针对神经毡蛋白1的抗体及其用途的制作方法
本发明涉及与神经毡蛋白1(neuropilin1,nrp1)结合的抗体或其抗原结合片段、编码它们的核酸、包含所述核酸的载体、用所述载体转化的细胞、用于制备所述抗体或其抗原结合片段的方法、包含所述抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物和其用于预防或治疗癌症的组合物。
背景技术：
神经毡蛋白(nrp)包括nrp1和nrp2，其最初发现于神经细胞中。已知nrp1由约923个氨基酸组成且nrp2由约926个氨基酸组成。此外，其具有共同的相似结构域结构且因此具有总计44％的氨基酸同源性。
已知nrp1为与信号素3a配体结合的受体，其作为丛蛋白辅助受体发挥作用以调整轴突诱导。已发现nrp1与血管内皮生长因子(vegf)配体家族成员结合且因此介导血管生成。
多种生理过程和病理过程都通过血管系统的发展而发生。血液必须充足补给至活跃生长的组织诸如肿瘤。这些组织通常产生促进新血管生成和维持的促血管生成因子进而通过血管生成补给血液。血管生成并非简单的过程，其通过下述步骤实现：a)从现有内皮细胞(ec)增殖或分化内皮细胞；b)内皮细胞迁移并合生(coalesce)以形成索(cord)样结构；c)血管索进行小管形成并形成在中心形成具有腔的血管；d)现有的索或血管芽开始形成二级血管；e)原始丛继续进一步的再次生长和再次生成；和f)内皮细胞置于内皮管从而为血管提供维持和调整功能(这些细胞包括小毛细血管情况中的周皮细胞、大血管情况中的平滑肌细胞和心脏中的心肌细胞)。
已知nrp1在多种人肿瘤细胞系和人肿瘤(诸如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、睾丸癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌和前列腺癌)中表达。还已知nrp1参与vegf和信号素对癌细胞增殖、存活和转移的效应。此外，已知根据nrp1表达的程度，癌症进展的程度增加或癌症患者的预后差。
当肿瘤生长时，血管生成在增生(hyperplasia)转化为瘤形成(neoplasia)过程中至关重要且在向肿瘤生长和转移提供营养的过程中起关键作用。新生血管允许肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势和增殖自主性。由于距可用的毛细血管层的距离，肿瘤通常始于仅可以数立方毫米增殖的单异常细胞且可长时间停滞在“潜伏(latent)”状态而无进一步生长或传播。随后，一些肿瘤细胞转化成为血管生成表型，活化内皮细胞并增殖且成熟为新的毛细血管。这些新形成的血管不仅允许原发性肿瘤连续生长，还传播并重新定植转移性肿瘤细胞。
在这方面，需要能够以高特异性与nrp1结合并抑制癌细胞生长的抗nrp1抗体进而治疗其中nrp1过表达的癌症。
治疗性抗体的市场预期以11.8％的年平均速率生长，在2017年将达到899亿美元，其中癌症治疗为最大贡献者。目前，260家生物技术公司正在开发约700种治疗性抗体，其中220种抗体在临床试验中(gabilondoandlarrick,2000)。在过去的15年间，已开发了多种抗体，其特异性靶向癌细胞中高表达或突变的抗原，且已施用至具有血液或实体肿瘤的患者。
在这些技术背景下，本申请的发明人寻求开发用于化疗的抗体，其与已知在多种癌症中表达的nrp1结合并内化入细胞。结果是，本发明的发明人使用噬菌体展示技术开发了以高特异性与nrp1结合并内化入细胞的抗nrp1抗体，并确认了这样的抗nrp1抗体可显著抑制癌细胞的运动，由此完成本发明。
背景部分的上述信息目的仅在于加强对本发明背景的理解，且因此本发明可排除本领域的技术人员已知的现有技术中的信息。
技术实现要素：
本发明的目的是提供与nrp1结合的新颖抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一目的是提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
本发明另一目的是提供包含所述核酸的载体、用所述载体转化的细胞和用于制备它们的方法。
本发明的另一目的是提供包含所述抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物。
本发明的另一目的是提供用于预防或治疗癌症的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物。
为实现上述目的，本发明提供nrp1(神经毡蛋白1)的抗体或其抗原结合片段，其与表达在细胞表面上的nrp1结合并内化入细胞。
本发明进一步提供编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸。
本发明进一步提供包含所述核酸的载体。
本发明进一步提供用所述载体转化的细胞。
本发明进一步提供生产所述抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤：(a)培养所述细胞；和(b)从所述培养的细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供包含所述抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物。
本发明进一步提供用于预防或治疗癌症的包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物。
附图简述
图1显示了过表达nrp1的患者衍生细胞的facs分析结果。
图2显示了用于鉴定抗nrp1scfv抗体片段的噬菌体展示筛选的结果。
图3显示了41种与人nrp1结合的scfv抗体片段的结合亲和力。
图4是用于生成scfv抗体片段的噬菌粒载体的示意图。
图5显示了每种纯化的scfv抗体片段的考马斯染色结果。
图6显示了阐明三种抗nrp1scfv抗体对nrp1的结合亲和力的elisa结果。
图7显示了阐明依据三种抗nrp1抗体片段的浓度对nrp1的结合亲和力的elisa结果。
图8显示了阐明通过spr分析三种抗nrp1scfv抗体的kd值的结果。
图9显示了阐明抗nrp1scfv抗体片段对nrp1过表达的患者衍生细胞的结合亲和力的facs分析结果。
图10a-10c是通过共聚焦激光扫描显微镜获得的图像，其显示三种抗nrp1scfv抗体的内化功能。
图11显示了使用u87mg细胞系的抗nrp1scfv抗体片段抑制细胞迁移的结果。
图12显示了三种抗nrp1igg抗体的生成纯度。
图13显示了三种抗nrp1igg抗体的内毒素测试结果。
图14显示了使用elisa测量抗nrp1igg的kd值的结果。
图15显示了测量三种抗nrp1igg对人nrp1的特异性结合亲和力的结果。
图16显示了使用活细胞成像的癌细胞特异性内化的结果。
图17显示了使用细胞成像的正常细胞内化的结果。
图18显示了使用facs的癌细胞特异性内化的结果。
图19显示了成胶质细胞瘤皮下模型中ircr-101内化的结果。
图20显示了ircr-101的癌细胞特异性结合能力。
图21显示了ircr-101对成胶质细胞瘤异种移植模型中的癌症特异性nrp1的结合能力。
图22显示了ircr-101对成胶质细胞瘤患者样品中的癌症特异性nrp1的结合能力。
图23显示了使用成胶质细胞瘤细胞系u87mg和患者衍生细胞的细胞迁移抑制能力的结果。
图24显示了ircr-101对成胶质细胞瘤皮下模型中新生血管的抑制性效应的结果。
图25显示了ircr-101治疗涉及的下游信号传导变化的结果。
图26显示了成胶质细胞瘤原位模型中ircr-101的分布。
图27显示了雄性和雌性猴tma的分析结果。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的全部的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同含义。一般而言，本文使用的命名法是本领域公知和常用的。
