多价配体‑脂质构建体的制作方法

本发明涉及自发且稳定地整合入膜中的水可分散的多价配体-脂质构建体，和这种构建体在诊断、预后、预防和治疗应用中的用途。具体地，本发明涉及多价配体-脂质构建体在制备与配体结合蛋白的亲和力增加的kodecyte中的用途。

背景技术：

bovin等(2005)的出版物公开了自发且稳定地整合入脂双层(包括细胞膜)的合成分子。该合成分子由通过间隔基(s)与脂质部分(l)，例如磷脂酰乙醇胺共价连接的功能性部分(f)，例如单糖、二糖、三糖或寡糖组成。选择间隔基以提供不使用洗涤剂或溶剂而易于分散于水中的合成分子，并可用于影响细胞表面抗原表达的定性和定量变化。该出版物公开了在制备表达控制量的血型相关聚糖的红血细胞的方法中使用这些合成分子。这些修饰或转化细胞(现在称为‘kodecyte’)可以用作血型分型试剂质量保证中的阳性对照。

bovin等(2009)的出版物公开了功能性脂质构建体，其由通过延长的间隔基(s)与脂质(l)部分共价连接的功能性部分(f)组成。与bovin等(2005)的出版物中公开的合成分子相同的是，尽管易分散于水中，该构建体自发整合入细胞膜。该构建体提供其他优势，其功能性部分(f)存在于离细胞膜表面一定距离处。bovin等(2010)的出版物公开了其中功能性部分(f)是受体配体的构建体。该出版物公开了三-或四-触角结构的多价构建体。构建体中配体间的间隔用于促进配体与配体结合蛋白或受体之间的多价相互作用。

配体结合蛋白包括聚糖结合蛋白(gbp)。这些蛋白质在免疫和微生物-宿主相互作用的机制中发挥重要作用。gbp存在于所有个体的血清中。免疫系统在很大程度上取决于这些gbp的能力和良好装备。很多gbp是结合正常人组织中表达的聚糖配体的天然抗体(nab)(自身抗体)。然而，nab也可能与许多疾病有关，例如结合与肿瘤相关的碳水化合物抗原(taca)的抗体。从健康至癌前或恶性的细胞转化与细胞表面存在的蛋白质和脂质的异常糖基化的出现有关。因此，个体的nab谱变化可以与一些疾病，包括癌症的发作和进展相关。

本发明的一个目的是提供用于制备与配体结合蛋白的亲和力增加的kodecyte的多价配体-脂质构建体。该目的将理解为至少提供一个有用选择的目的的替代物。

发明简述

在第一个方面，本发明提供以下结构的多价配体-脂质构建体：

其中，f是配体，s是四触角间隔基，且l是共轭磷脂酰乙醇胺。

优选地，s是以下结构的四触角间隔基：

其中，m是整数1、2或3，且r是以下结构：

其中，m是单价阳离子或取代基，n是整数2、3、4、5、6或7，且*是f或l的连接点。优选地，m是h⁺，且n是整数5。

优选地，l是以下结构的共轭磷脂酰乙醇胺：

其中，m’是单价阳离子，p是整数3、4或5，w¹和w²独立地选自c16-20烷基或单-或二-不饱和的c16-20烯基，且*是s的连接点。

优选地，多价配体-脂质构建体包含以下部分结构：

更优选地，多价配体-脂质构建体包含以下部分结构：

在本发明第一个方面的第一个实施方案中，f是氨基烷基糖苷，且多价配体-脂质构建体是以下结构：

其中glyc是聚糖，且q和r是独立地选自1、2、3和4的整数。

优选地，glyc是选自以下的聚糖：(neu5acα6galβ4glcnacβ2manα)23，6manβ4glcnacβ4glcnacβ(yds)；fucα2galβ(hdi)；fucα2galβ3(fucα4)glcnacβ(le^b)；fucα2galβ3glcnacβ3galβ4glcβ(lnfpi)；fucα2galβ4(fucα3)glcnacβ(le^y)；fucα2galβ4glcnacβ(h2)；galα；galβ1-3(fucα1-3)glcnac；galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-4glcnac；galβ1-3glcnacβ1-4glcnac；galβ1-3glcnac；galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-4glcnac；galβ1-4(fucα1-3)glcnac；galβ1-4glcnacβ1-4glcnac；galβ1-4glcnac；galα3(fucα2)galβ(btri)；galα3(fucα2)galβ3(fucα4)glcnacβ(ble^b)；galα3(fucα2)galβ3galnacα(b3)；galα3(fucα2)galβ3galnacβ(b4)；galα3(fucα2)galβ3glcnacβ(b1)；galα3(fucα2)galβ4(fucα3)glcnacβ(ble^y)；galα3(fucα2)galβ4glcnacβ(b2)；galα3galβ4glcnacβ(galili)；galα4galβ4glcnacβ(p1)；galα4galβ4glcβ(gb3(p^k))；galα4glcnacβ(α-ln)；galnacα3(fucα2)galβ(atri)；galnacα3(fucα2)galβ3(fucα4)glcnacβ(ale^b)；galnacα3(fucα2)galβ3galnacα(a3)；galnacα3(fucα2)galβ3galnacβ(a4)；galnacα3(fucα2)galβ3glcnacβ(a1)；galnacα3(fucα2)galβ4(fucα3)glcnacβ(ale^y)；galnacα3(fucα2)galβ4glcnacβ(a2)；galnacα3galnacβ(fs2)；galnacα3galnacβ3galα4galβ4glcβ(fs5)；galnacα3galβ(adi)；galnacα3galβ4glcnacβ；galnacβ；galnacβ3galα4galβ4glcβ(p)；galnh2α3(fucα2)galβ(acqb)；galβ；galβ3(fucα4)glcnacβ(le^a)；galβ3galnacα(tf)；galβ3galnacβ4galβ4glcβ(gal)；galβ4(fucα3)glcnacβ(le^x)；galβ4glcnacβ3galβ4glcnacβ(i(ln2))；galβ4glcnacβ3galβ4glcβ(lnnt)；galβ4glcβ(lac)；glcaβ3[glcnacβ4glcaβ3]nglcnac-氨基糖醇(透明质酸)；manα6(manα3)manβ(man3)；neu5acα3galβ4glcnacβ(neu5ac3＇ln)；neu5acα3galβ4glcβ(neu5ac3＇lac)；neu5acα6galnacαβ(siatn)；neu5acα6galβ4glcnacβ(neu5ac6＇ln)；neu5gcα3galβ4glcnacβ(neu5gc3＇ln)；

saα2-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

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saα2-3galβ1-3(fucα1-4)glcnac；

saα2-3galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-3galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucαl-3)glcnac；

saα2-3galβ1-3glcnacβ1-4glcnac；saα2-3galβ1-3glcnac；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-4gal；

