使用核苷酸可逆终止子的离子传感器DNA和RNA合成测序的制作方法

技术特征：

1.在溶液中确定单链DNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入了引物以形成DNA延伸产物，其中(i)如果所述dNTP类似物已并入引物，根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中的核苷酸残基的身份，以及(ii)如果氢离子浓度没有变化，重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份。

2.在溶液中确定单链DNA中连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过检测溶液的氢离子浓度的增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入，其中氢离子浓度的增加表明所述dNTP类似物已经并入引物以形成DNA延伸产物，如果溶液的氢离子浓度增加，则根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中的核苷酸残基的身份，并且其中氢离子浓度没有变化表明在步骤(a)中所述dNTP类似物没有并入引物中；

(c)如果在步骤(b)中未检测到氢离子浓度的变化，重复进行步骤(a)和(b)，其中在针对正被测定身份的指定核苷酸残基的步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与针对所述核苷酸残基的步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份；

(d)如果已检测到氢离子浓度的增加并且并入了dNTP类似物，则随后处理并入的dNTP核苷酸类似物以便用H原子代替其R'基团，从而在DNA延伸产物的3'端提供3'OH基团；以及

(e)根据需要，对待测序的单链DNA的连续核苷酸残基的每个核苷酸残基重复进行步骤(a)至(d)，除了：在步骤(a)的每个重复中，(i)dNTP类似物并入由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中，并且(ii)dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，从而形成随后的DNA延伸产物；条件是对于待测序的最后一个核苷酸残基，步骤(d)是任选的，

由此确定所述单链DNA的连续核苷酸残基中每一个核苷酸残基的身份，从而确定所述DNA的连续核苷酸残基的序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中R'为-CH₂N₃；其中R'为取代烃基且为硝基苄基；其中R'为2-硝基苄基；或者其中R'为烃基且为烯丙基(-CH₂-CH＝CH₂)。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在每个dNTP类似物中，R'具有以下结构：

其中R^x独立地为质量小于300道尔顿的取代或未取代的C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基，或为H，其中波浪线表示与3'氧原子的连接点；或其中R'具有以下结构：

其中波浪线表示与3'氧原子的连接点。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述DNA在设置在传感器上的反应室内的溶液中，所述传感器(i)形成在半导体衬底中，并且(ii)包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置为用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反应室是设置在传感器阵列上的多个反应室之一，所述传感器阵列形成于半导体衬底中且包括多个传感器，每个反应室设置在至少一个传感器上，且阵列中的每个传感器包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置为用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阵列的每个所述传感器占据100μm或更小的面积并具有10μm或更小的间距，并且其中每个所述反应室具有1μm³至1500μm³范围内的容积；或其中每个所述反应室容纳溶液中的至少10⁵个单链DNA拷贝。

8.根据权利要求6和7中任一项所述的方法，其中所述多个反应室和所述多个传感器各自的数目均大于256,000。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述溶液中的单链DNA被连接至固体基质；其中所述溶液中的引物被连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质且是叠氮基官能化的；其中所述DNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用连接至固体基质；其中所述DNA或引物是炔标记的；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为以下形式：芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、基质、多孔纳米管或柱；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃、尼龙或金刚石；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质是附着有或浸渍有金属或金属组合的多孔非金属物质；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质；或其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质，所述第二固体基质为芯片。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中1×10⁹个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中2×10⁷个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁶个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁴个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1,000个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中10,000个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1×10⁹个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述DNA或引物隔开在独立的隔室、孔或固体表面上的凹陷中。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其在多个单链DNA上平行进行，并且其中任选地所述单链DNA是具有相同序列的模板。

14.根据权利要求13所述的方法，其还包括在步骤(b)或(c)中已确定核苷酸残基的残基后，视情况使所述多个单链DNA或模板与双脱氧核苷三磷酸接触，从而永久地封闭任何未延伸的引物或未延伸的DNA延伸产物，所述双脱氧核苷三磷酸与已被鉴定的核苷酸残基互补。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前从DNA样品扩增单链DNA；并且其中任选地通过聚合酶链式反应扩增单链DNA。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中紫外光用于处理并入引物或DNA延伸产物的dNTP类似物的R'基团，以便光化学裂解连接到3'-O的部分从而用3'-OH代替3'-O-R'；其中所述部分任选为2-硝基苄基部分。

17.在溶液中确定单链RNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的RNA引物的单链RNA与聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述rNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与RNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述聚合酶催化将所述rNTP类似物并入至所述RNA引物中从而形成RNA延伸产物，其中(1)rNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述rNTP类似物是否并入了RNA引物以形成RNA延伸产物，其中(i)如果所述rNTP类似物已并入RNA引物，根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，以及

(ii)如果氢离子浓度没有变化，则重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，rNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中rNTP类似物的碱基的类型不同，直到rNTP类似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸产物，并根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中核苷酸残基的身份。