一方面，本发明涉及针对nrp1(神经毡蛋白1)的抗体或其抗原结合片段，且所述抗体或其抗原结合片段与表达在细胞表面上的nrp1结合并内化入细胞。
本发明的发明人寻求开发用于化疗的抗体，其通过与已知在多种癌症中表达的nrp1结合内化入细胞。结果是，本发明的发明人使用噬菌体展示技术生成了以高亲和力与nrp1结合并内化入细胞的抗nrp1抗体，并确认了这样的抗nrp1抗体可显著抑制癌细胞的迁移。
根据本发明示例性实施方案，已确认本发明的抗nrp1抗体与在癌细胞表面上表达的nrp1结合且随后内化入细胞(参见图10a-10c)。与细胞表面上的nrp1结合并在该位点阻断子信号传输的抗体不同的是，本发明的抗体与细胞表面的nrp1结合且随后进入细胞，进而阻断与nrp1相关的全部信号传输，由此预期将产生巨大的治疗效果。
如本文使用的“神经毡蛋白”或nrp共包括神经毡蛋白-1(nrp1)、神经毡蛋白-2(nrp2)及其同种型和变体。神经毡蛋白是120-130kda的非酪氨酸激酶受体。存在多种nrp-1和nrp-2的剪接变体和可溶性同种型。神经毡蛋白的基本结构包括五个结构域：三个胞外结构域(a1a2、b1b2和c)、一个跨膜结构域和一个细胞质结构域。a1a2结构域与clr和cls(cub)的补体组分同源，其一般包含形成两个二硫桥的四个半胱氨酸残基。b1b2结构域与凝血因子v和viii同源。c结构域的中心部分由于其与安眠蛋白(meprin)、a5和受体酪氨酸磷酸酶μ蛋白的同源性被称为mam。a1a2和b1b2结构域对于配体结合是关键的，而c结构域对于同二聚化或异二聚化是关键的。
“神经毡蛋白-1介导的生物活性”指其中神经毡蛋白-1起实质性作用的生理或病理状况，例如但不限于胚胎神经系统发育或神经细胞再生、血管生成(包括再次血管生成)、肿瘤发生和肿瘤转移过程中的外显子引导。
如本文使用的术语“抗体”意为与nrp1特异性结合的抗nrp1抗体。本发明的范围不仅包括与nrp1特异性结合的完整抗体形式，还包括这种抗体分子的抗原结合片段。
完整的抗体是具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，且每条轻链通过二硫键与重链连接。重链的恒定区具有伽玛(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)类型。亚型具有伽玛1(γ1)、伽玛2(γ2)、伽玛3(γ3)、伽玛4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)类型。轻链的恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)类型。
抗体的抗原结合片段或抗体片段指具有抗原结合功能的片段且包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv等。抗体片段的fab具有包括下述的结构：轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和具有一个抗原结合位点的重链的第一恒定区(ch1)。fab'与fab的区别在于其具有在重链ch1结构域的c末端处的包含一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。当fab'铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键时生成f(ab')2抗体。用于生成具有最小抗体片段(仅具有重链可变区和轻链可变区)的fv片段的重组技术描述于pct国际公开第wo88/10649、wo88/106630、wo88/07085、wo88/07086和wo88/09344号中。两条链的fv在重链可变区和轻链可变区间具有非共价键合。单链fv(scfv)经由肽接头通过共价键或直接在c末端与重链可变区和轻链可变区连接。因此，单链fv(scfv)具有诸如二聚体的结构，其与两条链fv相似。这样的抗体片段可使用蛋白水解酶获得(例如，当使用木瓜蛋白酶切割完整抗体时，可获得fab，且当使用胃蛋白酶切割完整蛋白时，可获得f(ab')2片段)，且其还可通过基因重组技术生成。
根据本发明的示例性实施方案，抗体为fv(例如scfv)形式或完整抗体形式。此外，重链恒定区可选自下述任一种同种型：伽玛(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)。例如，恒定区为γ1(igg1)、γ3(igg3)或γ4(igg4)。轻链恒定区可以是κ或λ类型。
如本文使用的术语“重链”指包含可变区结构域vh和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3的全长重链及其片段，所述可变区结构域vh包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。如本文使用的术语“轻链”指包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl的全长重链及其片段，所述可变区结构域vl包含具有足以赋予对抗原的特异性的可变区序列的氨基酸序列。
本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、多重特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab)'片段、二硫键fv(sdfv)和抗独特型(抗id)抗体或这些抗体的表位结合片段等。
单克隆抗体指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，即除可能以占据群体的个体抗体的痕量存在的天然发生的突变外，它们是相同的。单克隆抗体是高度特异性的且针对单抗原性位点衍生。
“人源化”形式的非人(例如鼠类)抗体是嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多情况中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其已由来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔和非人灵长类)的高变区(供体抗体)的残基替换，其具有特异性、亲和力和保持来自受体高变区残基的能力。
“人抗体”是源自人免疫球蛋白的分子且意为构成抗体的全部氨基酸序列(包括互补决定区和结构区)由人免疫球蛋白组成。
重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体对应的序列部分相同或同源，而剩余的链与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体对应的序列相同或同源。“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这种抗体的片段呈现期望的生物活性。
如本文使用的“抗体可变域”指抗体分子的轻和重链区，其包含互补决定区(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)和框架区(fr)的氨基酸序列。vh指重链的可变域。vl指轻链的可变域。
“互补决定区”(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)指抗体可变域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变域通常具有三个cdr区，称为cdr1、cdr2和cdr3。
“框架区”(fr)是可变域残基而非cdr残基。每个可变域通常具有四个fr，称为fr1、fr2、fr3和fr4。
根据本发明的示例性实施方案，抗体或其抗原结合片段包括如下的重链cdr(互补决定区)和轻链cdr：重链可变区，其包含含有序列seqidno:1或7的序列的互补决定区(cdr)h1、含有序列seqidno:2或8的序列的cdrh2和含有选自序列seqidno:3、9和13的任一种序列的cdrh3；和轻链可变区，其包含含有序列seqidno:4或10的cdrl1、含有选自序列seqidno:5、11和14的任一种序列的cdrl2和含有选自序列seqidno:6、12和15的任一种序列的cdrl3。
