D，和b)第二重链中的G194Q，S191D和Q196D，和/或v)a)第一和/或第二重链中的E6Q，b)第一重链中的T164E，A162D和S165D，c)第二重链中的G194E，S191D和Q196D，和d)第一和/或第二轻链中的G57K和S60K。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自相同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自不同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，将1至15个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至10个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至5个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有增加的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有降低的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，结合强度是KD值。在一个实施方案中，结合强度是具有正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和色谱法柱上的保留时间。在一个实施方案中，结合强度是体内半衰期。如本文报道的一个方面是通过随机化一个或多个氨基酸残基从单一亲本全长抗体产生的多种全长抗体变体，所述一个或多个氨基酸残基选自包含重链可变结构域中的位置1-23(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中的位置55-83(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中的位置145-174(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中的位置180-197(根据EU索引编号)的氨基酸残基的组。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-73的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，氨基酸残基选自包含重链中的氨基酸残基6、162、164、165、191、194、195和196，以及轻链中的氨基酸残基57和60(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号)的氨基酸残基的组。在一个实施方案中，重链可变结构域的位置6的氨基酸残基被随机化为Q。在一个实施方案中，重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处的氨基酸残基被随机化为酸性氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变结构域的氨基酸位置57和60中的一处或多处的氨基酸残基被随机化为碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，一个或多个以下氨基酸随机化彼此独立地被引入-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E，和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D，和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自相同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自不同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，将1至15个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至10个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至5个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有增加的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有降低的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，结合强度是KD值。在一个实施方案中，结合强度是具有正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和色谱法柱上的保留时间。在一个实施方案中，结合强度是体内半衰期。如本文报道的另一方面是选自下述位置的一个或多个氨基酸突变用于改变全长抗体的体内半衰期的用途，所述位置包括重链可变结构域中的位置1-23(根据Kabat编号)、轻链可变区结构域中的位置55-83(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中的位置145-174(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中的位置180-197(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-73的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，氨基酸残基选自包含重链中的氨基酸残基6、162、164、165、191、194、195和196，以及轻链中的氨基酸残基57和60(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号)的氨基酸残基的组。在一个实施方案中，重链可变结构域的位置6的氨基酸残基被随机化为Q。在一个实施方案中，重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处的氨基酸残基被彼此独立地突变为酸性氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变结构域的氨基酸位置57和60中的一处或多处的氨基酸残基被彼此独立地突变为碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，一个或多个以下氨基酸突变彼此独立地被引入-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E，和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D，和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自相同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自不同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，将1至15个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至10个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至5个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有增加的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有降低的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，结合强度是KD值。在一个实施方案中，结合强度是具有正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和色谱法柱上的保留时间。在一个实施方案中，结合强度是体内半衰期。如本文报道的另一方面是包含两条轻链多肽和两条重链多肽的全长抗体变体，其中变体抗体通过在一个或多个选自以下的位置引入氨基酸突变而衍生自亲本全长抗体：所述位置包括重链可变结构域中的位置1-23(根据Kabat编号)、轻链可变区结构域中的位置55-83(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中的位置145-174(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中的位置180-197(根据EU索引编号)，并且其中变体抗体对于人新生儿Fc受体具有与亲本全长抗体不同的亲和力。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置55-73的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，氨基酸残基选自包含重链中的氨基酸残基6、162、164、165、191、194、195和196，以及轻链中的氨基酸残基57和60(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号)的氨基酸残基的组。在一个实施方案中，重链可变结构域的位置6的氨基酸残基被突变为Q。在一个实施方案中，重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处的氨基酸残基被彼此独立地突变为酸性氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变结构域的氨基酸位置57和60中的一处或多处的氨基酸残基被彼此独立地突变为碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，一个或多个以下氨基酸突变彼此独立地被引入-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E，和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D，和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自相同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，随机化是通过将氨基酸残基突变成来自不同氨基酸残基组的不同氨基酸残基。在一个实施方案中，将1至15个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至10个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，将1至5个氨基酸残基随机化。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有增加的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，全长抗体选自与FcRn具有降低的结合强度的多种全长抗体。在一个实施方案中，结合强度是KD值。在一个实施方案中，结合强度是具有正线性pH梯度洗脱的FcRn亲和色谱法柱上的保留时间。