新型EGFRVIII抗体和包含所述抗体的组合物的制作方法
本发明涉及特异性结合表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，制备所述抗体的方法，以及用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。
背景技术：
egfr(表皮生长因子受体；erbb-1；人her1)是在细胞表面表达的erbb家族的受体酪氨酸激酶(rtk)，由范德堡大学的stanleycohen所发现。该受体的过度表达或过度活性突变表现为癌变(zhangh.等，2007)。egfr家族的受体(egfr(erbb-1)、her2/c-neu(erbb-2)、her3(erbb-3)以及her4(erbb-4))在诸如egf、tgf-α等的配体(在her2的情况下无已知配体)中反应，形成同源二聚体或异源二聚体，并将激活信号传导到细胞。
由于二聚体的形成，如附图中所示的经自磷酸化通过mapk、akt或jnk的信号(downwardj.等，1984)被传导以激活细胞周期或细胞增殖(odak.等，2005)。egfr的各结构域和磷酸化位点与图1中所示相同。
用于抑制肿瘤相关egfr激活的各治疗剂已经问世，目前显示强抗癌效应。正在开发新型egfr拮抗剂，以弥补诸如治疗剂相应的副作用、耐受性等的缺陷。目前开发中的egfr拮抗剂的详细情况与图2中所示相同。
egfr过度表达及突变以多种不同形式出现于肺癌、肛门癌以及多形性成胶质细胞瘤(gbm)。egfrviii突变常见于脑肿瘤，并反映手术治疗、放射治疗及化学治疗后的预后不良(kuanct等，2003)。重组形式的egfr突变体具有特异性外显子的缺失或复制。重组形式的egfr和egfr突变体与图3中所示相同。
egfrviii是seqidno:1的egfr变体，其是最常出现的，缺乏外显子2-7氨基酸，在50％或更多的终末病脑肿瘤患者中表达。egfrviii缺乏egfrwt的氨基酸序列中的267个氨基酸，结合外显子1和8，产生作为新氨基酸的甘氨酸，诱导细胞内结构域磷酸化，显示持续活性，由此促进致癌作用(downwardj等，1984)。当然，egfr的其他形式也可被靶向，但目前egfrviii被认为是作为抗癌靶的最合适的egfr变体，许多研究和开发正在进行中。
具体地，在脑肿瘤中，细胞信号主要通过egfrviii的pi3k和akt由主要信号传导途径传导。通过作为次要途径的stat-3、ap-1或mapk激活，其促进癌细胞增殖，抵抗程序性细胞死亡，血管发生，增加癌细胞穿透，形成癌干细胞，等等(ganhk等，2013)。最近的研究已经报道了egfrviii在致癌作用中通过mtorc2激活nf-κb而起到重要作用(stanleycohen等，2012；tanaka等，2011)。egfrviii激活相应的信号传导途径与图4中所示相同。
此外，由于egfrviii诱导c-met磷酸化后的激活(huangph.等，2007)，当与c-met抑制剂连同egfr或egfrviii抑制剂一起应用和施用于患者时，可在降低高水平egfrviii患者化学治疗抗药性的同时改进功效。
在脑肿瘤中，egfrviii通常与egfr野生型(wt)同时表达(ekstrand等，1991)，由于egfrviii自身在egfr基因扩增的肿瘤中表达(biernat等，2004，frederick等，2000)，认为单个的癌症细胞会同时进行相互作用的egfrwt扩增和egfrviii表达。
egfrviii在脑肿瘤中以相对高频率表达，但是在其他癌中需要进一步的研究。最新的一项研究使用了被转化表达egfrviii的脑肿瘤细胞系，该究表明，使用egfrviii和egfrwt的网络的确会具有被共同激活的可能性(shiaq.等，pnas,2012)。egfrviii和egfrwt之间这样的相互作用需要再使用egfrviii加以证实，egfrviii通过异种移植模型、gbm球体细胞系或其他细胞系天然表达。
已有报道egfr磷酸化egfrviii，导致stat3/5激活途径，显著影响脑肿瘤进展(fanqw等，2013)。egfrviii二聚体形成显著影响信号转导的激活。由于egfrwt表达增加，egfrviii磷酸化和激活提高。由此，认为形成egfrwt二聚化的二聚化臂和激酶激活促进egfrviii激活。从在同位移植模型中当egfrwt或hb-egf的表达被抑制则egfrviii诱导的癌变被抑制的结果(lil.等，2014)可以说明，围绕egfrwt的激活途径在肿瘤发生中通过egfrviii激活起到重要作用。
目前，正开发的靶向egfrviii的治疗(脑)肿瘤的治疗剂可分为五类。第一类是一种通过使用传统egfr治疗剂阻断egfrwt和egfrviii的内部信号转导的方法。第二类是一种通过使用诸如abt-806(mab806,abbott)的同时靶向egfr和egfrviii的抗体抑制外部信号转导和受体之间相互作用的方法。第三类是开发抗体药物缀合物(adc)形式的抗egfrviii抗体，如amgen目前正在开发的amg-595。第四类是嵌合抗原受体-t细胞(car-t)形式可用作细胞免疫治疗剂。第五类是一种将egfrviii特异性14个氨基酸序列与匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,klh)连接并将其作为egfrviii抗癌疫苗施用的方法。目前没有仅靶向egfrviii而不靶向egfr的商业化抗癌药，如图6所示，有一种egfrviii疫苗cdx-110，目前由临床开发领先的celldextherapeutics开发。