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saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnac；saα2-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnac；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-4glcnac；sag2-3galβ1-4glcnac；

saα2-6galβ1-3(fucα1-4(glcnac；

saα2-6galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

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saα2-6galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-6galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-3glcnacβ1-4galβ1-4(fucα1-3)glcnac；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glc；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glc；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-4glc；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-4(fucα1-3)glcnac；

saα2-6galβ1-4glcnacβ1-4glcnac；saα2-6galβ1-4glcnac；

saα2-3galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnac；

saα2-3galβ1-4glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnac；

saα2-6galβ1-4(fucα1-3)glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnac和saα2-6galβ14glcnacβ1-3galβ1-3(fucα1-4)glcnac。更优选地，glyc是选自以下的聚糖：(neu5acα6galβ4glcnacβ2manα)23，6manβ4glcnacβ4glcnacβ(yds)；fucα2galβ(hdi)；fucα2galβ3(fucα4)glcnacβ(le^b)；fucα2galβ3glcnacβ3galβ4glcβ(lnfpi)；fucα2galβ4(fucα3)glcnacβ(le^y)；fucα2galβ4glcnacβ(h2)；galα；galα3(fucα2)galβ(btri)；galα3(fucα2)galβ3(fucα4)glcnacβ(ble^b)；galα3(fucα2)galβ3galnacα(b3)；galα3(fucα2)galβ3galnacβ(b4)；galα3(fucα2)galβ3glcnacβ(b1)；galα3(fucα2)galβ4(fucα3)glcnacβ(ble^y)；galα3(fucα2)galβ4glcnacβ(b2)；galα3galβ4glcnacβ(galili)；galα4galβ4glcnacβ(p1)；galα4galβ4glcβ(gb3(p^k))；galα4glcnacβ(α-ln)；galnacα3(fucα2)galβ(atri)；galnacα3(fucα2)galβ3(fucα4)glcnacβ(ale^b)；galnacα3(fucα2)galβ3galnacα(a3)；galnacα3(fucα2)galβ3galnacβ(a4)；galnacα3(fucαα2)galβ3glcnacβ(a1)；galnacα3(fucα2)galβ4(fucα3)glcnacβ(ale^y)；galnacα3(fucα2)galβ4glcnacβ(a2)；galnacα3galnacβ(fs2)；galnacα3galnacβ3galα4galβ4glcβ(fs5)；galnacα3galβ(adi)；galnacα3galβ4glcnacβ；galnacβ；galnacβ3galα4galβ4glcβ(p)；galnh2α3(fucα2)galβ(acqb)；galβ；galβ3(fucα4)glcnacβ(le^a)；galβ3galnacα(tf)；galβ3galnacβ4galβ4glcβ(gal)；galβ4(fucα3)glcnacβ(le^x)；galβ4glcnacβ3galβ4glcnacβ(i(ln2))；galβ4glcnacβ3galβ4glcβ(lnnt)；galβ4glcβ(lac)；glcaβ3[glcnacβ4glcaβ3]nglcnac-氨基糖醇(透明质酸)；manα6(manα3)manβ(man3)；neu5acα3galβ4glcnacβ(neu5ac3′ln)；neu5acα3galβ4glcβ(neu5ac3′lac)；neu5acα6galnacαβ(siatn)；neu5acα6galβ4glcnacβ(neu5ac6′ln)和neu5gcα3galβ4glcnacβ(neu5gc3′ln)。最优选地，gly是选自以下的聚糖：galα3galβ4glcnacβ(galili)和galnacα3galβ4glcnacβ。

在本发明第一个方面的第二个实施方案中，f是包含n-马来酰-β-丙氨酸共轭的cys残基的寡肽，且多价配体-脂质构建体是以下结构：

其中xaa是氨基酸残基，且i和j是0或整数，且i和j的和为5-30(包括)。优选的，i是5-30(包括)的整数，且j是0。更优选的，i是整数13，且j是0。最优选的，寡肽是seqidno：01的肽。