18.在溶液中确定单链RNA中连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的RNA引物的单链RNA与RNA聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述rNTP类似物与所述单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述RNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述RAN聚合酶催化将所述rNTP类似物并入至所述RNA引物中从而形成RNA延伸产物，其中(1)所述rNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过检测溶液的氢离子浓度的增加来确定在步骤(a)中所述rNTP类似物是否并入，其中氢离子浓度的增加表明所述rNTP类似物已经并入RNA引物以形成RNA延伸产物，如果溶液的氢离子浓度增加，则根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，并且其中氢离子浓度没有变化表明在步骤(a)中rNTP类似物没有并入RNA引物中；

(c)如果在步骤(b)中未检测到氢离子浓度的变化，重复进行步骤(a)和(b)，其中在针对正被测定身份的指定核苷酸残基的步骤(a)的每次重复中，rNTP类似物包含的碱基的类型与针对所述核苷酸残基的步骤(a)的每次在前重复中rNTP类似物的碱基的类型不同，直到rNTP类似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸产物，并根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中核苷酸残基的身份；

(d)如果已检测到氢离子浓度的增加并且并入了rNTP类似物，则随后处理并入的rNTP核苷酸类似物以便用H原子代替其R'基团，从而在RNA延伸产物的3'端提供3'OH基团；以及

(e)根据需要，对待测序的单链RNA的连续核苷酸残基的每个核苷酸残基重复进行步骤(a)至(d)，除了：在步骤(a)的每次重复中，(i)rNTP类似物并入由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的RNA延伸产物中，并且(ii)rNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的RNA延伸产物中的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，从而形成随后的RNA延伸产物；条件为对于待测序的最后一个核苷酸残基，步骤(d)是任选的，

由此确定所述单链RNA的连续核苷酸残基中每个核苷酸残基的身份，从而确定所述RNA的连续核苷酸残基的序列。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中R'为-CH₂N₃；其中R'为取代烃基且为硝基苄基；其中R'为2-硝基苄基；或者其中R'为烃基且为烯丙基(-CH₂-CH＝CH₂)。

20.根据权利要求17或18所述的方法，其中在每个rNTP类似物中，R'具有以下结构：

其中R^x独立地为质量小于300道尔顿的取代或未取代的C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基，或为H，其中波浪线表示与3'氧原子的连接点；或其中R'具有以下结构：

其中波浪线表示与3'氧原子的连接点。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述RNA在设置在传感器上的反应室内的溶液中，所述传感器(i)形成在半导体衬底中，并且(ii)包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或RNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述反应室是设置在传感器阵列上的多个反应室之一，所述传感器阵列形成于半导体衬底中且包括多个传感器，每个反应室设置在至少一个传感器上，且阵列中的每个传感器包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或RNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述阵列的每个所述传感器占据100μm或更小的面积并具有10μm或更小的间距，并且其中每个所述反应室具有1μm³至1500μm³范围内的容积；或其中每个所述反应室容纳溶液中的至少10⁵个单链DNA拷贝。

24.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中所述多个反应室和所述多个传感器各自的数目均大于256,000。

25.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述溶液中的单链RNA被连接至固体基质；其中所述溶液中的引物被连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质且是叠氮基官能化的；其中所述RNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用连接至固体基质；其中所述RNA或引物是炔标记的；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为以下形式：芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、基质、多孔纳米管或柱；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃、尼龙或金刚石；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质是附着有或浸渍有金属或金属组合的多孔非金属物质；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质；或其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质，所述第二固体基质为芯片。

26.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中1×10⁹个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中2×10⁷个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁶个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁴个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1,000个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质。

27.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中10,000个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1×10⁹个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质。

28.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述RNA或引物被分隔在独立的隔室、孔或固体表面上的凹陷中。

29.根据权利要求17-28中任一项所述的方法，其在多个单链RNA上平行进行，并且其中任选地所述单链RNA是具有相同序列的模板。

30.根据权利要求29所述的方法，其还包括在步骤(b)或(c)中已确定核苷酸残基的残基后，视情况使所述多个单链RNA或模板与双脱氧核苷三磷酸接触，从而永久地封闭任何未延伸的引物或未延伸的RNA延伸产物，所述双脱氧核苷三磷酸与已被鉴定的核苷酸残基互补。

31.根据权利要求29或30中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前从RNA样品扩增单链RNA；并且其中任选地通过聚合酶链式反应扩增单链RNA。

32.根据权利要求17-31中任一项所述的方法，其中紫外光用于处理被并入至引物或RNA延伸产物中的rNTP类似物的R'基团，以便光化学裂解连接到3'-O的部分从而用3'-OH代替3'-O-R'；其中所述部分任选为2-硝基苄基部分。