在这些技术背景下，本发明的发明人制备了一种新型特异性结合egfrviii的抗体。具体地，他们证实了一种仅结合egfrviii而不结合egfrwt的新型抗体，其可通过生成特异性结合egfrviii而不与egfrwt交叉反应的抗体来制备，由此实现了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供新型的特异性结合egfrviii的抗体，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，其制备方法，以及用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。
本发明涉及结合包含seqidno:1氨基酸序列的表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)的抗体，所述抗体不与野生型表皮生长因子受体(egfr)交叉反应，其中，所述抗体特异性结合seqidno:1氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。
本发明涉及一种编码所述抗体的核酸。
本发明涉及一种包含所述核酸的载体。
本发明涉及一种包含所述载体的宿主细胞。
本发明涉及一种制备所述抗体的方法，所述方法包括通过培养宿主细胞表达所述抗体。
本发明涉及一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。
本发明涉及一种通过将药理学有效量的所述抗体施用于有相应需要的个体治疗癌症或肿瘤的方法。
附图说明
图1显示egfr的各结构域和磷酸化位点。
图2显示靶向egfr受体的已知拮抗剂的开发进展。
图3是显示与egfr重组形式的egfr突变体的结构的示意图。
图4是显示egfrviii激活相应的信号转导流的示意图。
图5显示获自www.clinicaltrials.gov.的临床开发中的egfrviii靶向治疗剂候选系列。
图6a显示chok1-egfrviii单细胞系的受体表达的蛋白质印迹结果。
图6b显示u87mg-egfrviii单细胞系的受体表达的蛋白质印迹结果。
图7显示包含用于筛选egfrviii抗体的egfrviii特异性序列的肽的小珠淘选噬菌体elisa结果。
图8显示证实了通过小珠淘选筛选(beadpanning)的单噬菌体-抗体的抗原特异性结合能力的蛋白质印迹结果。
图9a显示证实在非还原性缓冲液中通过sds-page处理获得的igg的结果。
图9b显示证实在还原性缓冲液中通过sds-page处理获得的igg的结果。
图10显示使用elisa人igg克隆的抗egfrviii肽结合。
图11显示使用流式细胞术的人igg克隆的egfrviii细胞系的结合特异性。
图12显示证实在抗egfrviii流式细胞术中人igg浓度降低影响的结合能力的结果。
图13显示通过elisa证实人igg轻链变化相应的结合能力的结果。
图14显示通过流式细胞术证实人igg轻链变化相应的结合能力的结果。
图15a显示通过使用u87mg13的流式细胞术证实抗egfrviii人igg的内化结果。
图15b显示通过使用chok122-2的流式细胞术证实抗egfrviii人igg的内化结果。
具体实施方式
一方面，本发明涉及结合包含seqidno:1氨基酸序列的表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)的抗体，所述抗体不与野生型表皮生长因子受体(egfr)交叉反应，其中，所述抗体特异性结合seqidno:1的氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。各组成具体描述如下。
抗原egfrviii
如上所述，egfrviii是egfr的缺失突变体，具有seqidno:1序列，其中，egfr细胞外结构域的267个氨基酸缺失，同时接头处具有甘氨酸单个氨基酸取代。
本发明的发明人通过使用包含egfrviii肽特异性序列13mer的肽作为抗原制备抗体，以制备特异性结合egfrviii而不与egfr野生型交叉反应的抗体。具体地，根据本发明所述的抗体可特异性结合seqidno:2leekkgnyvvtdhcsggkn(n是生物素)序列，该序列中包含egfrviii肽特异性序列13mer、4mer的连接体和生物素。同时，具有ttaccdrii序列的肽，例如seqidno:3neinpgnghtnynekfks(n是生物素)用作阻断非特异性结合的负抗原。由此，制备特异性结合egfrviii而不与egfr野生型交叉反应的抗体。
抗体
本申请所用的术语“抗体”是指与特异性抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，表示用作特异性识别抗原的受体作用的蛋白分子，该术语可包括多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段。此外，该术语还可包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。
全抗体是具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，各轻链通过二硫键与重链连接。全抗体包括iga、igd、ige、igm和igg，igg是亚类，包括igg1、igg2、igg3和igg4。抗体片段是指具有结合抗原功能的片段，包括fab、fab'、f(ab')2和fv等。