根据本发明的示例性实施方案，抗体或其抗原结合片段包含具有如下cdr的重链可变区和轻链可变区：
(i)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别含有序列seqidno:1-3的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区包含分别含有序列seqidno:4-6的cdrl1、cdrl2和cdrl3；
(ii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别含有序列seqidno:7-9的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区包含分别含有序列seqidno:10-12的cdrl1、cdrl2和cdrl3；或
(iii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别含有序列seqidno:7、8和13的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区包含分别含有序列seqidno:10、14和15的cdrl1、cdrl2和cdrl3。
根据本发明的示例性实施方案，抗体或其抗原结合片段可包含含有重链框架区(fr)的重链可变区，所述重链框架区(fr)包含选自序列seqidno:28-33的一种序列。
此处，抗体或其抗原结合片段可包含含有序列编号28的序列的重链fr1、含有序列seqidno:29或30的重链fr2、含有序列seqidno:31或32的重链fr3或含有序列seqidno:33的重链fr4。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含含有轻链框架区(fr)的轻链可变区，所述轻链框架区(fr)包含选自序列seqidno:34-42的一种序列。
此处，抗体或其抗原结合片段可包含含有seqidno:34-36的任一序列的轻链fr1、含有seqidno:37-39的任一序列的轻链fr2、含有seqidno:40或41的序列的轻链fr3或含有seqidno:42的序列的轻链fr4。
根据本发明的示例性实施方案，抗体或其抗原结合片段可包含如下的重链可变区和轻链可变区：
(i)含有seqidno:16的序列的重链可变区和含有seqidno:17的轻链可变区；(ii)含有seqidno:18的序列的重链可变区和含有seqidno:19的轻链可变区；或(iii)含有seqidno:20的序列的重链可变区和含有seqidno:21的轻链可变区。
更具体地，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如下的轻链可变区或重链可变区：
(i)含有seqidno:16的序列的重链可变区和含有seqidno:17的轻链可变区(4f12抗体)；
(ii)含有seqidno:18的序列的重链可变区和含有seqidno:19的轻链可变区(1a03抗体)；或
(iii)含有seqidno:20的序列的重链可变区和含有seqidno:21的轻链可变区(3h10抗体)。
fv片段是包含完整的抗体识别和结合位点的抗体片段。这样的区包括重链可变域和轻链可变域，例如，与scfv基本上紧密共价连接的二聚体。
“fab”片段包含轻链的可变域和恒定域和重链的可变域和第一恒定域(chl)。f(ab')2抗体片段一般包括一对fab片段，所述fab片段通过其靠近其羧基末端的铰链半胱氨酸共价连接。
“单链fv”或“scfv”抗体片段包括抗体的vh和vl结构域。这样的结构域在单多肽链内。fv多肽可进一步包含在vh结构域和vl结构域间的多肽接头进而scfv可形成抗原结合的期望结构。
“噬菌体展示”是用于展示融合蛋白的技术，其通过将突变的多肽和噬菌体(诸如纤维状噬菌体颗粒)表面上的至少一部分衣壳蛋白融合实现。噬菌体展示可用于靶向大的随机化蛋白变体文库以迅速并有效地将以高亲和力与靶抗原结合的序列分类。在噬菌体上展示肽和蛋白文库已用于筛选上百万的多肽以鉴别具有特异性结合性质的多肽。
噬菌体展示技术已为生成并筛选与特异性配体(例如抗原)结合的新颖蛋白提供了有力工具。使用噬菌体展示技术，可生成大的蛋白变体文库并对以高亲和力与靶抗原结合的序列迅速分类。编码突变体多肽的核酸与编码病毒衣壳蛋白(例如基因iii蛋白或基因viii蛋白)的核酸序列融合。已经开发了单价噬菌体展示系统，其中编码蛋白或多肽的核酸序列与编码部分基因iii蛋白的核酸序列融合。在单价噬菌体展示系统中，基因融合以低水平表达，且还表达野生型基因iii蛋白，由此维持颗粒的感染性。
证明肽在纤维状噬菌体表面上的表达和功能性抗体片段在大肠杆菌的外周细胞质中的表达对于发展抗体噬菌体展示文库是重要的。已以多种方式制备抗体或抗原结合多肽的文库，例如通过插入随机dna序列改变单基因或通过克隆相关的基因系。可使用文库筛选具有期望性质的抗体或抗原结合蛋白的表达。
噬菌体展示技术对于生成具有期望性质的抗体具有超越常规杂交瘤和重组方法的数种优势。该技术允许在短时间内生成具有多种序列的大的抗体文库而无需使用动物。杂交瘤或人源化抗体的生成可花费数月生产。此外，由于无需免疫，噬菌体抗体文库可针对有毒或具有低抗原性的抗原生成抗体。噬菌体抗体文库还可用于生成或鉴别新颖的治疗性抗体。
人抗体可从原始b细胞ig所有组成成分(repertoire)或未经免疫或经免疫的人种系序列使用噬菌体展示文库生成。多种淋巴组织可用于制备原始或非免疫抗原结合文库。
用于从噬菌体展示文库鉴别和分离高亲和力抗体的技术对于分离新型治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和力抗体可依赖于文库大小、细菌细胞中的生产效率和文库多样性。文库的大小由于抗体或抗原结合蛋白的不当折叠和终止密码子的存在通过不足生产而减少。当抗体或抗原结合结构域不当折叠时，细菌细胞中的表达可受到抑制。表达可通过交替突变在可变/恒定界面表面上的残基或经选择的cdr残基而增加。框架区的序列是当抗体噬菌体文库在细菌细胞中生成时提供适当折叠的一种元件(element)。
重要的是在高亲和力抗体分离中生成抗体或抗原结合蛋白的多种文库。已发现cdr3区经常参与抗原结合。重链上的cdr3区就大小、序列和结构空间构象而言变化很大，进而可使用cdr3区制备多种文库。
此外，可在每个位置使用全部20种氨基酸通过随机化可变重链和轻链的cdr区产成多样性。使用全部20种氨基酸导致变体抗体序列的变性的增加和鉴别新型抗体机会的增加
在特异性识别nrp1的范围内，本发明的抗体或抗体片段可包括本发明所述的抗nrp1抗体的序列及其生物学等价物。可仅额外修饰抗体的氨基酸序列以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。这样的修饰包括抗体氨基酸序列残基的例如缺失、插入和/或取代。这样的氨基酸变化基于氨基酸侧链取代基的相对相似性诸如疏水性、亲水性、电荷和大小产生。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型，认可的是精氨酸、赖氨酸和组氨酸的每一种是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。基于这些考量，因此发现了精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分别为生物学上的功能等价物。
在引入突变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathicindex)。根据其疏水性和电荷，为每种氨基酸分配了疏水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