在一个实施方案中，结合强度是体内半衰期。如本文报道的一个方面是相对于其亲本抗体在一个或多个以下氨基酸残基处具有突变的变体抗体：-重链中的残基6、162、164、165、191、194、195和196，-轻链中的残基57和60，(分别根据Kabat(可变结构域)和EU指数(恒定区)编号)。在一个实施方案中，变体抗体相对于其亲本抗体在一个或多个以下氨基酸残基处具有突变-重链中的残基162、164、165、191、194、195和196，-轻链中的残基57和60，(分别根据Kabat(可变结构域)和EU指数(恒定区)编号)。在一个实施方案中，变体抗体相对于其亲本抗体在一个或多个以下氨基酸残基处具有突变-重链中的残基162、164、165、191、194、195和196，(分别根据Kabat(可变结构域)和EU指数(恒定区)编号)。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中具有氨基酸突变E6Q。在一个实施方案中，抗体在重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处具有酸性氨基酸。在一个实施方案中，酸性氨基酸是D或E。在一个实施方案中，抗体在重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的两处或更多处具有酸性氨基酸残基，其中酸性氨基酸残基彼此独立地选择。在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域的氨基酸位置57和60中的一处或两处具有碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，碱性氨基酸残基是K或R。在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域的位置57和60两处都具有碱性氨基酸残基，其中碱性氨基酸残基彼此独立地选择。在一个实施方案中，所述抗体具有彼此独立的一个或多个以下氨基酸突变-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E，和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D，和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。发明详述本发明至少部分基于如下发现：单克隆抗体在Fc区和Fab片段中的几个区域在结合FcRn时显示氘摄取的减少(参见图1和图2)。这些区域包括重链中的残基1-23、145-174(氨基酸序列GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL，SEQIDNO：11)、180-197(氨基酸序列YSLSSVVTVPSSSLGTQT，SEQIDNO：13)以及轻链中的残基55-83(分别为Kabat(可变结构域)和EU指数(恒定区)编号)。I.定义如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号，在本文中称为“根据Kabat编号”。具体地，Kabat等人的SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，KabatEU指数编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1，铰链，CH2和CH3)。术语“约”表示其后数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后数值的+/-5％的范围。用于本文目的的“受体人框架”是包含来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下文所定义。来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目为10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原亲和力的改善。术语“改变”表示亲本抗体或融合多肽(例如，至少包含Fc区的FcRn结合部分的融合多肽)中一个或多个氨基酸残基的突变(取代)、插入(添加)或缺失，以获得修饰的抗体或融合多肽。术语“突变”表示指定的氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基。例如，突变L234A表示抗体Fc区(多肽)中位置234处的氨基酸残基赖氨酸被氨基酸残基丙氨酸取代(用丙氨酸取代赖氨酸)(根据KabatEU索引编号系统编号)。“天然存在的氨基酸残基”表示来自丙氨酸(三字母代码：Ala，单字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、蛋氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。术语“氨基酸突变”表示至少一个存在的氨基酸残基被另一不同的氨基酸残基(＝取代氨基酸残基)取代。取代氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”，并且选自丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(glu，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys,K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。取代氨基酸残基可以是“非天然存在的氨基酸残基”。参见例如US6,586,207,WO98/48032,WO03/073238,US2004/0214988,WO2005/35727,WO2005/74524,Chin,J.W.,等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.andSchultz,P.G.,ChemBioChem11(2002)1135-1137；Chin,J.W.,等人,PICASUnitedStatesofAmerica99(2002)11020-11024；and,Wang,L.andSchultz,P.G.,Chem.(2002)1-10(全部通过引用全部并入本文)。术语“氨基酸插入”表示在氨基酸序列中的预定位置(添加)掺入至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，插入将是插入一个或两个氨基酸残基。插入的氨基酸残基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的预定位置去除至少一个氨基酸残基。本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，三特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的抗原和/或蛋白A和/或FcRn结合活性。术语“异源二聚体Fc区”表示由两条在相应位置具有不同氨基酸残基的多肽链组成的Fc区，其中根据KabatEU指数编号系统确定位置，其中不同的位置影响异源二聚体的形成。这样的差异的实例是所谓的“杵臼(knobsintoholes)”取代(参见例如US7,695,936和US2003/0078385)。已经发现在亚型IgG1的IgG抗体Fc区的单个多肽链中的以下杵和臼取代增加异源二聚体形成：1)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A和另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A和另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W和另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T和另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A，另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W，另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A，另一条链中的T366W和T394S；和9)一条链中的T366W和另一条链中的T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的特别适合。此外，在两个Fc区多肽链之间产生新的二硫桥的改变促进异源二聚体形成(参见例如US2003/0078385)。已经发现以下取代导致用于形成IgG1亚型的IgG抗体Fc区的各个多肽链中新的链内二硫键的半胱氨酸残基适当间隔开，增加异源二聚体形成：一条链中的Y349C和另一条链中的S354C；一条链中的Y349C和另一条链中的E356C；一条链中的Y349C和另一条链中的E357C；一条链中的L351C和另一条链中的S354C；一条链中的T394C和另一条链中的E397C；或一条链中的D399C和另一条链中的K392C。异源二聚化促进的氨基酸改变的其它实例是所谓的“电荷对取代(chargepairsubstitutions)”(参见例如WO2009/089004)。已经发现IgG1亚型的IgG抗体Fc区的单个多肽链中的以下电荷对取代增加异源二聚体形成：1)一条链中的K409D或K409E，和另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E，和另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E，和另一条链中的E356K或E356R；4)一条链中的K370D或K370E，和另一条链中的E357K或E357R；5)一条链中的K409D和K360D，和另一条链中的D399K和E356K；6)一条链中的K409D和K370D，和另一条链中的D399K和E357K；7)一条链中的K409D和K392D，和另一条链中的D399K、E356K和E357K；8)一条链中的K409D和K392D，和另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K392D，和另一条链中的D399K和E356K；10)一条链中的K409D和K392D，和另一条链中的D399K和D357K；11)一条链中的K409D和K370D，和另一条链中的D399K和D357K；12)一条链中的D399K和另一条链中的K409D和K360D；和13)一条链中的K409D和K439D，和另一条链中的D399K和E356K。术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。抗体的“类型”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类型的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。术语“可比较的长度”表示两个多肽包含相同数目的氨基酸残基或可以在长度上相差一个或多个且至多10个氨基酸残基。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或相差1至10个氨基酸残基的数目。