在具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区(ch1域)的结构中，fab具有一个抗原结合位点。fab'与fab的不同在于其具有铰链区，该铰链区在重链ch1结构域的c末端区至少包含一个半胱氨酸残基。当fab'铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键时生成f(ab')2抗体。
可变片段(fv)是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链fv(dsfv)通过二硫键连接到重链可变区和轻链可变区，单链fv(scfv)通常经共价键通过肽连接体连接到重链可变区和轻链可变区。此类抗体片段可以通过使用蛋白水解酶获得(例如，可以通过使用木瓜蛋白酶限制和裂解全抗体获得fab，可以通过使用胃蛋白酶裂解全抗体获得f(ab')2片段)，并且可以通过基因重组技术制备(例如，设定编码抗体重链或其可变区的dna和编码轻链或其可变区的dna作为模板，使用引物通过pcr扩增它们，组合和扩增编码肽连接体的dna和引物对，所述引物对被设置成连接重链及其可变区和轻链或其可变区各自末端)。
免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链均包含恒定区和可变区(该区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含被称为“互补决定区”(下文称为“cdr”)的三个可变区和四个框架区。该cdr主要负责结合到抗原的表位上。从n-末端开始按链的cdr通常被顺序称为cdr1、cdr2和cdr3，通过特异性cdr位于其中的链来鉴定。
本申请使用的术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体组获得的具有单一分子组成的抗体分子，可对特异性表位表现出单一结合特异性和亲和力。
本申请使用的术语“人抗体”是指源于人免疫球蛋白的分子，其中构成抗体的所有氨基酸序列包括互补决定区和框架区均由人免疫球蛋白氨基酸序列组成。人抗体通常用于治疗人疾病，其优点在于：i)通过与人免疫系统更稳定地相互作用而更有效地破坏靶细胞，例如，通过补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；ii)人免疫系统不会将该抗体识别为外来抗体；以及iii)即使以较小量较低频率施用较小量药物，人循环系统中的半衰期也与天然存在的抗体的半衰期相似。
鉴于如上所述，根据本发明所述的抗体是特异性结合egfrviii的单克隆抗体，其不仅对于egfrviii表现强亲和力和特异性，而且表现低免疫原性，这是因为其源自于人，由此适于治疗诸如癌症或肿瘤的疾病。
本申请使用的术语“特异性结合egfrviii的抗体”是指结合egfrviii而抑制egfrviii生物活性的抗体，该术语可与“抗egfrviii抗体”交换使用。此时，egfrviii的kd可为例如10-8或更少，优选10-9或更少，更优选10-10或更少。
本申请使用的术语“不与egfr交叉反应”可指结合egfr野生型的抗体和结合egfrviii的抗体不显示对于各抗原的交叉反应性。此时，不与egfr交叉反应的抗体具有针对对egfr野生型的抗体的kd的，例如，10-5或更多、优选10-4或更多、更优选10-3或更多。实际上，不与egfr交叉反应的抗体可指这样一种抗体，即这种抗体不能以标准结合测定的非限制形式检测结合egfr野生型的抗体。
在一种非限制性实施方式中，根据本发明所述的抗体可为，例如，实施例1中具体描述的，不与egfr交叉反应的单克隆人抗体pa430、pd27、pd52以及pd10，结构上特定化并分离以特异性结合seqidno:1的egfrviii氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸区域。各抗体的重链cdr和轻链cdr在下列表1和表2中列出。
[表1]
[表2]
根据本发明所述的抗体可通过例如混合vh和vl序列来生成，所述vh和vl序列与表1和表2中所述的vhcdr1、vhcdr2及vhcdr3序列和vlcdr1、vlcdr2及vlcdr3序列在结构上相似，被设置为vh/vl配对的cdr1、cdr2以及cdr3，可包括例如包含下列重链cdr的重链可变区：
包含选自seqidno:4-7的至少一种氨基酸序列的重链cdr1；
包含选自seqidno:8-11的至少一种氨基酸序列的重链cdr2；以及
包含选自seqidno:12-15的至少一种氨基酸序列的重链cdr3。
此外，根据本发明所述的抗体可包括轻链可变区，所述轻链可变区包含下列轻链cdr：
包含选自seqidno:16-19的至少一种氨基酸序列的轻链cdr1；
包含选自seqidno:20-23的至少一种氨基酸序列的轻链cdr2；以及
包含选自seqidno:24-27的至少一种氨基酸序列的轻链cdr3。
在一种实施方式中,根据本发明所述的抗体可特别包含下列表3中所述的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，或与它们具有同源性的序列：
[表3]