疏水性氨基酸指数对于赋予蛋白的交互生物功能非常重要。已知使用具有相似疏水性指数的氨基酸取代可保持相似的生物学活性。当参照疏水性指数引入突变时，在显示疏水指数差异的氨基酸之间生成取代，所述疏水指数差异优选在±2内，更优选在±1内，甚至更优选在±0.5内。
同时，还已知具有相似亲水性值的氨基酸之间的取代导致具有等价生物学活性的蛋白。如美国专利第4,554,101号所公开，将下述亲水性值分配给每个氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
蛋白中不完全改变分子活性的氨基酸取代为本领域已知(h.neurath,r.l.hill,theproteins,academicpress,newyork,1979)。取代最常发生在氨基酸残基例如ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly之间。
考虑具有上述生物学等价活性的突变，本发明的抗体或编码所述抗体的核酸分子应理解为包括与序列表中所述序列展示基本同一性(substantialidentity)的序列。基本同一性意为通过将本发明的序列与任何其他序列尽可能多地进行比对并使用本领域通常使用的算法分析经比对的序列，序列展示至少61％同源性的序列，更优选70％同源性，甚至更优选80％同源性，且最优选90％同源性。序列比较的比对方法为本领域公知。ncbi基本局部比对搜索工具(ncbibasiclocalalignmentsearchtool，blast)可从例如nbci获得且可与互联网上的序列分析程序诸如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx联合使用。blsat可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得。使用该程序比较序列同源性可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html获得。
另一方面，本发明涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
本发明的抗体或其抗原结合片段可通过分离编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸重组生成。分离核酸并将其插入可克隆载体以实现进一步的克隆(dna的扩增)或进一步的表达。以此为基础，本发明涉及包含根据本发明的另一方面的核酸的载体。
“核酸”具有包含dna(gdna和cdna)和rna分子的广泛含义。核酸的基本元件核苷酸包括天然核苷酸以及其中糖或碱基位点经修饰的类似物。编码本发明的重链和轻链可变区的核酸的序列可以是经修饰的。这样的修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。
根据本发明的示例性实施方案，编码抗体或其抗原结合部分的重链可变区的核酸可包含seqidno:22、24或26的序列，且编码轻链可变区的核酸可包含seqidno:23、25或27的序列。
本发明的核酸可理解为包含与所述核苷酸序列呈现基本同一性的核苷酸序列。基本同一性意为通过将本发明的核苷酸序列与任何其他序列尽可能多地进行比对并使用本领域常用的算法分析经比对的序列，核苷酸序列显示至少80％同源性，更优选至少90％同源性，且最优选至少95％同源性。
编码所述抗体的dna可使用常规操作容易地分离或合成(例如，使用能够特异性地与编码抗体的重链和轻链的dna特异性结合的寡核苷酸探针)。可使用多种载体。载体组分一般包括但不限于下述一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
如本文使用的术语“载体”包括质粒载体；黏粒载体；噬菌体载体和病毒载体(例如腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体)作为用于在宿主细胞中表达靶基因的方式。在载体中编码所述抗体的核酸与启动子可操作连接。
“可操作连接”意为核酸表达控制序列(例如启动子阵列、信号序列或转录调节因子结合位点)和另一核酸序列之间的功能性连接，由此控制另一核酸序列的转录和/或翻译。
当将原核细胞用作宿主时，一般包括能够促进转录的强启动子(诸如tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子和t7启动子)、用于初始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。此外，例如当将真核细胞用作宿主时，可使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsvtk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hivltr启动子、eb病毒(ebv)启动子、莫洛尼病毒(moloneyvirus)启动子和劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子)，且一般具有作为转录终止序列的多聚腺苷酸化序列。
任选地，载体可与另一序列融合进而促进由其表达的抗体的纯化。融合的序列包括例如谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia,usa)、麦芽糖结合蛋白(neb,usa)、flag(ibi,usa)和6xhis(hexahistidine；quiagen,usa)。
载体包括本领域通常使用的抗生素抗性基因作为可选择的标记物，且所述抗性基因包括例如针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的基因。
根据本发明的另一方面，提供了以上述载体转化的细胞。用于生成本发明抗体的细胞可以是但不限于原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。
可使用原核宿主细胞，例如属于芽孢杆菌属诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏芸金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)、链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)(例如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida))、奇异变形菌(proteusmirabilis)和葡萄球菌属(staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus))。
同时，对动物细胞的兴趣最大，且有用的宿主细胞系的实例可以是但不限于此：cos-7、bhk、cho、chok1、dxb-11、dg-44、cho/-dhfr、cv1、cos-7、hek293、bhk、tm4、vero、hela、mdck、brl3a、w138、hepg2、sk-hep、mmt、tri、mrc5、fs4、3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6、sp2/0、ns-0、u20s或ht1080。
根据本发明的另一方面，提供了生成抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：(a)培养所述细胞；和(b)从所述培养的细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。
可在多种介质中培养细胞。可将市售介质用作培养基而不受限制。本领域的技术人员已知的全部其他必须补加物(supplement)可以适当浓度包含在内。培养条件例如温度和ph已与用于表达的经选择的宿主细胞一起使用，其对于本领域的技术人员将是显而易见的。
当回收抗体或其抗原结合片段时，可去除杂质，例如通过离心或超滤，且可纯化所得产物，例如通过亲和色谱。可使用其他纯化技术，诸如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和羟基磷灰石色谱。