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或相差1至5个氨基酸残基的数目。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或相差1至3个氨基酸残基的数目。“效应子功能”是指归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体类型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。试剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必需的时间段内在剂量上有效实现所需治疗或预防结果的量。术语“人源Fc区”表示含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的至少一部分的人源免疫球蛋白重链的C末端区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。在一个实施方案中，Fc区具有SEQIDNO：02的氨基酸序列。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。术语“FcRn”表示人新生儿Fc-受体。FcRn发挥从溶酶体降解途径中挽救IgG的作用，导致清除率降低和半衰期延长。FcRn是由两个多肽：50kDaI类主要组织相容性复合物样蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异源二聚体蛋白。FcRn以高亲和力结合IgGFc区的CH2-CH3部分。IgG和FcRn之间的相互作用是严格的pH依赖性的，并且以1:2的化学计量发生，其中一个IgG通过其两条重链与两个FcRn分子结合(Huber，AH，等人，J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合发生在酸性pH(pH<6.5)下的胞内体中，并且IgG在中性细胞表面(pH约7.4)释放。相互作用的pH敏感的性质促进FcRn介导，通过在核内体的酸性环境中结合受体，保护吞饮入细胞的IgG免受细胞内降解。然后FcRn促进IgG向细胞表面的再循环并且随后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外的中性pH环境时释放到血流中。术语“Fc区的FcRn结合部分”表示抗体重链多肽的部分，其大致从EU位置243延伸至EU位置261，和大致从EU位置275延伸至EU位置293，和大致从EU位置302延伸至EU位置319，和大致从EU位置336延伸至EU位置348，和大致从EU位置367延伸至EU位置393和EU位置408，和大致从EU位置424延伸至EU位置440。在一个实施方案中，根据KabatEU编号的一个或多个以下氨基酸残基被改变：F243，P244，P245P,K246,P247,K248,D249,T250,L251,M252,I253,S254,R255,T256,P257,E258,V259,T260,C261,F275,N276，W277,Y278,V279,D280,V282，E283,V284，H285，N286，A287，K288，T289,K290,P291，R292，E293，V302，V303，S304，V305,L306，T307，V308,L309,H310，Q311，D312，W313，L314，N315，G316，K317,E318,Y319,I336，S337,K338,A339,K340,G341，Q342,P343,R344，E345，P346，Q347,V348,C367,V369，F372,Y373,P374,S375，D376,I377,A378，V379，E380，W381，E382，S383，N384，G385，Q386,P387,E388,N389,Y391，T393，S408，S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439,和S440(EU编号)。“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以如下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体，所述天然抗体结构包含四个多肽或具有含有本文定义的Fc区的重链。全长抗体可以包含另外的结构域，如与全长抗体的一条或多条链缀合的scFv或scFab。这些缀合物也包括在术语全长抗体中。术语“二聚多肽”表示包含至少两个共价结合的多肽的复合物。复合物可以包含也与其它多肽共价或非共价结合的其它多肽。在一个实施方案中，二聚多肽包含两个或四个多肽。术语“异源二聚体”或“异源二聚体的”表示包含两个多肽(例如具有可比较的长度)的分子，其中两个多肽具有在相应位置上具有至少一个不同氨基酸残基的氨基酸序列，其中相应位置根据KabatEU索引编号系统确定。术语“同源二聚体”和“同源二聚体的”表示包含两个可比较长度的多肽的分子，其中两个多肽具有在相应位置上相同的氨基酸序列，其中相应位置根据KabatEU索引编号系统确定。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能不与亲本细胞完全相同，但可能含有突变。在本文中包括具有与针对原始转化细胞所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变后代。“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体、或衍生自利用人抗体组成成分(repertoire)或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特异性排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,BethesdaMD(1991),NIHPublication91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是Kabat等人，同上中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是Kabat等人，同上中的亚组III。术语“衍生自”表示通过在至少一个位置引入改变而使氨基酸序列衍生自亲本氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列在至少一个相应位置(根据针对抗体Fc区的KabatEU索引编号)不同于相应的亲本氨基酸序列。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1-15个氨基酸残基的不同。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1-10个氨基酸残基的不同。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1-6个氨基酸残基的不同。同样，衍生的氨基酸序列与其亲本氨基酸序列具有高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有80％或更高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有90％或更高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有95％或更高的氨基酸序列同一性。术语“人Fc区多肽”表示与“天然”或“野生型”人Fc区多肽相同的氨基酸序列。术语“变体(人)Fc区多肽”表示由于至少一个“氨基酸改变”衍生自“天然”或“野生型”人Fc区多肽的氨基酸序列。“人Fc区”由两个人Fc区多肽组成。“变体(人)Fc区”由两个Fc区多肽组成，其中两者可以都是变体(人)Fc区多肽，或一个是人Fc区多肽，另一个是变体(人)Fc区域多肽。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指序列是高度可变的抗体可变结构域的每个区域(“互补决定区”或“CDR”)，其形成结构上限定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含6个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)，三个在VL(L1，L2，L3)。本文所指的HVR包括(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)的高变环(Chothia,C.andLesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；(b)存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242)。(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)，(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3)和94-102(H3)。除非另有说明，本文根据KabatEU索引编号系统(Kabat等人，同上)对HVR残基和可变结构域中的其它残基(例如FR残基)进行编号。“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱法(例如尺寸排阻色谱法，离子交换或反相HPLC)测定的。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman,S.等人,J.Chrom.B848(2007)79-87。“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即群包含的各单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生的，这样的变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文描述。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N至C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归类于两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列以及如果需要，引入间隙以获得最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域中的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.撰写，并且源代码已经与用户文档在美国版权局，WashingtonD.C.，20559提交，其中它在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或者可从源代码编译。ALIGN-2程序应该编译在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIXV4.0D。