根据本发明所述的抗体可包含例如重链可变区，所述重链可变区包含与选自seqidno:28-31的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。该抗体可包括，即，seqidno:28-31的序列作为重链可变区，包含与选自seqidno:28-31的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性、优选至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更优选100％同源性的序列的重链可变区。
此外，根据本发明所述的抗体可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自seqidno:32-35的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。该抗体可包括，即，seqidno:32-35的序列作为轻链可变区，包含与选自seqidno:32-35的至少一种氨基酸序列具有至少80％同源性、优选至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更优选100％同源性的序列的轻链可变区。
具体地，根据本发明所述的抗体可包含选自下列序列的重链可变区和轻链可变区，表3中所述的vh序列和vl序列可通过混合vh和vl序列来生成，它们在结构上相似，可非限制性设置为vh/vl配对：
包含seqidno:28序列的重链可变区和选自seqidno:32-35的序列的轻链可变区；
包含seqidno:29序列的重链可变区和选自seqidno:32-35的序列的轻链可变区；
包含seqidno:30序列的重链可变区和选自seqidno:32-35的序列的轻链可变区；
包含seqidno:31序列的重链可变区和选自seqidno:32-35的序列的轻链可变区。
具体地，根据本发明所述的抗体可包含下列重链可变区和轻链可变区：
包含seqidno:28序列的重链可变区和包含seqidno:32序列的轻链可变区；
包含seqidno:29序列的重链可变区和包含seqidno:33序列的轻链可变区；
包含seqidno:30序列的重链可变区和包含seqidno:34序列的轻链可变区；
包含seqidno:31序列的重链可变区和包含seqidno:35序列的轻链可变区。
另一方面，本发明涉及编码抗体的核酸。本申请所用的术语“核酸”可以在细胞内、细胞裂解物或者以部分纯的形式或基本纯的形式提供。当通过标准技术包括碱/sds处理、cscl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域公知的技术从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞的核酸或蛋白质)纯化时，核酸成为“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可为例如dna或rna，可包含或不包含内含子序列。
在一非限制性实施方式中，根据本发明所述的编码vh序列和vl序列的核酸在表4中描述，可包含与选自seqidno:36-39的编码重链可变区的序列具有至少95％同源性的至少一种重链可变区编码序列，和/或可包含与选自seqidno:40-43的至少一种轻链可变区编码序列具有至少95％同源性的至少一种轻链可变区编码序列。该抗体与选自seqidno:36-39和/或seqidno:40-43的至少一种核酸序列具有至少95％同源性、优选至少98％同源性、更优选100％同源性。
[表4]
本发明可包括一种缀合物，其中，毒素、药物等与抗体连接。毒素或药物可包括任何靶化合物。这样的毒素的实例可为duocamycin,刺孢霉素，美登新(mytansine)或阿里他汀(auristatin)，所述化合物可为已知的抗癌或抗肿瘤化合物，例如，紫杉醇(taxol)，依托泊苷(etoposide)，tenofoside，长春新碱，阿霉素等，烷化剂(例如，顺铂，蒽环类抗生素(例如阿霉素等)。缀合物可使用本领域可获得的技术使用交联剂来制备。
此外，除了抗体外，本发明还可包括双特异性结合分子，该双特异性结合分子包含两个或更多不同的结合位点，其中，肽、蛋白质或抗体与不同于抗体的其他抗原结合位点结合。双特异性结合分子可通过使用本领域已知的方法连接结合特异性部分来制备。此外，当连接抗体时，可在重链的c末端区通过巯基来连接。根据具体情况，所述抗体可在同一载体被编码，并且在同一待组合的宿主细胞中被表达。
抗体的制备方法
另一方面，本发明涉及一种包含核酸的载体。为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物技术(例如，使用表达靶抗体的杂交瘤的pcr扩增或cdna克隆)来获得编码轻链和重链的部分或全长的dna，并且可将其插入到表达载体中，以此将dna与转录和翻译调控序列操作性连接。