根据本发明的另一方面，提供了包含所述抗体或其抗原结合片段和药物的抗体-药物缀合物。由于nrp1是在癌细胞表面上过表达的分子，当使用其中药物额外与本发明的抗体结合的抗体-药物缀合物时，可能选择性地仅靶向癌细胞同时最小程度地影响正常细胞。
这样的药物包括化学物质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物制剂和酶抑制剂。例如，本发明的抗体或其片段可直接或间接与抗癌剂结合，所述抗癌剂为例如阿西维辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考达唑(acodazole)、山油柑碱(acronycine)、阿多来新(adozelesin)、阿拉诺新(alanosine)、阿地白介素(aldesleukin)、别嘌醇钠(allopurinolsodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨萘非特(amonafide)、聚肌胞(ampligen)、安吖啶(amsacrine)、雄激素(androgen)、蛇形菌素(anguidine)、氨基乙酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、天冬酰胺酶(asparaginase)、5-阿扎胞苷(5-azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)、三嗪苯酰胺(baker'santifol)、β-2-脱氧硫代鸟苷(beta-2-deoxythioguanosine)、盐酸比生群(bisantrenehcl)、硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)、白消安(busulfan)、丁硫氨酸亚砜(buthioninesulfoximine)、bwa773u82、bw502u83/hcl、bw7u85甲磺酸盐、ceracemide、卡贝替姆(carbetimer)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹喔啉-磺酰胺(chloroquinoxaline-sulfonamide)、氯脲菌素(chlorozotocin)、色霉素a3(chromomycina3)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、皮质类固醇(corticosteroid)、短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)、cpt-11、克立那托(crisnatol)、安西他滨(cyclocytidine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、溴茴丙烯酸钠(cytembena)、dabismaleate、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素d(dactinomycin)、盐酸柔红霉素(daunorubicinhcl)、deazauridine、右雷佐生(dexrazoxane)、二脱水卫矛醇(dianhydrogalactitol)、地吖醌(diaziquone)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、didemninb、乙基二硫代氨甲酸盐/酯(ethyldithiocarbamate)、二甘醇醛(diglycoaldehyde)、二氢-5-氮胞苷(dihydro-5-azacytine)、多柔比星(doxorubicin)、棘霉素(echinomycin)、依达曲沙(dedatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鸟氨酸(eplolnitin)、elliott溶液(elliott'ssolution)、依沙芦星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌莫司汀(estramustinephosphate)、雌激素(estrogen)、依他硝唑(etanidazole)、氨磷汀(ethiofos)、依托泊苷(etoposide)、法倔唑(fadrazole)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维a胺(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黄酮乙酸(flavoneaceticacid)、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)、5'-氟尿嘧啶(5’-fluorouracil)、fluosoltm、氟他胺(flutamide)、硝酸镓(galliumnitrate)、吉西他滨(gemcitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、hepsulfam、六亚甲基双乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、硫酸肼(hydrazinesulfate)、4-羟基雄烯二酮(4-hydroxyandrostenedione)、羟基脲(hydrozyurea)、盐酸伊达比星(idarubicinhcl)、异环磷酰胺(ifosfamide)、4-依波米醇(4-ipomeanole)、异丙铂(iproplatin)、异维a酸(isotretinoin)、亚叶酸钙(leucovorincalcium)、醋酸亮丙立德(leuprolideacetate)、左旋咪唑(levamisole)、柔红霉素脂质体(liposomedaunorubicin)、脂质体包囊的多柔比星(liposomeencapsulateddoxorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、merbarone、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、巯乙磺酸钠(mesna)、卡介苗的甲醇提取物(methanolextractofbacilluscalmette-guerin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、n-甲基甲酰胺(n-methylformamide)、米非司酮(mifepristone)、米托胍腙(mitoguazone)、丝裂霉素-c(mitomycin-c)、米托坦(mitotane)、盐酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)、单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(monocyte/macrophagecolony-stimulatingfactor)、大麻隆(nabilone)、萘福昔定(nafoxidine)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、醋酸奥曲肽(octreotideacetate)、奥马铂(ormaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、pala、喷司他丁(pentostatin)、哌嗪二酮(piperazinedione)、哌泊溴烷(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、盐酸吡罗蒽醌(piroxantronehydrochloride)、pixy-321、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimersodium)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕酮(progestin)、吡唑呋林(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、螺锗(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、舒拉明钠(suraminsodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替尼泊苷(teniposide)、对苯二甲脒(terephthalamidine)、替罗昔隆(teroxirone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、胸苷注射剂(thymidineinjection)、噻唑呋林(tiazofurin)、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、维a酸(tretinoin)、盐酸三氟拉嗪(trifluoperazinehydrochloride)、曲氟尿苷(trifluridine)、三甲曲沙(trimetrexate)、肿瘤坏死因子(tnf)、乌拉莫司汀(uracilmustard)、硫酸长春碱(vinblastinesulfate)、硫酸长春新碱(vincristinesulfate)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春利定(vinzolidine)、yoshi864、佐柔比星(zorubicin)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、依托泊苷(etoposide)、美法仑(melphalan)、紫杉特尔(taxotele)和泰素(taxol)。
根据本发明的另一方面，提供用于预防或治疗癌症的组合物，其包含所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体-药物缀合物作为活性成分。
本发明可以是例如用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含(a)药学上有效量的本发明的与nrp1结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物和(b)药学上可接受的载剂。本发明还涉及用于预防或治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明的与nrp1结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物施用至患者。
由于将本发明的抗nrp1抗体或其抗原结合片段用作活性成分，排除对二者常见的说明从而避免由反复说明引起的本说明书过度的复杂性。
如下文所述的实施例中所证明，本发明的抗nrp1抗体可抑制表达nrp1的癌细胞的迁移(参见图11)。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段以高亲和力与nrp1结合并因此抑制过表达nrp1的癌细胞的运动，从而其可以单独的抗体形式或抗体-药物缀合物的形式用于癌症的预防和治疗。
“预防”意为通过施用本发明的组合物抑制或延迟癌症进展的任何行动，且“治疗”意为抑制癌症的发展、缓解和消除癌症。
所述组合物可应用至作为过表达nrp1的癌症的疾病，例如成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、睾丸癌、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌和前列腺癌。
“过表达nrp1的癌症”指相比于相同组织类型的非癌细胞，在癌细胞表面以显著较高的水平具有nrp1的癌症。
根据本发明的示例性实施方案，组合物用于抑制癌细胞的转移或侵袭。本发明还涉及通过处理本发明的与nrp1结合的抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物用于抑制癌细胞转移或侵袭的方法。可包含在本发明的组合物中的药学上可接受的载剂是制剂中常用的且包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶(acaciarubber)、磷酸钙、海藻酸盐(alginate)、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除所述组分外，本发明的组合物还可进一步包括例如润滑剂、润湿剂、增甜剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
本发明的药物组合物可口服或肠胃外施用。肠胃外施用通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用等实施。
由于口服施用时蛋白或肽被消化，口服的组合物应经配制或活性药物作用剂应经包衣从而防止其在胃中的分解。此外，药物组合物可通过能够将活性物质转移至靶细胞的任何装置施用。
本发明的组合物的适当剂量可取决于下述因素而变化：诸如配制方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和响应。因此，熟练的医师可以容易地确定对于期望治疗或预防有效的剂量并给出处方。例如，本发明的药物组合物的每日剂量为0.0001mg/kg至100mg/kg。如本文使用的术语“药学上有效量”指足以预防或治疗癌症的量。
本发明的药物组合物可根据能够由本发明所属领域的技术人员容易实施的方法使用药学上可接受的载剂和/或赋形剂配制从而以单位剂型生产或在多剂量容器中生产。此处，制剂可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或提取物、谷物、栓剂、粉剂、颗粒、片剂或胶囊的形式，且可额外包括分散剂或稳定剂。
本发明的组合物可作为单独的治疗剂施用或与另一治疗剂组合施用，且可与常规治疗剂依序或同时施用。
实施例
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。实施例仅出于阐述目的，且本领域技术人员将理解的是，本发明的范围不应理解为受到实施例的限制。
实施例1
使用患者衍生的细胞鉴别抗体内化
为筛选细胞淘选(cellpanning)所需的细胞用于鉴别抗nrp1抗体片段，在由项目小组(难治性癌症研究所(instituteforrefractorycancerresearch)，三星医疗中心(samsungmedicalcenter))处理的患者衍生的细胞中，使用荧光活化细胞分选(facs)方法选择具有高nrp1表达水平的细胞。其中，将从三星医疗中心的难治性癌症研究所获得的患者衍生的细胞(其中nrp1在其表面上以最高表达水平表达)用于细胞淘选。患者衍生的细胞的facs分析结果示于图1中。
与人nrp1结合的scfv抗体片段通过噬菌体展示筛选使用先前制备的合成scfv抗体片段噬菌体文库(yangetal.,mol.cells.27:225-235,2009)鉴别。将四种亚文库样品各培养在400ml培养基(sb/氨苄青霉素/2％葡萄糖)中2小时以回收作为噬菌体形式导入大肠杆菌宿主细胞er2537的噬菌粒载体。当在光密度(od)600的吸收为约0.5至约0.7时，通过在5000g离心20分钟去除上清，且随后悬浮于400ml的二级培养基(sb/氨苄青霉素)中。随后，添加1012pfu(噬斑形成单位)的辅助噬菌体(vcsm13)并培养1小时。接下来，添加70μg/ml的卡那霉素抗生素(引入辅助噬菌体中的抗生素基因)并在30℃培养过夜以允许消除宿主细胞外的噬菌体文库。随后，通过离心获得的培养物使用聚乙二醇(peg)溶液仅以噬菌体的形式沉淀以获得噬菌体文库。