在第二个方面，本发明提供用于检测从受试者获得的生物样品中存在配体结合蛋白的改进方法，包括以下步骤：

●将所述生物样品与细胞的第一悬浮液接触，所述细胞通过在细胞膜中整合入本发明第一方面的多价配体-脂质构建体修饰，从而提供第二悬浮液；

●向所述第二悬浮液添加一定量的抗-受试者结合蛋白，并在一定温度下孵育足以允许细胞凝集的时间；和

●测定所述凝集的程度，

其中所述配体结合蛋白结合至本发明第一方面的多价配体-脂质构建体的f。

所述改进方法的改进之处在于：相对于使用单价配体-脂质构建体，检测生物样品中存在配体结合蛋白的所述检测方法的亲和性、灵敏性和/或特异性增加。

在第三个方面，本发明提供用于测定在受试者血清中配体诱导补体介导的细胞裂解的能力的方法，包括以下步骤：

●将从受试者获得的血清样品与o型红血细胞悬浮液接触，所述红血细胞通过在细胞膜中整合入本发明第一方面的多价配体-脂质构建体修饰；和然后

●监测溶血速度，

其中f是配体。

在第四个方面，本发明提供通过瘤内注射组合物来治疗肿瘤患者的方法，所述组合物基本上由一个或多个本发明第一方面的多价配体-脂质构建体的构建体组成。

在本说明书的

技术实现要素：
和权利要求书中，以下缩略词、符号、术语和短语具有提供的含义：“亲和性”是指两个部分之间，例如酶和底物或受体和配体之间的相互作用的强度；“亲和力”是指结合相互作用，例如抗体和抗原的结合相互作用的强度；“生物相容的”是指对活体组织无害或无毒；“包含”是指“包括”、“含有”或“由…表征”且不排除任何其他要素、成分或步骤；“由…组成”是指除了杂质和其他偶然物(incidental)，排除未指定的任何要素、成分或步骤；“基本上由…组成”是指排除材料限制的任何要素、成分或步骤；“诊断”是指与疾病或其他问题的诊断相关；“dope”是指1，2-o-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺；“聚糖”是指单糖、二糖、三糖或寡糖；“kodecyte”是指通过在细胞膜中整合入构建体修饰的细胞；“pbs”是指磷酸盐缓冲盐水；“pcv”或“pcv”是指填充细胞体积；“血浆”是指血液或淋巴的无色液体部分，其中悬浮血球或脂肪球；“预后”是指预测疾病或病痛的可能原因或发生；“预防”是指意欲防止疾病；“rbc”是指红血细胞；“反应产物”是指纯化前反应的产物；“盐水”是指一种或多种盐的溶液；“血清”是指当血液凝固时分离出来的琥珀色的富含蛋白质的液体；“合成的”是指通过化学合成制备；“治疗”是指与疾病治愈有关；“水可分散的”是指，在描述构建体性质的情况下，当构建体以至少100μg/ml的浓度与水接触且不合有机溶剂或洗涤剂时，在25℃的温度下形成稳定的单相系统。

氨基酸残基用专利合作条约下行政规程(2015年7月1日起生效)的附件c的附录2的表3所提供的符号来鉴定。“功能上相似的氨基酸”是指根据以下分组具有相似性质的氨基酸：中性-弱疏水(ala，gly，pro，ser，thr)；亲水-酸胺(asn，asp，gln，glu)；亲水-碱性(arg，his，lys)；疏水（ile，met，leu，val)；疏水-芳族(phe，trp，tyr)和交联(cys)。

糖残基及其衍生物用mcnaught(1996)的出版物的表2和附件中所提供的符号来鉴定。具体地，以下符号具有以下所提供的含义：“abe”是指阿比可糖；“all”是指阿洛糖；“alt”是指阿卓糖；“api”是指芹菜糖；“ara”是指阿拉伯糖；“drib”是指2-脱氧核糖；“fru”是指果糖；“fuc”是指岩藻糖；“fuc-ol”是指岩藻糖醇；“gal”是指半乳糖；“gal”是指半乳糖；“galn”是指半乳糖胺；“galnac”是指n-乙酰半乳糖胺；“glc”是指葡萄糖；“glca”是指葡萄糖醛酸；“glcn”是指氨基葡糖；“glcn3n”是指2，3-二氨基-2，3-二脱氧-d-葡萄糖；glcnac”是指n-乙酰氨基葡糖；“glc-ol”是指山梨醇；“glcpa6et”是指葡萄糖醛酸乙酯；“gul”是指古洛糖；“gul”是指古洛糖；“ido”是指艾杜糖；“idoa”是指艾杜糖醛酸；“kdo”是指3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸；“lyx”是指来苏糖；“man”是指甘露糖；“mur”是指胞壁酸；“neu”是指神经氨酸；“neu2en5ac”是指n-乙酰-2-脱氧烯-2-烯胺酸；“neu5ac”是指n-乙酰神经氨酸；“neu5gc”是指n-葡糖酰神经氨酸；“psi”是指阿洛酮糖；“qui”是指奎诺糖；“rha”是指鼠李糖；“rha3，4me2”是指3，4-二-o-甲基鼠李糖；“rib”是指核糖；“rib5p”是指5-磷酸核糖；“ribulo(或rul)”是指核酮糖；“sa”是指唾液酸；“sor”是指山梨糖；“tag”是指塔格糖；“tal”是指塔罗糖；“xyl”是指木糖；“xyl2cme”是指2-c-甲基木糖；“xylulo(或xul)”是指木酮糖，和“β-d-galp4s”是指β-d吡喃葡萄糖4-硫酸盐。

当用于发明和权利要求的说明中所定义的主题的要素、附图或整数时，或当用于本发明的不同方面或实施方案时，术语“第一”、“第二”、“第三”等不意欲暗示优选顺序。

当限定试剂的浓度或比例时，限定的浓度或比例是试剂的初始浓度或比例。当值表示为一个或多个小数位时，适用标准舍入。例如，1.7涵盖1.650重复至1.749重复的范围。

在没有进一步限制的情况下，在化合物结构的表示中使用平键包括化合物的非对映体、对映体及其混合物。在化合物结构的表示中，在构建体的部分结构或亚结构中，二价基团的重复表示为：

其中，-x-是重复n次的二价基团。当二价基团是亚甲基(-ch2-)时，该二价基团的重复表示为：

将参考实施方案或实施例和所附附图页的附图来描述本发明。

附图说明

图1：名称为mut21-mal-βala-cmg3-nhch2)3cch2nh-cmg3-ad-dope(26)的构建体的不同表示。

图2：补体诱导裂解之后的测试管的图像。图像中的符号对应于制备kodecyte(以指定的浓度)中使用以下构建体：galsa1-l1(49)、galt17(35)、galcmg2(47)和galnacα1(48)。

发明详述

当配体是聚糖时，配体的多价表示尤其有利。单价形式的聚糖结合蛋白(gbp)与聚糖配体的亲和性一般非常低。聚糖配体的多价表示允许gbp例如抗体的结合亲和力增加。通常，聚糖配体的多价表示扩大了gbp相对于gbp对其聚糖配体的内在低亲和力的结合特异性的差异。因此，可以使用简单的凝集或细胞裂解测定来检测人血清中gbp的存在。

化学

制备(boc-gly2-hnch2)4c(3)(方案i的步骤i)

根据litherland等(1938)的出版物中公开的方法合成四胺(h2n-ch2)4c(1)。向1m水性nahco3(18.2ml)和i-proh(9ml)混合物的四胺1(500mg、1.52mmol)的搅拌溶液中添加boc-glyglynos(2)(4012mg、12.18mmol)(放出co2、起泡)。搅拌该反应混合物30min，然后加入6ml1m水性nahco3，并将混合物搅拌过夜。过滤(boc-gly2-hnch2)4c(3)的沉淀，用甲醇/水混合物(1∶1，20ml)充分洗涤，并在真空中干燥。产量1470mg(98％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)δ，ppm：8.491(t，j＝5.6hz，1h；nhco)，7.784(t，j＝6.6hz，1h；c-ch2-nhco)，6.858(t，j＝6hz，1h；nhcoo)，3.696(d，j＝5.6hz，2h；coch2nh)，3.675(d，j＝6hz，2h；coch2nhcoo)，2.685(d，j＝6.6hz，2h；c-ch2nh)，1.375(s，9h；c(ch3)3。