本申请所用的术语“操作性连接”可指将抗体基因与载体连接以致载体中的转录和翻译调控序列起到调控抗体基因转录和翻译的预期功能。对于表达载体和表达调控序列的选择要使得其与用于表达的宿主细胞匹配。将抗体的轻链基因和抗体的重链基因插入各自的载体，或将两种基因均插入同一表达载体。通过标准方法(例如，在抗体基因片段和载体上连接互补限制性酶位点，或者如果不存在非限制性酶位点钝末端连接)将抗体插入表达载体。根据具体情况，重组表达载体可编码有利于从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，以致将信号肽与抗体链基因的氨基末端结合以适合框架。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(例如，源自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。此外，重组表达载体具有调控宿主细胞中抗体链基因表达的“调控序列”。“调控序列”可包括启动子、增强子以及其他调控抗体链基因转录或翻译的表达调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。本领域技术人员可认识到，根据诸如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质表达水平等因素，可通过选择不同调控序列来改变表达载体的设计。
本发明还可包括宿主细胞，所述宿主细胞包含核酸或载体。所述核酸或载体是转染过的。可以使用通常用于将外源dna导入待“转染”的原核或真核宿主细胞的多种技术，例如，电泳、磷酸钙沉淀方法、deae-葡聚糖转染或脂质转染。根据本发明所述的抗体可在真核细胞中表达，考虑到应用于哺乳动物细胞的可能性，优选哺乳动物宿主细胞。用于抗体表达的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞(包括，例如，与dhfr可选择标记物一起使用的dhfr-cho细胞)，nso骨髓瘤细胞，cos细胞或sp2细胞等。
另一方面，本发明涉及一种制备抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞以表达所述抗体。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞持续一段足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，持续一段足以允许抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中的时间。此外，抗体的制备可包括使用包含seqidno:1的氨基酸序列的egfrviii淘选。
根据具体情况，可从宿主细胞中分离表达抗体，并将其纯化至同质。抗体的分离或纯化可通过用于常规蛋白质的分离和纯化方法来进行，例如层析。层析可包括，例如，亲和层析(包括蛋白质a柱、蛋白质g柱)，离子交换层析，或疏水层析。除层析以外，还可通过联合过滤、超滤、盐析、透析等进一步分离和纯化抗体。
药物组合物
另一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗体。
本申请所用的术语“癌症或肿瘤”并非特别限制，只要是可通过本发明的抗体治疗的癌症或肿瘤类型。例如，可以是由egfrviii过度表达导致的乳腺癌、肺癌或肛门癌，和脑肿瘤，例如原发性脑肿瘤(即，在脑中发生的)和继发性或转移性脑肿瘤。
根据具体情况，根据本发明所述的抗体可与其他抗癌药物联合施用(即，在接受癌症治疗之前、过程中或之后)。其可联合本领域技术人员已知的任何一种或多种化学治疗药物施用，例如，烷化剂，例如卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺铂、碳铂、oxyplatin、proccarbazine以及环磷酰胺；抗代谢物，例如，氟尿嘧啶、氟尿苷(phloxuridine)、氟达拉滨、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤以及羟基脲；天然产物，例如植物生物碱，或抗生素，例如博来霉素、阿霉素、柔红霉素、去甲氧基柔红霉素、依托泊苷、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春新碱，以及诸如
药物组合物可配制成包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指不刺激活生物体且不抑制所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。用于待配制成液体溶液的组合物的药学上可接受的载体适于灭菌和活体，可通过混合盐水溶液、无菌水、林格氏液(ringer’ssolution)、缓冲的盐水溶液、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或这些组分中的一种或多种来使用。如有必要，可添加其他常用添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和制菌剂。此外，可另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂以及润滑剂而配制成注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，例如水性溶液，悬浮液、乳剂等。