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设置并且不变。在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B(其可以替代地表示为给定氨基酸序列A具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)的％氨基酸序列同一性计算如下：100乘以分数X/Y其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，和其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另有说明，否则本文使用的全部％氨基酸序列同一性值是使用ALIGN-2计算机程序如在前面的段落中所描述的获得的。本文所用的术语“重组抗体”表示通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部抗体(嵌合的、人源化的和人)。这包括从宿主细胞例如NS0或CHO细胞分离的抗体，或来自人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这样的重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。可以对重组抗体进行体内体细胞超突变(somatichypermutation)。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能并不是天然存在于体内的人抗体种系组成成分。本申请中使用的术语“价”表示在(抗体)分子中存在特定数量的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一个优选的实施方案中，本文报道的双特异性抗体是“二价的”。术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与其抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。抗体重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.等人KubyImmunology,第六版,W.H.FreemanandCo.,N.Y.(2007),，第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628)。如本文所使用的术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合入其已被导入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导其有效连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。II.本发明新生儿Fc-受体(FcRn)对于IgG类抗体在体内的代谢命运是重要的。FcRn发挥从溶酶体降解途径拯救野生型IgG的作用，导致清除率降低和半衰期延长。它是由两个多肽：50kDaI类主要组织相容性复合物样蛋白(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异源二聚体蛋白。FcRn以高亲和力结合IgG类抗体Fc区的CH2-CH3部分。IgG类抗体和FcRn之间的相互作用是pH依赖性的，并且以1∶2的化学计量发生，即一个IgG抗体分子可以通过其两个重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见例如Huber，A.H.,等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。因此，IgG体外FcRn结合性质/特征是其在血液循环中的体内药代动力学性质的指征。重链CH2-和CH3-结构域的不同氨基酸残基参与FcRn和IgG类抗体的Fc区之间的相互作用。与FcRn相互作用的氨基酸残基大致位于EU位置243和EU位置261之间，大致位于EU位置275和EU位置293之间，大致位于EU位置302和EU位置319之间，大致位于EU位置336和EU位置348之间，大致位于EU位置367和EU位置393之间，位于EU位置408，和大致位于EU位置424和EU位置440之间。更具体地，根据KabatEU编号的以下氨基酸残基参与Fc区和FcRn的相互作用：F243，P244，P245P，K246，P247，K248，D249，T250，L251，M252，I253，S254，R255，T256，P257，E258，V259，T260，C261,F275,N276,W277,Y278,V279,D280,V282,E283,V284，H285,N286，A287，K288,T289,K290,P291，R292,E293,V302，V303，S304，V305,L306,T307,V308,L309,H310,Q311，D312，W313，L314，N315,G316，K317，E318，Y319，I336，S337，K338，A339，K340，G341，Q342，P343，R344，E345，P346，Q347,V348，C367，V369,F372，Y373，P374，S375，D376，I377，A378，V379，E380,W381，E382，S383，N384，G385，Q386，P387，E388，N389，Y391，T393，S408,S424，C425，S426，V427，M428，H429，E430，A431，L432，H433，N434，H435，Y436，T437，Q438，K439，和S440。定点诱变研究已经证明IgG的Fc区中针对FcRn的重要结合位点是组氨酸310、组氨酸435和异亮氨酸253，以及在较小程度上是组氨酸433和酪氨酸436(参见例如Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan，M.，等人，Biochem.34(1995)14649-14657；Medesan，C.，等人，JImmunol.158(1997)2211-2217)。通过在多种氨基酸残基处突变IgG来进行增加IgG与FcRn的结合的方法：苏氨酸250、蛋氨酸252、丝氨酸254、苏氨酸256、苏氨酸307、谷氨酸380、蛋氨酸428、组氨酸433和天冬酰胺434(参见Kuo，T.T.,等人,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。在一些情况下，期望在血液循环中具有降低的半衰期的抗体。例如，用于玻璃体内应用的药物应当在眼睛中具有长的半衰期，而在患者的血液循环中具有短的半衰期。这样的抗体还具有增加暴露于疾病部位的优点，例如在眼睛。影响FcRn结合以及由此影响血液循环中半衰期的不同突变是已知的。已经通过定点诱变鉴定了对小鼠Fc区-小鼠FcRn相互作用是关键的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.,等人J.Immunol169(2002)5171-5180)。残基I253，H310，H433，N434和H435(根据Kabat的EU编号)参与相互作用(Medesan,C.,等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan，M.，等人，Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。发现残基I253，H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用是至关重要的(Kim，J.K.，等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2855)。Dall′Acqua等人通过蛋白质-蛋白质相互作用研究描述了残基M252Y、S254T、T256E改善FcRn结合(Dall'Acqua,W.F.,等人J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc-人FcRn复合物的研究已经显示残基I253、S254、H435和Y436对于相互作用是至关重要的(Firan,M.,等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.,等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已报道和检测了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。现在已经发现，单克隆抗体在Fab片段中的几个区域显示在结合FcRn时氘摄取的减少(参见图1和图2)。这些区域包括重链中的残基1-23、145-174、180-197以及轻链中的残基55-83(分别为Kabat(可变结构域和EU索引(恒定区)编号))。因此，不仅Fc区氨基酸残基、而且位于CH1结构域和VH/VL结构域中的残基也有助于抗体-FcRn相互作用的强度和与此的紧密性。基于这一发现，现在可以提供新的氨基酸突变和氨基酸突变的组合来定制抗体的体内半衰期。HDX-MS用于绘制参与结合人FcRn的全长IgG1抗体的位点。FcRn与抗洋地黄毒苷抗体的HDX-MS的有效序列覆盖率对于HC和LC都为82％，并报道了89种肽的氘摄取(参见图1)。抗体在Fc和Fab结构域中的几个区域显示在结合FcRn时氘摄取减少(参见图1和2)。这些区域包括重链中的残基1-23、145-174、180-197以及轻链中的残基55-83(分别为Kabat(可变结构域)和EU索引(恒定区)编号)。在区域1-23中，5-18、5-22和5-23的重叠肽中的HDX分析显示对于延伸肽的C-末端没有观察到额外的保护(19-23)。没有进行肽1-18与其它肽(4-18，5-18)的比较，因为完全氘化样品的回溯交换(back-exchange)的差异大于15％。因此，考虑到在HDX-MS实验中，在肽的前两个N-末端残基上的氘在MS检测前丢失，通过FcRn结合而降低的氘摄取可以定位于残基3-18。抗体CH1结构域的区域145-174中重叠肽(145-174、146-174、156-174、159-174)中的HDX比较、以及考虑到在HDX-MS实验中在肽的前两个N-末端残基上的氘在MS检测前丢失，表明通过FcRn结合的HDX保护可定位于残基161-174。对于区域180-197，当FcRn结合时重叠肽186-197显示仅约肽180-197的一半的氘摄取减少。因此，考虑到在HDX-MS实验中在肽的前两个N-末端残基上的氘在MS检测前丢失，通过FcRn的HDX保护可定位于残基182-197。在LC中，框架区3中的区域55-83中的几种肽显示在FcRn结合时氘摄取降低。通过重叠肽(55-71、55-73、55-83、71-82、71-83)分析，以及考虑到在HDX-MS实验中在肽的前两个N-末端残基上的氘在MS检测前丢失，结合相互作用主要定位于残基57-71。在FcRn结合时远离Fc区的这些区域的降低的HD交换表明这些区域包含参与抗体-FcRn相互作用的氨基酸残基。本文报道的一个方面是用于选择全长抗体的方法，其包括以下步骤：a)通过随机化一个或多个氨基酸残基，从亲本全长抗体产生多种全长抗体，所述一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)，b)测定来自多种抗体的每种全长抗体与人新生儿Fc受体(FcRn)的结合强度，以及c)从多种全长抗体中选择与亲本全长抗体具有不同的FcRn结合强度的全长抗体。