将获得的噬菌体文库与患者衍生的细胞(4×106)(其为具有高nrp1表达的患者衍生的细胞)混合以置于共5ml的nba(神经基底介质)中，在4℃于旋转器中固定，且随后360度旋转1小时至2小时。随后，在300g离心细胞5分钟以去除未与患者衍生的细胞结合的噬菌体颗粒，且随后再次通过添加5ml的nba洗涤细胞。重复该步骤4次。在最终步骤中，使用置于具有37℃的温育器的5ml的nba将患者衍生的细胞和噬菌体置于t烧瓶中并在37℃温育30分钟以允许附着至细胞表面的噬菌体颗粒穿过细胞。
随后，将细胞置于15-ml锥形管中，在300g离心5分钟以分离细胞，且随后使用5ml的冷pbs(磷酸缓冲盐水)洗涤。重复洗涤步骤6次。该步骤的频率随细胞淘选数目增加而增加。随后，添加5ml的0.1m甘氨酸(ph2.2)，并将混合物保持在室温5分钟以从细胞表面分离附着在细胞表面的噬菌体颗粒。随后，在300g离心细胞5分钟以仅分离细胞，并添加0.5ml的100mmtea。将细胞转移至e-管并留在室温15分钟。接下来，通过在12,000rpm离心5分钟分离细胞碎片，并通过与1ml的2mtris(ph8)混合中和包含细胞中的噬菌体颗粒的上清。其后，将细胞置于8.5ml包含预温育的er2537的培养基(sb)中，并在37℃于120rpm培养以感染大肠杆菌宿主细胞er2537。其后，将通过在3,000rpm离心15分钟湮没的er2537与500μg的培养基(sb)混合，随后铺展在15cm培养基上。培养后，添加5ml的sb培养基(50％甘油)以回收并储存菌落(-80℃)。为进行反复的细胞淘选，选择1ml先前储存的噬菌体溶液并进行噬菌体颗粒扩增。在宿主细胞er2537中温育后，添加辅助噬菌体以通过peg沉淀分离回收的噬菌体颗粒。以相同的方案将上述用于下一轮的淘选。实施第三轮淘选，且细胞淘选步骤示于图2。确认了淘选后相比于淘选前噬菌体颗粒的比例随重复次数增加而增加。这意味着内化的噬菌体颗粒通过细胞淘选扩增，且结果示于表1中。
[表1]使用患者衍生的细胞的细胞淘选
实施例2
用于选择抗nrp1scfv候选物的elisa和测序分析
通过宿主细胞(er2537)感染将从第3轮细胞淘选回收的噬菌体颗粒确认为培养基中的菌落。选择这些菌落以在包含200μl的sb/氨苄青霉素培养基的96孔板中接种且随后在37℃温育2小时至3小时。
随后，使用1mm终浓度的iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷)处理每孔用于诱导scfv-piii蛋白表达并在30℃培养过夜。在3,000rpm离心培养板15分钟以去除上清。其后，为回收经培养的细胞的周质(periplasm)中的噬菌体颗粒，将40μl的tes溶液(20％w/v蔗糖、50mmtris、1mmedta，ph8.0)置于每孔并留在4℃30分钟从而溶解所述细胞。随后，使用60μl的0.2xtes溶液处理细胞并在4℃温育30分钟以凭借渗透压分解细胞。随后在3,000rpm离心平板15分钟以获得上清scfv-piii蛋白。
将25μl获得的上清添加于每个提前准备的以人nrp1蛋白包覆的96孔板中，随后在室温结合1小时，且随后使用tbst和蒸馏水洗涤6次。随后，获得的产物与hrp-缀合的抗ha抗体(其能够与scfv-piii的ha标签结合)在室温结合1小时且随后使用tbst(0.1％吐温20)和蒸馏水洗涤6次。将tmb溶液用于诱导生色反应。使用h2so4溶液终止生色反应，并在450nm的od测量其值。
分析的克隆总数为384，其中41个克隆(结合效力>2)显示了与人nrp1的高结合能力(参见图3)。作为对照，使用了bsa溶液。在这41个克隆中通过elisa选择了10个具有高结合能力的克隆。随后，从10个克隆回收噬菌粒，并实施dna测序，且选择了具有共6个不同序列的克隆。选择具有不同序列的克隆，除3h10，其与1c08序列相同，且最终将3h10、1a03和4f12克隆选作抗nrp1scfv候选物。3h10、1a03和4f12克隆的氨基酸序列示于表2中。
[表2]
抗nrp1scfv的重链fr/cdr的序列
抗nrp1scfv的轻链fr/cdr的序列
实施例3
抗nrp1scfv的生成和nrp1结合能力的确认
噬菌粒的基本结构示于图4中。在上述实施例中使用的宿主细胞er2537的情况中，scfv不能单独表达，这是由于其抑制位于噬菌体piii前的转录抑制密码子(琥珀密码子(uag))。因此，使用作为非抑制株的表达株(top10f')将噬菌粒转染入表达株。其后，dna序列分析揭示了每种噬菌粒都表达而未表达突变体。将表达株视为菌落，接种入3ml的lb/氨苄青霉素培养基中，并在37℃培养过夜。其后，将3ml的过夜培养物转移至400ml培养基(sb/氨苄青霉素)并在od600培养直至浓度达到0.5至0.7。添加1mm终浓度的iptg并在30℃培养过夜。将培养物离心后，使用40ml的tes溶液溶解表达宿主，且随后添加60ml的0.2xtes以回收周质中的噬菌体颗粒。通过0.45μm过滤器过滤回收的上清。对于his标签纯化，将存在于经过滤的溶液中的scfv蛋白添加至1ml的ni-nta珠粒(qiagen)并在室温结合1小时。其后，产物被包装在重力柱(bio-rad)中并经由200mm咪唑溶液回收。表达和纯化每种克隆后，通过sds-page和考马斯蓝染色确认了scfv的大小为约28kda(参见图5)。
使用经纯化的scfv实施elisa以确认存在与靶nrp1结合的能力。在用200ng的nrp1蛋白包覆的96孔板中和作为对照组的用200ng的bsa包覆的96孔板中，在室温通过elisa(3次重复)在1小时其各以每克隆5μg/ml的浓度结合。其后，使用0.1％tbst洗涤产物三次，使用hrp-缀合的ha抗体处理1小时，再次洗涤，且随后与tmb溶液共同放置5分钟。使用2m硫酸溶液终止显色反应后，测量了od值。
结果是，相比于未与nrp1结合的12bscfv，1a03、3h10和4f12scfv显示了与nrp1特异性结合的能力(参见图6)。
接下来，为根据每种抗体片段的浓度测量与人nrp1的结合能力，将每种scfv以2,000ng/ml、1,000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml或15.62ng/ml的浓度接种至96孔板，所述96孔板中已包覆200ng的nrp1或bsa。随后分析了od值的变化。对于与nrp1的结合能力，12bscfv的od值未根据浓度变化而变化。另一方面，在1a03、3h10和4f12scfvs的情况中，通过od值的变化，确认了相比于bsa与nrp1结合的scfv随浓度的增加而增加(参见图7)。
为精确测量三种scfv抗体片段与nrp1蛋白的结合能力的程度，使用biacoret100(表面等离子体共振(spr)仪器)通过ka和kd值获得了最终的kd值。kd值是通过将kd值除以ka值获得的值。kd值越低，与相应物质的结合能力越大。分析结果是，4f12scfv的kd(m)值最低，为73.60×10-9。1a03scfv的kd(m)值为89.40×10-9，且3h10scfv的kd(m)值为295.4×10-9(参见图8)。
实施例4
使用nrp1过表达细胞系确认抗nrp1scfv的结合能力
通过elisa确认了与人nrp1蛋白的结合能力后，使用具有nrp1高表达的患者衍生的细胞实施了facs分析从而确认了其是否与存在于真实细胞膜中的nrp1结合。
每种scfv在4℃与5×105个患者衍生的细胞结合约1小时且随后使用1ml的facs溶液洗涤3次。随后，使用1μg与红色荧光(pe；藻红蛋白)缀合的ha抗体处理产物，且将其在4℃结合30分钟。使用1ml的facs溶液洗涤产物三次并使用facscaliburtm系统分析。
分析结果是，相比于pe缀合的ha抗体和12b处理的细胞，三种scfv抗体片段诸如1a03、3h10和4f12与nrp1过表达的细胞系特异性结合(参见图9)。
实施例5
抗nrp1scfv进入nrp1过表达的癌细胞中的通透性的确认