药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂形式。在制剂的情况下，可使用常规使用的稀释剂或赋形剂制备，例如填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等，可通过将一种或多种诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等的赋形剂与一种或多种化合物混合来制备。此外，除了简单的赋形剂，也可使用诸如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。口服施用的液体制剂实例包括悬浮液、溶液、乳剂以及糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡以外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。
肠胃外给药的制剂可包括灭菌水溶液剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂以及栓剂。非水溶剂和悬浮液溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、诸如油酸乙酯的可注射酯。witepsol、聚乙二醇、吐温、可可脂、月桂脂、甘油明胶等可用作栓剂基质。
药物组合物可具有选自如下的任一种制剂：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液剂、乳剂、糖浆、灭菌水溶液剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。此外，可以一次或多次施用。此时，以液体制剂、粉剂、气雾剂、胶囊、阴道片剂、胶囊或栓剂的形式施用组合物。施用途径可包括但不限于腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内、直肠内等。然而，当口服施用时，由于肽在胃中消化，必须配制成保护其防止在胃中降解或对活性成分包衣。此外，可通过任何能够转移至靶细胞的装置施用活性物质。
可以以药学有效量施用组合物，“治疗有效量”可指足以以适用于医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平通过如下因素来确定，包括个体的类型和严重程度、年龄、性别、癌症类型、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、释放速率、治疗持续时间、同时使用的药物和医学领域中公知的其他因素。通常可以以0.1至5mg/kg的高剂量给药组合物，例如1、2、3或4mg/kg，10mg/kg，或15或20mg/kg。作为固定的单位量，例如，可以以50、100、200、500或1000mg提供。为了导致癌症或肿瘤退化，更优选去除肿瘤，可以1至8次(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)，或10、20或更多次给药。基于抗体的半衰期，可每周两次，每周一次、每两周一次、每个月一次，或以一周、两周、四周、八周、三至六个月或更长时间的其他间隔来给药。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅例示本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例1：egfrviii细胞系的建立
通过使用dna合成(invitrogen，seqidno:1)获得含有hindiii和xbai限制性酶位点的egfrviii基因，并通过使用hindiii和xbai限制性酶裂解该基因。将所裂解的模板dna克隆至使用hindiii和xbai限制性酶裂解的表达载体pcdna3.1中，以组合pcdna3.1-egfrviii。将pcdna3.1-egfrviii转化至dh5α大肠杆菌中以筛选氨苄霉素抗性菌株。确认是否通过使用hindiii和xbai限制性酶裂解而插入egfrviii基因。
就chok1、u87mg以及a431而言，通过使用lipofectamine2000转染被制备以产生egfrviii细胞系的pcdna3.1-egfrviii载体，在10％fbs,dmem中培养细胞48小时。将所培养的细胞在添加g418的10％fbs(1000μg/ml、400μg/ml、400μg/ml1:10稀释度)的dmem或rpmi中培养之后，在6孔板中筛选和增殖待克隆的细胞。当溶解各增殖12天的细胞之后，进行蛋白质印迹，并进行电泳，使用抗egfr抗体和抗人igghrp处理，与ecl底物反应(图6a和6b)。
实施例2：生物淘选
将用作抗原的egfrviii肽合成为含有用作连接体的特异性序列13mer和4mer以及生物素(seqidno:2)。还将生物素-ttaccdrii肽(seqidno:3)合成为负抗原以阻断非特异性结合。使用m-280链霉亲和素(invitrogen,usa)珠以每5μl连接7.8ng肽制备各肽。
在25℃使人抗体噬菌体文库与事先连接至小珠的ttaccdrii肽反应30分钟以诱导非特异性噬菌体抗体结合。其后，使用磁棒收集结合至小珠的ttaccdrii肽，然后分开仅收取上清液。将上清液再添加至结合小珠的egfrviii肽，在25℃反应2小时以发生抗体噬菌体的结合。使用磁棒收集结合至小珠的egfrviii肽，移除噬菌体上清液。使用pbst(含有0.1％tween20的pbs)重复洗涤吸引至磁棒上的小珠egfrviii肽5次，最后，使用pbs洗涤一次。使100ul100mm的三乙胺溶液反应10分钟，以使得结合至抗原的噬菌体洗脱，通过50ul1mtrisph7.5中和洗脱的噬菌体。