不受该理论的束缚，设想在抗体的Fc区和FcRn之间的第一相互作用已经建立之后，抗体的Fab部分和FcRn之间形成第二相互作用。该第二相互作用改变第一相互作用的强度，如本文提供的数据所示。在本文提供的HD交换数据中，已经发现存在基于可变结构域中相对低量的正电荷的Fab与FcRn的直接相互作用。此外，如本文中报道的，额外的正电荷已经在Fab区的某些区域中应用于乌司奴单抗(Ustekinumab)，导致显著改善的FcRn相互作用强度。已发现由于在FcRn亲和柱的pH梯度中较晚的洗脱，这种相互作用的增加不遵循pH依赖性结合行为。在许多FcRn柱保留时间分析中，已经发现全部IgG显示独自的保留时间曲线，取决于其Fab序列和由此其独自的Fab电荷模式。可以通过向运行缓冲液施加高盐含量分解额外的电荷依赖性相互作用，来改变该观察。已经发现，可以通过靶向相应抗体的预孵育来屏蔽Fab的影响。因此，已经发现并且在本文中提出，每个抗体在Fab区中具有可以影响该抗体与FcRn结合的独自的电荷模式。如果抗体已经对FcRn具有非常强的或甚至太强的结合(示例为，例如，FcRn亲和柱上的洗脱pH值接近或甚至高于pH7.4，或尽管有强的FcRn结合但有意想不到的缩短的体内半衰期)，可以通过减少抗体Fab区中的电荷数来修饰抗体-FcRn相互作用。例如，在本专利申请的实施例中报道的FcRn亲和色谱法中，具有7.4或更高的洗脱pH的抗体是具有太强的FcRn相互作用的抗体。通过减少Fab区中的电荷数(如果Fab区工程化不足，最终与Fc区工程化一起)，也可以降低保留时间，实现小于pH7.4的洗脱pH。这样的抗体通过增加体内保留时间而受益于FcRn相互作用。如果抗体对FcRn具有弱的结合(示例为，例如FcRn亲和柱上的洗脱pH值远低于pH7.4)，可以通过增加抗体Fab区中的电荷数来修饰抗体-FcRn相互作用。例如，在本专利申请的实施例中报道的FcRn亲和色谱法中，具有6.5的洗脱pH的抗体是具有弱FcRn相互作用的抗体。通过增加Fab区中的电荷数(如果Fab区工程化不足，最终与Fc区工程化一起)，也可以增加保留时间，实现接近pH7.4的洗脱pH。这样的抗体通过增加体内保留时间而受益于FcRn相互作用。通常，Fab区中改变的电荷影响整个正电荷，即，正电荷的数量减少或增加，或者负电荷的数量增加或减少。由于不是Fab区的全部区域都能与结合到相应抗体Fc区的FcRn相互作用，已经发现通过修饰本文概述的区域中的残基，可以修饰抗体-FcRn相互作用，所述残基即跨越重链可变结构域中位置1-23区域中的残基(根据Kabat编号)，跨越轻链可变结构域中位置55-83区域中的位置(根据Kabat编号)，跨越第一重链恒定结构域中位置145-174区域中的位置(根据EU索引编号)，和跨越第一重链恒定结构域中位置180-197区域中的位置(根据EU索引编号)。此外，在双特异性抗体的情况下，每个Fab区可以被单独地工程化，因为一个抗体Fc区可以与两个FcRn分子相互作用，产生更多的潜在相互作用和修饰位点。因此，在本文报道的方法中，在本文定义的区域中引入的突变引入、去除或修饰正电荷片(patch)。这样的突变是本领域技术人员已知的，如(以一个字母的氨基酸代码)例如，E至Q(引入正电荷)、T至E(还原正电荷)、A至D(还原正电荷)、S至D(还原正电荷)、G至E(还原正电荷)、G至R(导入正电荷)或S至K(导入正电荷)。在生理pH值下，氨基酸残基精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)主要被质子化并因此带正电荷，而氨基酸残基天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)主要被去质子化(即带负电)。本发明在下文中用抗洋地黄毒苷抗体举例说明。以下突变已经被引入抗洋地黄毒苷抗体：-HC-E6Q(变体1)，-HC-T164E(变体2)，-HC-A162D和HC-S165D(变体3)，-HC-G194E(变体4)，-HC-S191D和HC-Q196D(变体5)，-LC-G57R(变体6)，-LC-G57R和LC-S60K(变体7)，-HC164E，HC-A162D，HC-S165D，HC-G194E，HC-S191D和HC-Q196D(变体8)，-HC-E6Q，HC-A162D，HC-T164E，HC-S165D，HC-S191D，HC-G194E，HC-Q196D，LC-G57K和LC-S60K(变体9)。这些突变体在FcRn亲和柱和基于SPR的结合测定法中的性质显示在下表中(对抗体-FcRn相互作用的影响)：样本相对FcRn保留时间相对SPR结合参照抗洋地黄毒苷抗体100％(40分钟)100％变体1增加107％变体2减少94％变体3增加178％变体4减少96％变体5增加167％变体6增加126％变体7增加161％变体8减少69％变体9增加120％因此，从上面给出的数据可以看出，通过改变可变结构域和/或第一恒定结构域(VH1和CL)中的电荷模式，可以实现FcRn结合的改变。如本文报道的一个方面是通过随机化选自以下氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基从单一亲本全长抗体产生多种全长抗体变体：重链可变结构域中位置1-23的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置55-83的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置145-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置180-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。如本文报道的另一方面是在选自下组位置上的一个或多个氨基酸突变用于改变全长抗体体内半衰期的用途，所述位置包括重链可变结构域中的位置1-23(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中的位置55-83(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中的位置145-174(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中的位置180-197(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。本文报道的另一方面是包含两条轻链多肽和两条重链多肽的全长抗体变体，其中变体抗体通过在选自下组位置的一个或多个位置引入氨基酸突变而衍生自亲本全长抗体：所述位置包括重链可变结构域中的位置1-23(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中的位置55-83(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中的位置145-174(根据Kabat编号)和第一重链恒定结构域中的位置180-197(根据EU索引编号)，其中变体抗体具有与亲本全长抗体不同的人新生儿Fc受体亲和力。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置3-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-71的氨基酸残基(根据Kabat编号)、第一重链恒定结构域中位置161-174的氨基酸残基(根据EU索引编号)和第一重链恒定结构域中位置182-197的氨基酸残基(根据EU索引编号)。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基选自重链可变结构域中位置5-18的氨基酸残基(根据Kabat编号)、轻链可变结构域中位置57-70的氨基酸残基(根据Kabat编号)和第一重链恒定结构域中位置181-196的氨基酸残基(根据EU索引编号)。本文报道的一个方面是在以下氨基酸残基中的一处或多处具有突变的抗体：-重链中的残基6、162、164、165、191、194、195和196，-轻链中的残基57和60。(分别根据Kabat(可变结构域)和EU指数(恒定区)编号)。在一个实施方案中，抗体是全长IgG抗体。在一个实施方案中，抗体是全长IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。已经发现，可以修饰包含氨基酸残基3至18的重链肽段以扩大可与FcRn上的其负对应物相互作用的现有表面正电荷片。只有E6Q突变应该被积极的耐受。在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中具有氨基酸突变E6Q。已经发现，包含氨基酸残基159至174的重链肽段打破与CH2结构域上的正片相对的两个相邻的负电荷片。因此，增加的CH1-CH2相互作用可使Fab更接近FcRn，这继而可能有利于FcRn结合。该片最好与包含氨基酸残基182-197的重链肽段一起修饰，因为两者都在相同CH2结构域片的附近。因此，位置162和/或164和/或165和/或191和/或194和/或195和/或196的一个或多个氨基酸残基应被修饰为酸性残基，在一个优选的实施方案中，修饰为D或E，以加强抗体-FcRn结合/相互作用。在一个实施方案中，抗体在重链第一恒定域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196中的一处或多处具有酸性氨基酸。在一个实施方案中，酸性氨基酸是D或E。在一个实施方案中，抗体在重链第一恒定结构域(CH1)的氨基酸位置162、164、165、191、194、195和196的两处或更多处具有酸性氨基酸残基，其中酸性氨基酸残基彼此独立地选择。已经发现，包含轻链可变结构域的氨基酸残基57至71的肽段形成与FcRn上的负片相对的弱阳性片。将该段中的正残基突变为负残基，即碱性残基，可以加强抗体-FcRn相互作用。在一个优选的实施方案中，轻链可变结构域的位置57和/或60的氨基酸残基彼此独立地是碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，碱性氨基酸残基选自K和R。在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域的氨基酸位置57和60的一处或两处具有碱性氨基酸残基。在一个实施方案中，碱性氨基酸残基是K或R。在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域的位置57和60都具有碱性氨基酸残基，其中碱性氨基酸残基彼此独立地选择。在一个实施方案中，抗体具有一个或多个以下氨基酸突变-重链E6Q，和/或-重链A162D，和/或-重链A162E，和/或-重链T164D，和/或-重链T164E，和/或-重链S165D，和/或-重链S165E和/或-重链S191D，和/或-重链S191E，和/或-重链G194D，和/或-重链G194E，和/或-重链T195D，和/或-重链T195E，和/或-重链Q196D和/或-重链Q196E，和/或-轻链G57K，和/或-轻链G57R，和/或-轻链S60K，和/或-轻链S60R。在本文报道的一个方面，可以通过筛选随机文库中具有所需抗体-FcRn相互作用的抗体来选择抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库以及筛选这样的文库中具有所需结合特性的抗体。