制备(cf3cooh·h-gly2-nhch2)4c(4)(方案i的步骤ii)

将(boc-gly2-hnch2)4c(3)(1450mg，1.466mmol)溶解于cf3cooh(5ml)，并将溶液在室温下放置2h。在真空下除去三氟乙酸，并用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用30ml(ch3ch2)2o轻微振荡30min.，然后倾析)以除去残留的cf3cooh。在真空下干燥固体残留物，将其溶解于最小体积的水中，通过sephadexlh-20柱，并用水洗脱。合并含有产物4的级分，蒸发至c.5ml并冷冻干燥。产量1424mg(93％)，白色固体。tlc：rf0.5(乙醇/浓缩nh3；2∶1(v/v))。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)δ，ppm：4.028(s，2h；coch2nh)，3.972(s，2h；coch2nh)，2.960(s，2h；c-ch2nh)。

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基-羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯(7)(方案ii的步骤i)

向搅拌的(甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯盐酸盐(5)(988mg，5mmol)的dmf(15ml)溶液中加入boc-glyglynos(2)(3293mg，10mmol)和(ch3ch2)3n(3475μl，25mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用o-二甲苯(70ml)稀释并蒸发。硅胶快速柱层析(填充在甲苯中，用乙酸乙酯洗脱)产生粗产物。将粗产物溶解于氯仿，并依次用水、0.5mnahco3和饱和kcl洗涤。将氯仿提取物蒸发，并在硅胶柱(填充在氯仿中，并用15∶1(v/v)氯仿/甲醇洗脱)上纯化产物。将级分蒸发，并在真空下干燥残留物，得到产物7的无色厚糖浆。产量1785mg，(95％)。tlc：rf＝0.49(7∶1(v/v)氯仿/甲醇)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)δ，ppm：7.826(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.979(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.348和4.095(s，2h；nch2coo)，3.969(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.689和3.621(s，3h；och3)，3.559(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(8)(方案ii的步骤ii)

向搅拌的7(1760mg，4.69mmol)的甲醇(25ml)溶液中加入0.2m水性naoh(23.5ml)，并将溶液在室温下放置5分钟。然后用乙酸(0.6ml)将该溶液酸化，并蒸发至干燥。在硅胶上对残留物进行柱层析(填充在乙酸乙酯中，用2∶3∶1(v/v/v)i-proh/乙酸乙酯/水洗脱)，产生回收的7(63mg，3.4％)和目标化合物8(1320mg)。然后将中间产物溶解于甲醇/水/吡啶混合物(20∶10∶1，30ml)，并通过离子交换柱(dowex50x4-400，吡啶形式，5ml)以除去残留的钠阳离子。然后用相同的溶剂混合物洗涤该柱，蒸发洗脱液，将残留物溶解于氯仿/苯混合物(1∶1，50ml)，并在真空下蒸发干燥。产物8的产量为1250mg(74％)，白色固体。tlc：rf0.47(4∶3∶1(v/v/v)i-proh/乙酸乙酯/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体的混合物c.3∶1。主要构象异构体；δ，ppm：7.717(t，j＝5hz，1h；nhco)，7.024(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.051(s，2h；nch2cooch3)，3.928(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.786(s，2h；nch2cooh)，3.616(s，3h；och3)，3.563(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.381(s，9h；c(ch3)3)ppm；次要构象异构体，δ＝7.766(t，j＝5hz，1h；nhco)，7.015(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.288(s，2h；nch2cooch3)，3.928(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.858(s，2h；nch2cooh)，3.676(s，3h；och3)，3.563(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.381(s，9h；c(ch3)3)。

方案i

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸n-氧代琥珀酰亚胺酯(boc-gly2(mcmgly)nos)(9)(方案ii的步骤iii)

向搅拌的8(1200mg，3.32mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(420mg，3.65mmol)的冰冷dmf(15ml)溶液中加入n，n’-二环己基碳二亚胺(754mg，3.65mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。滤掉沉淀的n，n’-二环己基脲，用dmf(15ml)洗涤，并将滤液蒸发至最小体积。然后用(ch3ch2)2o(50ml)搅拌残留物1小时，通过倾析除去乙醚提取物。在真空下干燥残留物，获得白色泡沫状酯9(1400mg，92％)。tlc：rf0.71(40∶1(v/v)丙酮/乙酸)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体的混合物c.3∶2。

主要构象异构体；δ，ppm：7.896(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.972(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.533(s，2h；nch2coon)，4.399(s，2h；nch2cooch3)，3.997(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.695(s，3h；och3)，3.566(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

方案ii

次要构象异构体；δ，ppm：7.882(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.963(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.924(s，2h；nch2coon)，4.133(s，2h；nch2cooch3)，4.034(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.632(s，3h；och3)，3.572(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

将酯9(1380mg)溶解于dmso以提供6ml的体积，并以0.5m的溶液使用(储存于-18℃)。

制备{boc-[gly2(mcmgly)]gly2-nhch2}4c(10)(方案iii的步骤i)

向搅拌的(cf3cooh·h-gly2-hnch2)4c(4)(277mg，0.265mmol)的dmso(2ml)溶液中加入酯9(1.591mmol，3.18ml的dmso中的0.5m溶液)和(ch3ch2)3n(295μl，2.121mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并用150μlacoh酸化，在真空下除去溶剂(冷冻干燥)。用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用20ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)。将固体残留物溶解于最小体积的丙酮中，并在硅胶柱(填充在丙酮中，并用丙酮洗脱，20∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水和15∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水)上分馏。将选择的馏分蒸发，并在真空下干燥残留物。纯的{boc-[gly2(mcmgly)]gly2-nhch2}4c(10)的产量为351mg(68％)，白色固体。tlc：rf0.38(15∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元在链中的顺式和反式构象异构体的混合物c.3∶2。

主要构象异构体；δ，ppm：8.593(t，j＝5hz，1h；nhco)，8.335(t，j＝5.4hz，1h；nhco)，7.821(t，j＝6.4hz，1h；c-ch2-nhco)，7.786(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.993(t，j＝6hz，1h；nhcoo)，4.139(s，2h；nch2co)，4.074(s，2h；nch2coo(ch3))，3.985(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.887(d，j＝5.4hz，2h；coch2nh)，3.726(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.634(s，3h；och3)，3.567(d，j＝6hz，2h；coch2nhcoo)，2.686(宽.d，j＝6.4hz，2h；c-ch2nh)，1.379(s，9h；c(ch3)3)。