将中和的噬菌体洗脱液添加至10ml对数中期xl1-blue大肠杆菌细胞系，在37℃反应30分钟以诱导感染。将所感染的xl1-blue大肠杆菌细胞系铺于含有1％葡萄糖的2×yt/c板上，在30℃培养16小时。以相同方式进行第一轮淘选和第二轮和第三轮淘选。
实施例3：特异性结合egfrviii的噬菌体抗体的筛选
从所完成的淘选中随机选择大肠杆菌克隆，在96孔板37℃和300rpm下在对数中期通过添加500μl2×yt/c培养基中培养，之后添加m13辅助噬菌体，之后在37℃诱导噬菌体感染30分钟。在30℃和30rpm条件下培养所感染的大肠杆菌克隆15小时，以制备待洗脱的噬菌体抗体。在6000rpm下离心所培养的大肠杆菌克隆细胞10分钟以去除细胞，仅获得上清液。
以1μg/ml将egfrviii肽、ttaccdrii肽以及bsa涂覆在maxisorb96孔elisa板(nunc，denmark)上，在室温下使用3％脱脂乳/pbs封闭1小时，然后使用所获得的上清液接种，在室温下反应1小时。使用0.05％pbst洗涤elisa板3次，然后经1小时将抗m13-hrp(辣根过氧化物酶)抗体(ge)稀释至1:3000.05％pbst。在处理10分钟并tmb底物(bd,usa)显色后，通过2nh2so4处理终止反应。在450nm-650nm使用sunriseelisa读板机(tecan，switzerland)测量显色elisa(图7)。
实施例4：蛋白质印迹
使用chok1-egfrviii细胞裂解物通过蛋白质印迹观察噬菌体-抗体的egfrviii结合能力。
使用pbs洗涤实施例1中制备的chok122-2(作为chok1-egfrviii细胞系)和作为其母细胞表达chok1和egfr的a431，通过使用洗脱缓冲液(1％sds，1mmna3vo3，10mmtris(ph7.4)，1mmpmsf，10μm亮抑酶肽(leupeptin)，1.5μm胃蛋白酶(pepstein)，以及10μg/ml抑肽酶)溶解。通过6％sds-page分离15μg各细胞裂解物之后，将蛋白质转移至pvdf膜。在使用3％脱脂乳tbst封闭1小时之后，处理5×1010pfupa430噬菌体和pd54噬菌体1小时，之后经1小时将抗m13-hrp(辣根过氧化物酶)抗体(ge)稀释至1:24000tbst，在通过使用ecl(gehealthcare，usa)底物显色之后，使用odysseyfc成像系统(licor，usa)确认印迹。
结果示于图8，根据图8，可以理解pa430噬菌体和pd54噬菌体仅在表达egfrviii的细胞系中结合。
实施例5：igg表达和纯化
通过使用包含噬菌体-抗体重链可变区以获取片段的sfii限制性酶双切，并且通过在包含重链区以获取与片段连接的pigghd-6a6hvy中使用sfii限制性酶双切，实现向igg形式的转化。
通过使用包含噬菌体-抗体轻链可变区的bstxi限制性酶双切获取片段。以与包含轻链区的载体piggld-6a6lgt相同的方式将片段与片段连接(对于上述方法，请参考韩国专利申请公开文本no.2008-0109417)。
通过每100mm细胞培养皿8×106个细胞，接种hek293t细胞，并且在37℃co25％培养基中培养细胞24小时以致细胞的附着和密度达到80～90％培养细胞来测定igg的表达。以80％至90％来培养细胞。
将所制备的igg的10μg重链表达载体和10μg轻链表达载体，即总共20μg载体与pei以1:3(dna:pei)μg比例混合，反应15分钟以形成复合物。将dnapei复合物添加至培养的细胞中，在反应10小时之后，使用dmem洗涤一次。然后，通过添加10ml其中添加了10％青霉素链霉素(gibco，usa)至freestyle293(gibco，usa)的培养基，放置48小时，以获取其中表达igg的上清液。
将所获得的上清液注射至使用20mmtris-hcl,50mmnacl及5mmedtaph7.0平衡的蛋白a柱(gehealthcare,usa)，使用50mmtris-hcl(ph7.0),5mmedta,500mmnacl,0.2％聚山梨醇酯20洗涤，然后使用50mmnacl,0.1m甘氨酸-hcl(ph3.5)溶液洗脱。之后，进行使用1mtris中和的亲和层析。在mwco10,000spectra/por透析膜(spectrum,usa)中回收洗脱的蛋白质，通过pbs透析置换溶液。
结果示于图9a和9b。根据图9a和9b，使用非还原性或还原性lds样品缓冲液通过sds-page处理各抗体，当将其上样至nupage4-12％bis-trisgel(invitrogen,usa)上时，获得包含50kd重链和25kda轻链对应于150kda的igg。
实施例6：特异性结合egfrviii的igg的筛选
进行elisa以鉴定转化为igg的克隆的抗原特异性结合能力。在37℃将egfrviii肽、ttaccdrii肽以及bsa铺于1μg/ml96孔板2小时。此后，在使用3％脱脂乳/0.05％pbst封闭未覆盖的部分之后，将1μg/mligg添加至板上，于37℃反应1小时。以1:3000稀释抗人igghrp(pierce,usa)，反应1小时。接下来，处理tmb底物(bd，usa)10分钟用于显色，通过使用2nh2so4处理来终止反应。对于显色elisa，在450nm-650nm使用sunriseelisa读板机(tecan，switzerland)检测吸光度。
结果示于图10，根据图10，pa430、pd27、pd52以及pd10仅对于egfrviii肽显示特异性结合能力，而无非特异性结合。