这样的方法综述在，例如，Hoogenboom,H.R.等人,MethodsinMolecularBiology178(2001)1-37，以及还描述在，例如McCafferty,J.等人,Nature348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,MethodsinMolecularBiology248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods284(2004)119-132。在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组成成分，并随机重组在噬菌体文库中，然后可以如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示抗体片段，或作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：US5,750,373和US2005/0079574,US2005/0119455,US2005/0266000,US2007/0117126,US2007/0160598,US2007/0237764,US2007/0292936和US2009/0002360。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是本文的人抗体或人抗体片段。在US2002/0123057中报道了基于哺乳动物细胞中牛痘病毒介导的完整抗体表达的筛选系统。另一种筛选系统基于哺乳动物细胞中抗体的细胞表面表达(Ho,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)9637-9642)。细胞展示描述于Higuchi等人，在COS细胞中(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)。Beerli等人报道了从BHK细胞中的抗原特异性B细胞产生的基于辛德毕斯(Sindbis)病毒的scFv细胞表面展示文库(Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(2008)14336–14341)。Ho和Pastan报道了使用HEK293细胞(scFv)的方法(MethodsMol.Biol.562(2009)99-113)。Alonso-Camino等人(PLoSOne.4(2009)e7174)报道了淋巴细胞展示。Zhou等人报道了使用HEK293细胞的方法(ActaBiochim.Biophys.Sin.42(2010)575–584)。Zhou等人报道了Flp-In系统(Mabs.2(2010)508-518)。Taube,R.等人报道了(PLOSOne3(2008)e3181)在人细胞表面和慢病毒颗粒上稳定表达人抗体。在WO2007/047578中报道了抗体文库的细胞展示。真核细胞上抗体的展示和/或分泌是分离抗体的另一种方法。这些抗体通过将抗体编码核酸克隆到慢病毒载体中产生，所述载体用于转导细胞以使得能够在这些细胞的表面上表达抗体。所使用的载体携带抗体轻链、抗体重链、可选择地剪接的膜锚或标签或荧光标记蛋白。Sasaki-Haraguchi,N.等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.423(2012)289-294)报道了关于人超短内含子的人前mRNA剪接的机理性见解：潜在的不寻常机制鉴定富含G的内含子。在一个实施方案中，如WO2013/092720中报道的使用慢病毒表达文库与慢病毒表达载体组合的方法/展示系统用于本文报道的方法中，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，用于以可溶性以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链。使用的慢病毒载体包括病毒长的末端重复序列3’LTR和5’LTR、抗体轻链、EV71IRES、抗体重链。在一个实施方案中，使用如在EP13178581.8中报道的方法/展示系统。在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点/抗原具有结合特异性的单克隆抗体。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540,WO93/08829,和Traunecker,A.等人,EMBOJ.10(1991)3655-3659)和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见例如US5,731,168)。多特异性抗体也可以通过用于制备抗体Fc-异源二聚体分子的工程化静电转向效应来制备(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US4,676,980和Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和如，例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述制备三特异性抗体。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见，例如US2006/0025576)。本文的抗体还包括“双重作用Fab”或“DAF”(例如，参见US2008/0069820)。本文的抗体还包括在WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,WO2009/080254,WO2010/112193,WO2010/115589,WO2010/136172,WO2010/145792和WO2010/145793中描述的多特异性抗体。在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸突变的抗体变体/突变体。保守突变显示在下表中“优选突变”的标题下。在下表中“示例性突变”的标题下提供了更多的实质性改变，如下文关于氨基酸侧链类别的进一步描述。可将氨基酸突变引入感兴趣抗体中，并筛选所需FcRn结合的产物。表氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)碱性：His，Lys，Arg；(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。非保守突变需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。一种类型的突变变体包括突变亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体具有FcRn结合特性的修饰(例如，改善)，并将基本上保留亲本抗体的其它生物学特性。在一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任意将突变引入编码核酸。然后创建一个文库。然后筛选文库以鉴定具有所需FcRn亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括位置定向方法，其中几个氨基酸残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。在一个实施方案中，突变导致突变的氨基酸残基变为同一组的不同残基。在一个实施方案中，突变导致突变的氨基酸残基变为不同组的不同残基。在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为抗体体内半衰期是重要的、但是某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用中令人满意的候选。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)、但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR表达总结在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492中第464页的表3中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于US5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；US5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。可选择地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞仪的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，MadisonWI)。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地，或另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如，在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103(2004)2738-2743)。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见例如Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769))。具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些(US6,737,056)。这样的Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297被丙氨酸取代的所谓的“DANA”Fc突变体(US7,332,581)。描述了具有改善或减弱的FcR结合的某些抗体变体(参见，例如US6,737,056；WO2004/056312,和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，所述一个或多个氨基酸取代改善ADCC，例如Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)的取代。在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变的(即，改善或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如US6,194,551，WO99/51642和E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184所述。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体描述于US2005/0014934中，所述新生儿Fc受体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593,和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述一个或多个取代改善Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有取代的那些，例如Fc区残基434的取代(US7,371,826)。