次要构象异构体；δ，ppm：8.511(t，j＝5hz，1h；nhco)，8.158(t，j＝5.4hz，1h；nhco)，7.821(t，j＝6.4hz，1h；c-ch2-nhco)，7.786(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.993(t，j＝6hz，1h；nhcoo)，4.292(s，2h；nch2co)，3.998(s，2h；nch2cooch3)，3.954(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.826(d，j＝5.4hz，2h；coch2nh)，3.715(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.692(s，3h；och3)，3.567(d，j＝6hz，2h；coch2nhcoo)，2.686(宽.d，j＝6.4hz，2h；c-ch2nh)，1.379(s，9h；c(ch3)3。

制备{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]gly2-nhch2}4c(11)(方案iii的步骤ii)

将{boc-[gly2(mcmgly)]gly2-nhch2}4c(10)(330mg，0.168mmol)溶解于cf3cooh(2ml)，并将溶液在室温下放置40分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用20ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)以除去残留的cf3cooh，然后在真空下干燥。{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]gly2-nhch2}4c(11)的产量为337mg(99％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元在链中的顺式和反式构象异构体的混合物c.11∶10.

主要构象异构体；δ，ppm：4.370(s，2h；nch2co)，4.265(s，2h；nch2cooch3)，4.215(s，2h；coch2nh)，4.138(s，2h；coch2nh)，3.968(s，2h；coch2nh)，3.919(s，2h；coch2nh2⁺)，3.775(s，3h；och3)，2.914(s，2h；c-ch2nh)。

次要构象异构体；δ，ppm：4.431(s，2h；nch2co)，4.241(s，2h；nch2cooch3)，4.239(s，2h；coch2nh)，4.074(s，2h；coch2nh)，3.960(s，2h；coch2nh)，3.919(s，2h；coch2nh2⁺)，3.829(s，3h；och3)，2.914(s，2h；c-ch2nh)。

制备{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]2gly2-nhch2}4c(13)(方案iv的步骤i和ii)

向搅拌的(cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]gly2-hnch2)4c(11)(272mg，0.135mmol)的dmso(2ml)溶液中加入酯9(0.809mmol，1.62ml的dmso中的0.5m溶液)和(ch3ch2)3n(112μl，0.809mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并用70μlacoh酸化，在真空下除去溶剂(冷冻干燥)。用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用15ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)。将固体残留物溶解于最小体积的7∶1(v/v)丙酮/甲醇混合物中，并在硅胶柱(填充在丙酮中，并用7∶1(v/v)丙酮/甲醇洗脱，10∶2∶1(v/v/v)，9∶2∶1(v/v/v)，8∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水)上分馏。将选择的馏分蒸发，并在真空下干燥残留物。纯的{boc-[gly2(mcmgly)]2gly2-nhch2}4c(12)的产量为279mg(71％)，白色固体。tlc：rf0.42(8∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，每条链两个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：8.604，8.519，8.397，8.388，8.346，8.211，8.200，8.167，8.034，8.024，7.925，7.912，7.819和7.773(t，6h；6nhco)，6.992(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.302-3.723(18h；2nch2co，2nch2cooch3，5coch2nh)，3.692，3.689和3.632(s，6h；2och3)，3.566(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，2.686(宽.d，2h；c-ch2nh)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

将{boc-[gly2(mcmgly)]2gly2-nhch2}4c(12)(269mg，91.65μmol)溶解于cf3cooh(2ml)，并将溶液在室温下放置40分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用15ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)以除去残留的cf3cooh，然后在真空下干燥。{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]2gly2-nhch2}4c(13)的产量为270mg(98％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，每条链两个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：4.441-3.963(单个，18h；2nch2co，2nch2cooch3，5coch2nh)，3.920(s，2h；coch2nh2⁺)，3.833，3.824，3.780和3.773(s，6h；2och3)，2.918(s，2h；c-ch2nh)。

方案iii

制备{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(15)(方案iv的步骤iii和iv)

向搅拌的(cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]2gly2-hnch2)4c(13)(175mg，58.5μmol)的dmso(2ml)溶液中加入酯9(0.351mmol，0.702ml的dmso中的0.5m溶液)和(ch3ch2)3n(49μl，0.351mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并用70μlacoh酸化，在真空下除去溶剂(冷冻干燥)。将固体残留物溶解于最小体积的1∶1(v/v)乙腈/水混合物中，并在sephadexlh-20柱(用1∶1(v/v)乙腈/水洗脱)上分馏。将选择的馏分蒸发，并在真空下干燥残留物。纯的{boc-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(14)的产量为279mg(71％)，白色固体。tlc：rf0.42(8∶2∶1(v/v/v)丙酮/甲醇/水)。将含有{boc-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(14)的馏分合并，蒸发至c.2ml体积并冷冻干燥。初始产量为215mg(94％)。在硅胶柱(填充在乙腈中，并用4∶5∶2(v/v/v)i-proh/乙腈/水洗脱)上进行额外的纯化，产生169mgboc-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(收率74％，白色固体)。tlc：rf0.45(4∶5∶2(v/v/v)i-proh/乙腈/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，每条链三个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：8.594-7.772(三个，总计8h；8nhco)，6.989(t，j＝5.6hz，1h；nhcoo)，4.303-3.722(26h；3nch2co，3nch2cooch3，7coch2nh)，3.692和3.632(s，9h；3och3)，3.565(d，j＝5.6hz，2h；coch2nhcoo)，2.687(宽.d，2h；c-ch2nh)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

将{boc-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(146mg，37.36μmol)(14)溶解于cf3cooh(2ml)，并将溶液在室温下放置40分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用10ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)以除去残留的cf3cooh，然后在真空下干燥。{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]3gly2-nhch2}4c(15)的产量为147mg(99％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，每条链三个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：4.446-3.964(单个，26h；3nch2co，3nch2cooch3，7coch2nh)，3.924(s，2h；coch2nh2⁺)，3.836，3.828，3.824，3.783，3.778和3.773(s，9h；3och3)，2.919(s，2h；c-ch2nh)。