对于三种抗nrp1抗体片段，通过细胞免疫荧光染色方法确认了细胞内通透性。将pd-赖氨酸溶液添加至腔室载玻片并在室温包覆1小时至2小时。随后除去溶液后干燥载玻片。其后，用200μl包含5×104个患者衍生的细胞的nba溶液处理载玻片且随后在37℃温育4小时至5小时以将其固定至载玻片。接下来，去除nba溶液，并添加4％的多聚甲醛以将其在4℃固定10分钟。使用pbs洗涤三次后，用0.1％的tritonx-100处理以增加细胞通透性。为了染色nrp1蛋白，同时用抗人nrp1抗体(r&d)和抗nrp1抗体片段处理以在分为15/30/60分钟的时间段内在37℃结合。使用pbs洗涤三次后，使用1％的bsa溶液在室温阻断非特异性结合1小时。作为二抗，以使用绿色荧光(alexa-fluor488)标记的山羊抗小鼠抗体(invitrogen)处理以检查nrp1蛋白，并用抗ha抗体(santacruzbiotechnology)处理以检查抗npr1抗体片段以便在室温结合1小时。最终，实施dapi染色用于核染色。最终洗涤后，在载玻片上固定盖玻片。使用共聚焦扫描显微镜观察结果。
结果是，在全部的三种抗nrp1抗体片段中，与其表面附着的抗nrp1抗体片段和插入细胞的抗nrp1抗体片段在15分钟和30分钟混合。然而，约60分钟过去后，确认了大多数抗nrp1抗体片段穿透进入所插入的细胞(参见图10a至10c)。具体而言，4f12抗体片段而非1a03和3h10抗体根据时间变化呈现了相对高的细胞通透性(参见图10a)。这些结果显示了本发明的抗体可出于将抑制特定蛋白表达的物质或治疗性/诊断性化学药物递送入细胞的目的使用。
实施例6
scfv抗体片段对于nrp1过表达的癌细胞系抑制癌细胞迁移的能力的确认
实施了细胞迁移分析以测试经鉴别的1a03、3h10和4f12scfv抗体片段抑制癌细胞运动的抗癌能力。在实验中，使用了已知高表达nrp1的u87mg细胞系(成胶质细胞瘤细胞系)。将plo(聚-l-鸟氨酸)置于transwell(corning)，并在室温包覆混合物30分钟且随后自然干燥。随后，将5×104个u87mg细胞和三种抗nrp1scfv抗体片段(50μg/ml)置于dmem培养基(不含将放置在transwell中的100μl的生长因子)，将600μl具有10％fbs(胎牛血清)的dmem培养基置于较低的孔。随后在37℃培养细胞过夜。随后，对于12个孔，在每transwell中制备甲醇、苏木精和曙红(600μl)的一种，且随后将transwell置于甲醇中1分钟，随后置于苏木精中5分钟以对核染色。随后，使用水洗涤后，去除水，且随后将transwell置于曙红中30秒以对细胞质染色，随后再次用水洗涤，并使用棉签将transwell的内部擦干净。
图11显示了使用苏木精将核染成了深蓝色且细胞质由曙红染红。如图11所示，当其中抗nrp1scfv抗体片段未处理的对照组视为100％细胞转移时，显示包含1a03抗体片段具有41％的细胞迁移，包含3h10抗体片段的细胞具有46％的细胞迁移，且包含4f12抗体片段的细胞具有29％的细胞迁移。这些结果证明三种抗nrp1抗体片段可用作针对具有nrp1高表达的成胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌等的抗癌剂。
实施例7
抗nrp1scfv向抗nrp1igg的转化
为将抗nrp1抗体片段转化为igg形式，使用expi293f表达系统(lifetechnologies)转染nrp1scfv的重链和轻链序列的基因。为在培养基中获得nrp1igg，使用
通过elisa和spr分析使用三种nrp1抗体针对人nrp1的结合亲和力分析揭示了结合亲和力强的顺序为：1a03、ircr-101和4f12。具体而言，4f12具有0.6nm的kd值，其为目前治疗性抗体的结合亲和力水平(参见图14)。通过相比于其他具有与人nrp1相似的结构的蛋白，分析对人nrp1的特异性结合亲和力的结果是，确认了全部三种nrp1抗体仅与人nrp1结合(参见图15)。
实施例8
使用癌细胞和正常细胞确认癌症特异性内化和结合亲和力
使用
在4℃和37℃(内化温度)比较了彼此间对于正常和癌细胞的结合并通过facs进行了分析。由于在4℃正常细胞和癌细胞中不存在内化，ircr-101和1a03抗体在细胞表面的抗体的量上随时间未显示任何增加或减少。另一方面，确认了细胞表面上抗体的量随时间减少，这是由于其仅在37℃在癌细胞中内化。另一方面，4f12抗体在37℃内化入正常细胞和癌细胞，且细胞表面上抗体的量随时间减少(参见图18)。因此，通过活细胞成像和facs分析确认了ircr-101和1a03抗体各具有癌症特异性内化功能。
通过静脉内注射将对照igg、ircr-101和1a03成胶质细胞瘤注射入皮下模型中。20小时后，将其处死以通过细胞解离分离成为单细胞。随后使用facs在彼此间比较了其对癌细胞的内在性(immanence)。在通过透化(permeabilization)仅筛选内化入癌细胞的抗体的结果中，ircr-101和1a03比对照igg显示了5倍至6倍更高的平均荧光强度(mfi)。还确认了体内模型具有与如上文所述的体外模型相同的癌细胞特异内在性(参见图19)。
在4℃使用ircr-101和nrp1抗体以比较正常细胞和癌细胞之间结合力的差异。在相同的浓度，相比于癌细胞，常规nrp1抗体显示了对正常细胞更大的结合亲和力，而ircr-101显示了癌细胞特异性结合亲和力(参见图20)。
为确认体内模型是否可重复，使用从成胶质细胞瘤异种移植物获得的癌组织分析了ihc(免疫组化)和if(免疫荧光)。常规nrp1抗体显示了与由正常内皮细胞组成的血管的结合力，而ircr-101未与正常内皮细胞结合(参见图21)。还在成胶质细胞瘤患者组织中观察到了该结果(参见图22)。
实施例9
癌细胞迁移和新生血管生长抑制的确认
使用成胶质细胞瘤细胞系u87mg和患者衍生的细胞确认了三种nrp1抗体抑制癌细胞迁移。每种抗体处理后，在37℃温育细胞24小时。确认了在患者衍生的细胞中ircr-101和1a03各抑制大于50％的肿瘤细胞迁移且4f12抑制40％的肿瘤细胞迁移(参见图23)。
在成胶质细胞瘤的皮下模型中，将ircr-101静脉内注射2周，且随后对cd31变化是否与新生血管相关进行了检查。相比于对照组，cd31显著减少，且血管的数量和厚度均减少。因此，除在成胶质细胞瘤的细胞迁移能力外，确认了在体内模型中ircr-101抑制新生血管(参见图24)。
在ircr-101处理中，于15、30和120min实施了nrp1、akt和erk的免疫印迹从而检查相关信号传输材料的变化。确认了30分钟后nrp1完全降解至消除且由于经磷酸化的akt和erk减少，因此akt和erk抑制了相关信号机制(参见图25)。
实施例10
体内模型中ircr-101分布的确认和猴tma的分析
在成胶质细胞瘤的原位模型中，用ircr-101标记荧光物质并静脉内注射细胞以观察荧光强度随时间的变化。在15分钟、1小时、1天和2天进行观察。结果是，确认了在1天时在对应于肿瘤位点的位点显现强的荧光，且直至第3天仍在相同位置显现荧光(参见图26)。
实施了雄性和雌性猴以及常规的nrp1抗体的tma(组织微阵列)从而研究了ircr-101的副作用。分析显示了相比于常规的nrp1抗体，大多正常器官组织显示较少的ircr-101抗体结合或无结合。因此，预测ircr-101在临床试验中的副作用低，这是由于其显示对正常组织低的结合亲和力或无结合亲和力(参见图27)。
工业实用性
本发明的特征和优势总结如下：
(i)本发明提供抗nrp1抗体及其医疗用途，所述抗nrp1抗体与表达在癌细胞表面上的nrp1结合且随后内化入所述细胞。
(ii)本发明的抗体抑制表达nrp1的癌细胞的侵袭和转移。
(iii)本发明的抗体可单独或以抗体-药物缀合物的形式用于治疗癌症。由于nrp1是在癌细胞表面上过表达的分子，本发明的抗体-药物缀合物用于选择性地仅靶向癌细胞同时最小程度地影响正常细胞。
对本发明的特定部分如上文详述进行了描述。对本领域技术人员显而易见的是，这些具体的说明仅为优选的实施方案且本发明的范围并不限于此。因此，本发明实际的范围将通过所附权利要求及其等同内容进行限定。
序列表
<110>社会福祉法人三星生命公益财团
<120>针对神经毡蛋白的抗体及其用途
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