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821和WO94/29351。本发明的教导本文中已经发现，抗体VL/CH1结构域内某些残基的修饰可以用于影响抗体-FcRn相互作用。重组方法可以使用例如，如US4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供了编码如本文所述的抗体的分离核酸。这样的核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化有)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生产如本文报道的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养包含如上所提供的编码抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。对于重组生产抗体，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US5,648,237,US5,789,199和US5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254,描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以从细菌细胞糊中以可溶性级分分离抗体，并可以进一步纯化。除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母对于抗体编码载体是合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致生成具有部分或全部人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US5,959,177，US6,040,498，US6,420,548，US7,125,978和US6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(例如，如Graham,F.L.等人,J.GenVirol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如，例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如，例如Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。附图说明图1，抗洋地黄毒苷抗体的HDX-MS肽图。对于HC(A)和LC(B)可以获得HDX数据的胃酶解肽(pepticpeptide)显示为白色条。开放大框表示当FcRn结合时具有降低的氘含量的肽。实心框表示当FcRn与各个位点结合时的靶向区域，其中氘化的胃酶解肽的ETD用于解析差异氘标记。用星号表示与大鼠Fc-FcRn和人FcRn-Fc-YTE的晶体结构中的FcRn结合有关的抗体残基(参见Martin,W.L.,等人,Mol.Cell.7(2001)867-877,Oganesyan,V.,等人,J.Biol.Chem.289(2014)7812-7824)。图2，在存在和不存在人FcRn的情况下抗洋地黄毒苷抗体区域的HDX图谱。显示了轻链肽55-71和重链肽1-18、57-79、159-174和180-197的HDX图。上曲线显示抗体单独的HDX，下曲线分别显示在FcRn存在时HC和LC肽的HDX。对于FcRn和HC57-79，显示为虚线黑色曲线。在1分钟、1小时、2.5小时和5小时，一式三份监测氘掺入。在对照实验(90％D2O)中在5小时的时间点上测量的完全氘水平以黑色显示。图3，抗洋地黄毒苷抗体、布雷奴单抗(Briakinumab)和乌司奴单抗的重链可变结构域的氨基酸序列的比对。对于全部三种抗体，已经发现的防止HDX的氨基酸残基段在框内。图4，抗洋地黄毒苷抗体、布雷奴单抗和乌司奴单抗的轻链可变结构域的氨基酸序列的比对。对于全部三种抗体，已经发现的防止HDX的氨基酸残基段在框内。提供以下实施例、序列和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以在所阐述的步骤中进行修饰。实施例材料和方法重组DNA技术使用标准方法操作DNA，如Sambrook,J.等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。基因和寡核苷酸合成通过在GeneartGmbH(Regensburg，Germany)的化学合成制备所需的基因区段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR组装短的合成DNA片段。各寡核苷酸由metabionGmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备。试剂如果没有另外说明，根据制造商提供的方案使用全部商业化学品、抗体和试剂盒。实施例1抗洋地黄毒苷抗体的重组表达载体的生成用于表达抗洋地黄毒苷抗体重链的载体的生成通过融合编码各抗洋地黄毒苷抗体重链可变结构域的DNA片段与编码人IgG1恒定区的序列元件，组装包含人IgG1恒定区(CH1，铰链，CH2，CH3)和抗洋地黄毒苷抗体重链可变结构域的重链编码融合基因。抗洋地黄毒苷抗体重链可变结构域具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO:01)。人IgG1恒定区具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO:02)。表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，以及包含β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。抗体重链的转录单位在5'至3'方向包含以下功能元件：-来自包括内含子A的人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，-鼠免疫球蛋白重链信号序列，-重链可变(VH)结构域编码核酸，-人IgG1恒定区编码核酸，和-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。用于表达抗洋地黄毒苷抗体轻链的载体的生成通过融合编码各抗洋地黄毒苷抗体轻链可变结构域的DNA片段与编码人Ig-κ恒定区的序列元件，组装包含人Ig-κ恒定区(CL-κ)和κ同种型的抗洋地黄毒苷抗体轻链可变结构域的κ轻链编码融合基因。抗洋地黄毒苷抗体轻链可变域具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO：03)。人Ig-κ恒定区具有以下氨基酸序列：(SEQIDNO：04)。表达载体还包含来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和包含β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。抗体κ轻链的转录单元在5'至3'方向包含以下功能元件：-来自包括内含子A的人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，-鼠免疫球蛋白重链信号序列，-轻链可变(VL)结构域编码核酸，-人Ig-κ恒定区编码核酸，和-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。实施例2抗洋地黄毒苷抗体的重组生成抗体在F17培养基(InvitrogenCorp.)中培养的瞬时转染的HEK293细胞(衍生自人胚肾细胞系293)中产生。对于如实施例1中所述的各个载体的转染，使用“293-Free”转染试剂(Novagen)。从各个表达质粒表达抗体。如制造商的说明所述进行转染。在转染3至7天后收获含有重组抗体的细胞培养上清液。将上清液在降低的温度(例如-80℃)下储存直至纯化。关于人免疫球蛋白在，例如HEK293细胞中重组表达的一般信息在Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。实施例3重组抗洋地黄毒苷抗体的纯化过滤含抗体的培养上清液，并通过两个色谱法步骤纯化。使用PBS(1mMKH2PO4，10mMNa2HPO4，137mMNaCl，2.7mMKCl)，pH7.4平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GEHealthcare)、通过亲和色谱法捕获抗体。通过用平衡缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质，并用25mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.1回收抗体，洗脱后用1MTris-碱，pH9.0将其立即调节至pH6.0。Superdex200TM(GEHealthcare)上的尺寸排阻色谱法用作第二纯化步骤。尺寸排阻色谱在20mM组氨酸缓冲液、0.14MNaCl，pH6.0中进行。将含有抗体的溶液用配备有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL离心过滤器单元(Millipore，Billerica，MA，USA)浓缩并储存在-80℃。实施例4用于乌司奴单抗和布雷奴单抗的重组表达载体的生成乌司奴单抗：CNTO1275，StelaraTM，CAS登记号815610-63-0布雷奴单抗：ABT874，J695，OzespaTM，SEQIDNO：36，WO2001/014162为了表达上述抗体，使用基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA结构或基于具有CMV启动子的基因组结构的瞬时表达(例如在HEK293-F中)的表达质粒。除了抗体表达盒之外，质粒包含：-允许该质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，和-来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因，作为真核细胞中的选择性标记物。抗体基因的转录单元由以下元件组成：-在5'端的独特限制性位点-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，-在cDNA结构的情况下随后是内含子A序列，-人抗体基因的5'-非翻译区，-免疫球蛋白重链信号序列，-作为cDNA或基因组结构的人抗体链，具有免疫球蛋白外显子-内含子结构-具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，和-在3'末端的独特限制性位点。通过PCR和/或基因合成、并通过已知的重组方法和技术通过连接相应的核酸区段组装(例如使用各质粒中独特的限制性位点)，产生包含抗体链的融合基因。