制备{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]4gly2-nhch2}4c(17)(方案iv的步骤v和vi)

向搅拌的(cf3cooh·h-gly2(mcmgly)]3-hnch2)4c(15)(68mg，17.16μmol)的dmso(1ml)溶液中加入酯9(0.137mmol，0.275ml的dmso中的0.5m溶液)和(ch3ch2)3n(14.3μl，0.103mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并用70μlacoh酸化，在真空下除去溶剂(冷冻干燥)。将残留物溶解于最小体积的1∶1(v/v)乙腈/水(0.25％acoh)混合物中，并在sephadexlh-20柱(用1∶1(v/v)乙腈/水(0.25％acoh)洗脱)上分馏。将含有{boc-[gly2(mcmgly)]4gly2-nhch2}4c(16)的馏分合并，蒸发至c.2ml体积并冷冻干燥。产量为81mg(96％)，白色固体。tlc∶rf0.24(4∶5∶2(v/v/v)i-proh/乙腈/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，每条链四个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：8.590-7.773(三个，10h；10nhco)，6.989(t，j＝5.6hz，1h；nhcoo)，4.303-3.722(34h；4nch2co，4nch2cooch3，9coch2nh)，3.691和3.631(s，12h；4och3)，3.565(d，j＝5.6hz，2h；coch2nhcoo)，2.684(宽.d，2h；c-ch2nh)，1.379(s，9h；c(ch3)3).

将{boc-[gly2(mcmgly)]4gly2-nhch2}4c(16)(74mg，15.16μmol)溶解于cf3cooh(1ml)，并将溶液在室温下放置40分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用10ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)以除去残留的cf3cooh，然后在真空下干燥。{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]4gly2-nhch2}4c(17)的产量为72mg(96％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，每条链四个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：4.446-3.964(单个，34h；4nch2co，4nch2cooch3，9coch2nh)，3.925(s，2h；coch2nh2⁺)，3.836，3.829，3.827，3.822，3.783，3.779，3.777和3.772(s，12h；4och3)，2.919(s，2h；c-ch2nh)。

制备{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]5gly2-nhch2}4c(19)(方案iv的步骤vii和viii)

向搅拌的(cf3cooh·h-gly2(mcmgly)]4-hnch2)4c(17)(16.8mg，3.403μmol)的dmso(1ml)溶液中加入酯9(27.2μmol，63μl的dmso中的0.5m溶液)和(ch3ch2)3n(3μl，21.6μmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并用100μlacoh酸化，在真空下除去溶剂(冷冻干燥)。将残留物溶解于最小体积的1∶1(v/v)乙腈/水(0.25％acoh)混合物中，并在sephadexlh-20柱(用1∶1(v/v)乙腈/水(0.25％acoh)洗脱)上分馏。将含有{boc-[gly2(mcmgly)]5gly2-nhch2}4c(18)的馏分合并，蒸发至c.1ml体积并冷冻干燥。产量为19mg(95％)，白色固体。tlc∶rf0.15(4∶3∶2(v/v/v)i-proh/乙腈/水)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，每条链五个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：8.595-7.772(三个，12h；12nhco)，6.989(t，j＝5.6hz，1h；nhcoo)，4.303-3.723(42h；5nch2co，5nch2cooch3，11coch2nh)，3.692和3.631(s，15h；5och3)，3.565(d，j＝5.6hz，2h；coch2nhcoo)，2.686(宽.d，2h；c-ch2nh)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

将{boc-[gly2(mcmgly)]5gly2-nhch2}4c(18)(19mg，3.25μmol)溶解于cf3cooh(0.5ml)，并将溶液在室温下放置40分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，用(ch3ch2)2o提取残留物三次(用5ml(ch3ch2)2o轻轻搅拌30分钟然后倾析)以除去残留的cf3cooh，然后在真空下干燥。{cf3cooh·h-[gly2(mcmgly)]5gly2-nhch2}4c(19)的产量为20mg(99％)，白色固体。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，每条链五个n-羧甲基-甘氨酸单元的构象异构体的混合物，δ，ppm：4.446-3.965(单个，42h；5nch2co，5nch2cooch3，11coch2nh)，3.924(s，2h；coch2nh2⁺)，3.835，3.829，3.827，3.825，3.823，3.783，3.779，3.777和3.773(s，15h；5och3)，2.919(s，2h；c-ch2nh)。

制备[cf3cooh·h-(gly2cmgly)5gly2-nhch2]4c，et3n-salt(20)(方案iv)

向产物19(463mg，0.07835mmol)的水(26ml)溶液中加入et3n(523μl，3.761mmol)，并将溶液在室温下放置18h。蒸发后，将残留物在真空下冷冻干燥。产物20的产量为587mg(98％)，白色固体。tlc∶rf0.39(1∶2∶1(v/v/v)chcl3/meoh/水)。

¹hnmr(600mhz，[d2]h2o，30℃)δ，ppm：4.309-3.919(176h；20nch2co，20nch2cooh，48coch2nh)，3.226(q，120h，j＝7.3hz；60nch2ch3)，2.964(宽.s，8h；4c-ch2nh)，1.305(t，180h，j＝7.3hz；60nch2ch3).

malditof质谱，m/z：5174，m+h；5196，m+na。

方案iv

方案v

制备活化的1，2-o-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(de-ad-osu)(23)(方案v的步骤i)

向双(n-羟基琥珀酰亚胺基)己二酸酯(21)(70mg，205μmol)的干燥n，n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中加入氯仿(1.5ml)中的1，2-o-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(22)(40μmol)，然后加入三乙胺(7μl)。将混合物在室温下放置2h，然后用乙酸中和，并在真空下部分浓缩。将残留物进行柱层析(sephadexlh-20，1∶1氯仿-甲醇，0.2％乙酸)，产生无色浆状产物23(37mg，95％)。