基于这些结果，进行荧光染色流式细胞术，以证实上述四种抗体是否保持egfrviii表达细胞系的结合能力。以egfrviii表达细胞系，chok122-2及其母细胞，chok1以及表达egfr野生型的a431为试验对象。以1×106个细胞数获取各细胞，以在添加有2％fbs的pbs中1μg/ml的各抗体稀释，并添加至细胞，在4℃反应1小时。1:200稀释抗人iggpe(bethyl，usa)，在4℃反应45分钟，用于荧光染色。使用facscaliber(bd,usa)仪器以每样品1×104个细胞检测各样品。
结果示于图11，根据图11，pa431、pd27以及pd10能够结合egfrviii表达细胞系chok122-2，但不结合egfrviii非表达细胞系chok1和a431。此外，显示在表达egfr野生型的a431中未观察到结合。
为了根据抗体浓度的降低来证实三种对于egfrviii表达细胞系显示结合能力的抗体的结合特性，进行如下实验。从1000ng/ml连续数量级双倍稀释抗体浓度，制备至达31ng/ml。以如上所述相同数量级进行荧光染色流式细胞术。
结果示于图12，根据图12，观察到，pa430显示高结合能力，即便是在与pd27和pd10相同浓度下处理igg时也是如此。
实施例7：轻链亲和力增强的变化
改变轻链以增强pa430的抗原特异性亲和力。当考察pa430、pd52以及pd27的轻链可变区的cdr时，已经证实它们在pa430的轻链可变区序列中是相似的，具有高抗原特异性亲和力(见表1-3)。利用该事实，除了原始的pa430轻链，将pd52、pd27以及pd10的轻链载体与pa430的重链载体混合，进行转染以产生igg，这与实施例5中相同。
当以实施例6的elisa相同方式进行所产生的和鉴定的430h10l、430h52l以及430h27l的实验时，证实其保持了抗原特异性结合能力(图13)。
对于pa430和430h52l、430h27l和pd10igg以相同方式进行实施例6的荧光染色流式细胞术。当对于基于u87mg细胞和a43116-3细胞系(基于a431细胞作为egfrviii表达细胞系产生的)作为egfrviii表达细胞系产生的u87mg13细胞系进行实验时，证实430h52l和430h27l保持结合能力，即便在egfrviii特异性细胞系中也是如此。此外，观察到430h52l的结合信号显著，即便在与具有环轻链的pa430相同浓度处理时也是如此(图14)。
实施例8：使用荧光染色流式细胞术分析抗体内化
通过使用具有egfrviii特异性结合能力的430h52l抗体，进行荧光染色流式细胞术，以证实是否通过抗体-egfrviii结合进行了内化。
针对u87mg13细胞和chok122-2细胞，使用胰蛋白酶edta处理2×106个细胞，然后在4℃冷却30分钟，以抑制细胞活性。在4℃于dmem培养基中使用1μg/ml430h52l处理细胞30分钟以诱导抗体抗原结合。使用仅dmem处理的二级抗体处理样品。接下来，在1300rpm离心3分钟后，使用pbs洗涤细胞以去除残留抗体，添加dmem培养基，在4℃与样品反应，在co25％下37℃温育样品15分钟，37℃温育样品30分钟，以及37℃温育样品60分钟。在离心后，在4℃使用pbs洗涤细胞，然后0.1m甘氨酸和0.5mnaclph2.2重复处理三次每次10分钟，以人工去除结合细胞表面egfrviii的抗体。离心之后，使用pbs洗涤细胞，在4℃使用4％多聚甲醛(usb，usa)固定10分钟。通过0.1％triton-100(sigmaaldrich,usa)pbs溶液使各样品渗透，或使用2％fbspbs溶液处理，以致不发生渗透。离心之后，使用pbs洗涤细胞，2％fbspbs处理和封闭，以1:400处理抗人iggpe(bethyl,usa)，用于染色。使用facscaliber(bd,usa)仪器以每一样品1×104个细胞来检测各样品。
结果分别示于图15a和15b。根据15a和15b，当使用430h52l抗体处理egfrviii表达细胞系u87mg13或chok122-2细胞和通过使用细胞透化通过各温度和时间的反应进行荧光染色时，观察到与4℃相比在37℃信号随着时间增加而增加。当在不进行细胞透化的对照组中进行非透化荧光染色时，没有信号随着温度和时间增加而增加。这通过37℃条件下430h52ligg结合egfrviii以致内化随着时间增加而增加的荧光信号来证实。
根据本发明所述的特异性结合egfrviii的抗体是仅结合egfrviii而不结合野生型egfr(egfrwt)的新型抗体，在表达egfrviii的细胞中显示显著的结合能力。已经证实发生内化，由此其可用作靶向egfrviii的有效拮抗剂。由此，根据本发明所述的特异性结合egfrviii的抗体可有效用于治疗egfrviii表达诱导的疾病。
基于上述内容，本发明范围内的多种变化和修饰对于本发明所属领域普通技术人员来说是显而易见的。
序列表
<110>药物抗体公司
<120>新型egfrviii抗体和包含所述抗体的组合物
<130>pdk03479a
<140>pct/kr2014/011381
<141>2014-11-25
<160>43
<170>patentin版本3.5
<210>1
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<213>人工序列
<220>
<223>egfrviii的序列
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