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染，通过从转化的大肠杆菌培养物制备质粒来制备更大量的质粒(NucleobondAX，Macherey-Nagel)。实施例5乌司奴单抗和布雷奴单抗的重组生产如CurrentProtocolsinCellBiology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.andYamada,K.M.(eds.),JohnWiley&Sons,Inc中所述使用标准细胞培养技术。通过使用HEK293-F系统(Invitrogen)根据制造商的说明用各质粒(例如编码重链，以及相应的轻链)瞬时转染产生抗体。简言之，在摇瓶中或在搅拌发酵罐中、在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用各表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以1×106个细胞/mL的密度接种在600mL中，并在120rpm，8％CO2孵育。第二天细胞以ca.1.5×106个细胞/mL的细胞密度转染ca.42mL的A)20mLOpti-MEM(Invitrogen)，含有600μg编码各重链和等摩尔比的相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)和B)20mlOpti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2μL/mL)的混合物。根据葡萄糖消耗，在发酵过程中加入葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，从上清液中直接纯化抗体或冷冻并保存上清液。实施例6重组乌司奴单抗和布雷奴单抗的纯化通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(GEHealthcare，Sweden)的亲和色谱法、使用butyl-Sepharose(GEHealthcare,Sweden)的疏水相互作用色谱法和Superdex200尺寸排阻(GEHealthcare，Sweden)色谱法，从细胞培养上清液中纯化抗体。简言之，在用PBS缓冲液(10mMNa2HPO4，1mMKH2PO4，137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤，用25mM柠檬酸钠pH3.0洗脱。合并洗脱的抗体级分，并用2MTris(pH9.0)中和。通过添加1.6M硫酸铵溶液至0.8M硫酸铵的终浓度、并使用乙酸将pH调节至pH5.0来制备用于疏水相互作用色谱法的抗体池。用35mM乙酸钠、0.8M硫酸铵，pH5.0平衡butyl-Sepharose树脂后，将抗体加到树脂上，用平衡缓冲液洗涤，用线性梯度洗脱至35mM乙酸钠pH5.0。合并含有抗体的级分，并通过使用20mM组氨酸、140mMNaCl，pH6.0平衡的Superdex20026/60GL(GEHealthcare，Sweden)柱的尺寸排阻色谱法进一步纯化。合并含有抗体的级分，使用Vivaspin超滤装置(SartoriusStedimBiotechS.A.，France)浓缩至所需浓度并储存于-80℃。表：抗体的产率在每个纯化步骤后，使用微流体Labchip技术(CaliperLifeScience，USA)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。使用HTProteinExpressReagent试剂盒根据制造商的说明制备5μl蛋白质溶液用于CE-SDS分析，并使用HTProteinExpressChip在LabChipGXII系统上分析。使用LabChipGX软件分析数据。实施例7FcRn在HEK293细胞中的表达通过用包含FcRn的编码序列(SEQIDNO：09)和β-2-微球蛋白的编码序列(SEQIDNO：10)的两种质粒转染HEK293细胞，瞬时表达FcRn。将转染的细胞在摇瓶中在36.5℃、120rpm(振荡器振幅5cm)、80％湿度和7％CO2下培养。将细胞每2-3天稀释至3至4×105个细胞/ml的密度。为了瞬时表达，用8L培养体积在36.5℃，pH7.0±0.2，pO235％(用N2和空气充气，总气流200mlmin-1)下、以14L不锈钢生物反应器开始，搅拌器速度为100-400rpm。当细胞密度达到20×105个细胞/ml时，在400mlOpti-MEM(Invitrogen)中稀释10mg质粒DNA(等摩尔量的两种质粒)。将20ml293fectin(Invitrogen)加入到该混合物中，然后将其在室温下孵育15分钟，随后转移到发酵罐中。从第二天起，以连续模式向细胞补充营养物：以每天500ml的速率加入进料溶液，并根据需要使葡萄糖保持高于2g/l的水平。在转染后7天使用具有1L桶的摆式离心机收获上清液：4000rpm持续90分钟。通过SartobranP过滤器(0.45μm+0.2μm，Sartorius)过滤上清液(13μL)，并从中纯化FcRnβ-2-微球蛋白复合物。实施例8通过MS表征单克隆抗体和FcRn对使用0.5MTCEP(Perbio，Bonn，Germany)在4M盐酸胍溶液中在37℃下持续30分钟还原和变性的50μg单克隆抗体或FcRn进行还原的完整质谱分析。样品通过尺寸排阻色谱法(SephadexG-25，用含2％甲酸(v/v)的40％乙腈等度洗脱)脱盐。在装备有TriversaNanoMate(Advion，Ithaca，USA)的Q-TOF仪器(MaXis，Bruker，Germany)上记录ESI质谱。对于数据评估，使用内部开发的软件。通过加入0.4MTris，8M盐酸胍，pH8和0.24MDTT、在37℃下持续1小时使化合物变性，并通过加入0.6M碘乙酸水溶液、在室温下在黑暗中持续15分钟烷基化，来进行单克隆抗体和FcRn(250μg)的肽图绘制。使用NAP5SephadexG-25DNA级柱(GEHealthcare，Munich，Germany)将样品缓冲交换为50mMTris/HCl，pH7.5。用胰蛋白酶(Promega，Mannheim，Germany)在37℃消化5小时(酶与底物的比率为1:37)。注射获得的肽混合物并使用反相U-HPLC(NanoAcquity，WatersGmbH，Eschborn，Germany)分离而无需预处理。来自Waters的AcquityUPLCBEHC18柱(1×150mm，1.7μm粒径，孔径)用于分离。溶剂是在水(A)和乙腈(B)(SigmaAldrich，Munich，Germany)中的0.1％(v/v)甲酸。60μl/min、1至40％B的线性梯度在50℃运行120分钟。通过UPLC系统结合LTQOrbitrapXL串联质谱仪(ThermoFisherScientific，Dreieich，Germany)、通过TriversaNanoMate界面(Advion，Ithaca，USA)以正离子模式操作进行质量分析。实施例9氢/氘交换质谱法(HDX-MS)使用以下样品设置进行HDX-MS实验：将具有和不具有FcRn(112pmol/μl)的单克隆抗体(73pmol/μl)混合并稀释在含有50mM磷酸钠、50mMNaCl，pH6.5的D2O(99.9原子％氘)中至最终氘含量90％，抗体浓度为1.2pmol/μl，FcRn为8.96pmol/μl(84％抗体结合，1：2的IgG1：FcRn结合比)。理论计算基于IgG1-FcRn相互作用的KD为0.6μM，用D2O稀释后的最终体积为25μl。15分钟后，预孵育样品，在室温下开始氘标记不同的时间间隔：0分钟、1分钟、1小时、2.5小时和5小时。在每个时间间隔，从标记混合物中移除30pmol靶蛋白的等分试样(25μl)，并在25μl50mM磷酸钠、50mMNaCl，pH6.5和50μl0.5MTCEP、6M盐酸胍的磷酸溶液(pH2.3)的冰冷混合物中淬灭至最终pH为2.5，并冷冻至-80℃，直到LC-MS分析。通过在6M氘化的盐酸胍(最终氘含量为90原子％)中过夜孵育来制备完全氘化的样品。将猝灭的氘化蛋白(30pmol)加载到结合混合Q-TOFSynaptG2质谱仪(Waters，Milford，USA)的冷的HDX-UPLC系统上。UPLC系统在0℃操作并配备有带有60μl内部体积的内部包装的胃蛋白酶柱(IDEX，OakHarbor，USA)，其包含固定在琼脂糖上的胃蛋白酶(ThermoScientificPierce，Rockford，USA)、捕获C18柱(ACQUITYUPLCBEHC181.7μmVanGuard柱(Waters,Milford,USA))和分析C18柱(ACQUITYUPLCBEHC181.7μm,1x100mm柱(Waters,Milford,USA))。蛋白质在20℃的温度下顺序消化，并在捕获柱上以200μl流动相A(0.23％FA)的流速脱盐。胃酶解肽从捕获柱洗脱，并以40μl/分钟的流速、以8％到40％流动相B的7分钟梯度(ACN，0.23％FA)通过分析柱，进入质谱仪用于质量分析。ESI源以正离子模式操作，仪器能够用于离子迁移率分析。获得的Glu-Fibrinopeptide(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)的lock-spray参考信号用于内部校准。通过MSe、HDMSe和DDAMS/MS的组合进行肽的鉴定。通过在PLGS版本2.5中的数据库搜索进行肽鉴定，HDX-MS数据在DynamX版本2.2.1中处理。如果完全氘化抗体肽的回交相似(低于7％)，则重叠肽的HDX-MS数据仅用于将氘摄取定位到较小的片段(Sheff,J.,等人,J.Am.Soc.MassSpectrom.24(2013)1006-1015)。实施例10氢/氘交换质谱与ETD通过与前述实施例相同的步骤制备氘化样品，除了将注射量调节至100pmol抗体，并且使用在D2O缓冲液中的5倍稀释(至最终80原子％氘)，导致在标记期间抗体浓度为4pmol/μl和FcRn浓度为14pmol/μl和85％的结合抗体。以靶向方式对选择的抗体肽片段进行HDX-ETD，所述片段在FcRn结合和未结合状态之间具有差异氘摄取。ESI源和源T波在针对最小H/D加扰而优化的设置下操作，如Rand,K.D.,等人(J.Am.Soc.MassSpectrom.22(2011)1784-1793)所述，具有以下参数：毛细管电压2.8kV，去溶剂化气体流量800L/h，锥形气体流量0L/h，源温度90℃，去溶剂化气体温度300℃，取样锥20V，萃取锥2V，T波捕获波速度300m/s，波高0.2V。在捕获T波中使用1,4-二氰基苯(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)作为ETD试剂进行ETD。储存在密封容器中的试剂晶体上使用20ml/min的氮气补充流将1,4-二氰基苯引入到阴离子源中。通过辉光放电以40μA的电流产生自由基阴离子，并补充20ml/min的气流。通过测定c型和z型ETD片段离子的平均质量来分析ETD数据。通过从氘化样品的氘含量中减去未标记的产物离子的氘含量计算氘含量。通过监测记录的来自完全氘化抗体样品的胃酶解肽ETD光谱中从带电还原物质损失的氨，证实不存在H/D加扰，如Rand,K.D.,等人(Anal.Chem.82(2010)9755-9762)所述。当前第1页1 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