¹hnmr(cdcl3/cd3od，2∶1)5.5(m，4h，2×(-ch＝ch-)，5139(m，1h，-och2-cho-ch2o-)，4.58(dd，1h，j＝3.67，j＝11.98，-ccoohch-cho-ch2o-)，4.34(dd，1h，j＝6.61，j＝11.98，-ccoohch-cho-ch2o-)，4.26(m，2h，po-ch2-ch2-nh2)，4.18(m，2h，-ch2-op)，3，62(m，2h，po-ch2-ch2-nh2)，3.00(s，4h，onsuc)，2.8(m，2h，-ch2-co(ad)，2.50(m，4h，2×(-ch2-co)，2.42(m，2h，-ch2-co(ad)，2.17(m，8h，2×(-ch2-ch＝ch-ch2-)，1.93(m，4h，coch2ch2ch2ch2co)，1.78(m，4h，2×(coch2ch2-)，1，43，1.47(2bs，40h，20ch2)，1.04(m，6h，2ch3).rf0.5(氯仿-甲醇-水)，6∶3∶0.5。

制备[h-(gly2cmgly)5gly2-nhch2]3[de-co(ch2)4co-(gly2cmgly)5gly2-nhch2]c，na，et3n-盐(24)(方案v的步骤ii)

向搅拌的产物20(522mg，0.06821mmol)的水/2-丙醇混合物(16ml，2∶3)溶液中加入1mnahco3(547μl，0.547mmol)和de-ad-osu(23)(66.1mg，0.06821mmol)的二氯乙烷(368μl)溶液，并将溶液在室温下搅拌1.5h。用acoh(94μl)酸化后，蒸发溶液，并在真空下干燥残留物。将干燥的混合物溶解于3ml水/meoh(15∶1)，并置于c18反相柱(～45ml的相用75％meoh洗涤，然后用水/meoh15∶1洗涤)。用水/meoh(15∶1-50ml；9∶1-50ml；7.5∶2.5-50ml；1∶1-50ml；2.5∶7.5-100ml)依次洗脱物质。用水/meoh15∶1(通过nmr数据na盐，116mg，30.8％回收)和水/meoh9∶1(通过nmr数据et3n盐，63mg，13.6％回收)洗脱未反应的20。用水/meoh1∶1洗脱目标(h-cmg5)3c(cmg5-ad-de)(24)。纯的冷冻干燥产物24的产量为135mg(对(24)25.5％)，白色固体。tlc(1∶2∶1(v/v/v)meoh/乙酸乙酯/水)∶20rf0.06；24rf0.17。

(h-cmg5)3c(cmg5-ad-de)na1(et3n)20(24)：¹hnmr(700mhz，[d2]h2o/[d4]ch3oh2∶1(v/v)，30℃)δ，ppm：5.561(m，4h；2cisch＝chofde)，5.454(m，1h；och2-ch(oco)ch2oofde)，4.629(dd，1h，j＝12.3hz/2hz；och2-ch(oco)chocoofde)，4.462-4.057(181h；20nch2co，20nch2cooh，48coch2nh，och2-ch(oco)chocoofde，och2ch2nhofde)，3.597(t，2h，j＝5hz；och2ch2nhofde)，3.226(q，102h，j＝7.3hz；51nch2ch3)，3.099(broad.s，8h；4c-ch2nh)，2.557，2.532，2.522和2.456(三个，总计8h；4co-ch2ch2)，2.203(～dd，8h，j＝12hz/5.8hz；2ch2-ch＝ch-ch2ofde)，1.807和1.783(多个，8h；4co-ch2ch2)，1.526和1.475(重叠的m和t，总计193h；m，20ch2ofde；t，j＝7.3hz，51nch2ch3)，1.063(t，6h，j＝7hz；2ch3ofde)。

malditof质谱，m/z：6028，m+h；6050，m+na。

制备3-三氟乙酰氨基丙基-3，4-二-o-乙酰基-2，6-二-o-苄基-α-d-半乳糖吡喃糖基-(1→3)-2，4-二-o-乙酰基-6-o-苄基-β-d-半乳糖吡喃糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-3-o-乙酰基-6-o-苄基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖苷(27)(方案vi的步骤i)

根据pazynina等(2008)的出版物中公开的方法制备糖基受体(3-三氟乙酰氨基丙基)-2-乙酰氨基-3-o-乙酰基-6-o-苄基-2-脱氧-4-o-(2，4-二-o-乙酰基-6-o-苄基-β-d-半乳糖吡喃糖基)-β-d-半乳糖吡喃糖苷(25)。在-45℃下，在ar气氛下搅拌糖基受体25(500mg，0.59mmol)、硫代半乳糖苷26(576mg，1.18mmol)、nis(267mg，1.18mmol)、无水ch2cl2(25ml)和分子筛(500mg)的混合物30分钟。然后加入tfoh(21μl，0.236mmol)的无水ch2cl2(0.5ml)溶液。在-45℃下搅拌反应混合物2h，然后在4h内升温至-20℃。将混合物在-20℃放置过夜。然后加入额外量的硫代半乳糖苷26(144mg，0.295mmol、nis(66mg，0.295mmol)和tfoh(5μl，0.06mmol)，在-20℃保持搅拌2h，然后缓慢升温至室温(1h)。然后加入na2s2o3的饱和水溶液，并过滤混合物。用chcl3(300ml)稀释滤液，并用h2o(2x100ml)洗涤，通过棉绒过滤干燥，并浓缩。lh-20(chcl3-meoh)上的凝胶过滤产生白色泡沫状产物27(600mg，80％)。

¹hnmr(700mhz，cdcl3，特征信号)，δ，ppm：1.78-1.82(m，4h，chchc，oc(o)ch3)，1.84-1.90(m，1h，chchc)，1.91，1.94，1.97，1.98，2.06(5s，5x3h，4oc(o)ch3，nh(o)ch3)，3.23-3.30(m，1h，nchh)，3.59-3.65(m，1h，nchh)，4.05(m，1h，h-2¹)，4.33(d，1h，j1，27.55，h-1¹)，4.40(d，1h，j12.04，phchh)，4.42(d，1h，j1，28.07，h-1ⁱⁱ)，4.45(d，1h，j11.92，phchh)，4.48(d，1h，j12.00，phchh)，4.50(d，1h，j12.00，phchh)，4.52(d，1h，j12.04，phchh)，4.54(d，1h，j12.00，phchh)，4.57(d，1h，j12.00，phchh)，4.64(d，1h，j11.92，phchh)，4.99(dd≈t，1h，j8.24，h-2ⁱⁱ)，5.08-5.13(m，2h，h-3ⁱ，h-3ⁱⁱⁱ)，5.23(d，1h，j1，23.31，h-1ⁱⁱⁱ)，5.46(d，1h，j3，42.25，h-4ⁱⁱ)，5.54(d，1h，j3，43.11，h-4ⁱⁱⁱ)，7.20-7.40(m，20h，arh)；7.49-7.54(m，1h，nhc(o)cf3).rf0.4(phch3-acoet，1∶2).