33.在溶液中确定单链RNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的DNA引物的单链RNA与逆转录酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与DNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述逆转录酶催化将所述dNTP类似物并入至所述DNA引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入了DNA引物以形成DNA延伸产物，其中(i)如果所述dNTP类似物已并入DNA引物，根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，以及

(ii)如果氢离子浓度没有变化，重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入DNA引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份。

34.在溶液中测定单链RNA的连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：

(a)使具有与其一部分杂交的DNA引物的单链RNA与逆转录酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与DNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述逆转录酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：

其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH₂N₃或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及

(b)通过检测溶液的氢离子浓度的增加来确定在步骤(a)中dNTP类似物是否并入，其中氢离子浓度的增加表明所述dNTP类似物已经并入DNA引物以形成DNA延伸产物，如果溶液的氢离子浓度增加，则根据并入的dNTP类似物的身份确定单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，并且其中氢离子浓度没有变化表明在步骤(a)中dNTP类似物没有被并入至DNA引物中；

(c)如果在步骤(b)中未检测到氢离子浓度的变化，重复进行步骤(a)和(b)，其中在针对正被测定身份的指定核苷酸残基的步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与针对所述核苷酸残基的步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入DNA引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份；

(d)如果已检测到氢离子浓度的增加并且并入了dNTP类似物，则随后处理并入的dNTP类似物以便用H原子代替其R'基团，从而在DNA延伸产物的3'端提供3'OH基团；以及

(e)根据需要，对待测序的单链RNA的连续核苷酸残基的每个核苷酸残基重复进行步骤(a)至(d)，除了：在步骤(a)的每次重复中，(i)dNTP类似物并入由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中，并且(ii)dNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，从而形成随后的DNA延伸产物；条件为对于待测序的最后一个核苷酸残基，步骤(d)是任选的，

由此确定所述单链RNA的连续核苷酸残基中每个核苷酸残基的身份，从而确定所述RNA的连续核苷酸残基的序列。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中R'为-CH₂N₃；其中R'为取代烃基且为硝基苄基；其中R'为2-硝基苄基；或者其中R'为烃基且为烯丙基(-CH₂-CH＝CH₂)。

36.根据权利要求33或34所述的方法，其中在每个dNTP类似物中，R'具有以下结构：

其中R^x独立地为质量小于300道尔顿的取代或未取代的C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基，或为H，其中波浪线表示与3'氧原子的连接点；或其中R'具有以下结构：

其中波浪线表示与3'氧原子的连接点。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述RNA在设置在传感器上的反应室内的溶液中，所述传感器(i)形成在半导体衬底中，并且(ii)包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述反应室是设置在传感器阵列上的多个反应室之一，所述传感器阵列形成于半导体衬底中且包括多个传感器，每个反应室设置在至少一个传感器上，且阵列中的每个传感器包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述阵列的每个所述传感器占据100μm或更小的面积并具有10μm或更小的间距，并且其中每个所述反应室具有1μm³至1500μm³范围内的容积；或其中每个所述反应室容纳溶液中的至少10⁵个单链RNA拷贝。

40.根据权利要求38和39中任一项所述的方法，其中所述多个反应室和所述多个传感器各自的数目均大于256,000。

41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述溶液中的单链RNA被连接至固体基质；其中所述溶液中的引物被连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质；其中所述单链RNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质且是叠氮基官能化的；其中所述RNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用连接至固体基质；其中所述RNA或引物是炔标记的；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为以下形式：芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、基质、多孔纳米管或柱；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃、尼龙或金刚石；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质是附着有或浸渍有金属或金属组合的多孔非金属物质；其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质；或其中所述RNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又连接至第二固体基质，所述第二固体基质为芯片。

42.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中1×10⁹个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中2×10⁷个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁶个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁴个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1,000个或更少的RNA或引物拷贝被连接至固体基质。

43.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中10,000个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁷个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×10⁸个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1×10⁹个或更多的RNA或引物拷贝被连接至固体基质。

44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述RNA或引物被分隔在独立的隔室、孔或固体表面上的凹陷中。

45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其在多个单链RNA上平行进行，并且其中任选地所述单链RNA是具有相同序列的模板。

46.根据权利要求45所述的方法，其还包括在步骤(b)或(c)中已确定核苷酸残基的残基后，视情况使所述多个单链RNA或模板与双脱氧核苷三磷酸接触，从而永久地封闭任何未延伸的引物或未延伸的DNA延伸产物，所述双脱氧核苷三磷酸与已被鉴定的核苷酸残基互补。

47.根据权利要求45和46中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前从RNA样品扩增单链RNA；并且其中任选地通过聚合酶链式反应扩增单链RNA。

48.根据权利要求33-47中任一项所述的方法，其中紫外光用于处理并入引物或DNA延伸产物的dNTP类似物的R'基团，以便光化学裂解连接到3'-O的部分从而用3'-OH代替3'-O-R'；其中所述部分任选为2-硝基苄基部分。