制备3-氨丙基-α-d-半乳糖吡喃糖基-(1→3)-β-d-半乳糖吡喃糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖苷(29)(方案vi的步骤ii和iii)

根据zemplen将产物27(252mg，0.198mmol)脱乙酰(8h，40℃)，用acoh中和并浓缩。所得产物的tlc(ch3cl-meoh，10∶1)分析显示两个点：主要点具有rf0.45，在起始线上的另一个点(茚三酮阳性点)表明部分失去三氟乙酰基。因此，将产物用meoh(10ml)中的cf3coome(0.1ml)和et3n(0.01ml)处理1h来n-三氟乙酰化，浓缩，并进行硅胶上的柱层析(chcl3-meoh，15∶1)，产生白色泡沫的产物28(163mg，77％)，rf0.45(ch3cl-meoh，10∶1)。将产物28进行氢解(200mgpd/c，10mlmeoh，2h)，过滤，n-脱氟乙酰化(5％et3n/h2o，3h)并浓缩。在dowex50x4-400(h⁺)上的阳离子交换层析(用5％氨水洗脱)产生白色泡沫状产物29(90mg，98％)。

¹hnmir(d2o，特征信号)，δ，ppm：1.94-1.98(m，2h，cch2c)，2.07(s，3h，nhc(o)ch3)，3.11(m，j6.92，2h，nch2)，4.54和4.56(2d，2h，j1，28.06，j1，27.87，h-1ⁱ和h-1ⁱⁱ)，5.16(d，1h，j1，23.87，h-1ⁱⁱⁱ).rf0.3(etoh-buoh-py-h2o-acoh；100∶10∶10∶10∶3).

方案vi

制备3-氨丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-d-半乳糖吡喃糖基-(1→3)-β-d-半乳糖吡喃糖基-(1→1)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖苷(33)(方案vii的步骤i-iii)

根据paulsen等(1978)的出版物公开的方法制备糖基氯化物3，4，6-三-o-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-β-d-半乳糖吡喃糖基氯化物(30)。在室温下，在黑暗中搅拌糖基受体25(420mg，0.5mmol)、三氟甲磺酸银(257mg，1.0mmol)、四甲基脲(120μl，1.0mmol)和新鲜煅烧的分子筛的干二氯甲烷(20ml)溶液30分钟。加入另一部分的分子筛并加入糖基氯化物30(350mg，1.0mmol)的干二氯甲烷溶液(3ml)。在室温下搅拌混合物20h。过滤树脂，并用甲醇(4×10ml)洗涤，然后蒸发溶剂。硅胶上的层析(用氯仿中5-7％异丙醇洗脱)产生407mg(70％)作为端基异构体混合物的产物31(¹h-nmr质谱测定的α/β＝3.0)。

将产物31(407mg，0.352mmol)的甲醇溶液(30ml)用400mg10％pd/c氢解16h。然后滤掉树脂，用甲醇(4×10ml)洗涤，并在真空下浓缩产物。在20℃用2∶1吡啶-乙酸酐混合物(6ml)将干燥残留物乙酰化16h，试剂用甲苯共蒸发。硅胶上的两个层析步骤(用乙酸乙酯中的10％异丙醇洗脱，和用氯仿中的5-10％甲醇洗脱)获得160mg(42％)产物32和39mg(10％)产物32β。

向产物32(160mg，0.149mmol)的干甲醇(4ml)溶液中加入2m甲醇钠的甲醇(200μl)溶液。蒸发该溶液1h后，加入4ml水，将溶液放置16h，然后在dowex-h⁺柱(用1m氨水洗脱)上层析。将洗脱液蒸发，冻干，获得87.2mg(91％)3-氨基丙基三糖(33)。

在303k的brukerbiospingmbh光谱仪上记录¹hnmr谱。以ppm表示特征质子的化学位移(δ)，用hod(4.750)、chcl3(δ7.270)作为参照。以hz表示耦合常数(j)。用自旋-自旋去耦(双共振)技术和2d-¹h，¹h-cosy实验分配¹hnmr谱中的信号。

于25℃在数字偏振计perkinelmer341上测量旋光值。

用二羟基苯甲酸作为基质，在maldi-tofvision-2000光谱仪上进行质谱分析。

32：¹h-nmr(700mhz，cdcl3)：1.759-1.834(m，1h，chsp)；1.853-1.927(m，1h，chsp)；1.972，1.986，1.996，2.046，2.053，2.087，2.106，2.115，2.130，2.224(10s，10×3h，coch3)；3.222-3.276(m，1h，nchsp)；3.544-3.583(m，1h，ochsp)；3.591-3.661(m，2h，nchsp，h-5a)；3.764(dd≈t，1h，h-4a，j8.8)；3.787(dd，1h，h-3b，j3，43.7，j2，39.9)；3.836(br.t，1h，h-5b，j7.3)；3.882-3.920(m，1h，ochsp)；3.950(dd，1h，h-6’c，j6’，6”10.6，j5，6’5.2)；4.009(ddd，1h，h-2a，j1，27.9，j2，310.0，j2，nh9.0)；4.076-4.188(m，5h，h-6’a，h-6’b，h-6”b，h-5c，h-6”c)；4.415(d，1h，h-1a，j1，27.9)；4.443(d，1h，h-1b，j1，27.9)；4.529(dd，1h，h-6”a，j6’，6”12.0，j5，6”2.5)；4.548(ddd，1h，h-2c，j1，23.4，j2，311.6，j2，nh9.4)；4.893(dd，1h，h-3c，j3，43.1，j2，311.6)；5.021(d，1h，h-1c，j1，23.4)；5.039-5.075(m，2h，h-3a，h-2b)；5.339(dd≈d，1h，h-4b，j2.9)；5.359(dd，1h，h-4c，j3，42.7，j4，50.9)；5.810(d，1h，nhaca，j2，nh9.0)；6.184(d，1h，nhacc，j2，nh9.4)；7.310-7.413(m，1h，nhcocf3sp).rf0.31(etoac-iproh，10∶1).ms，[c43h60n3f3o25]h⁺的计算m/z：1076.35，实测值1076。

32β：¹h-nmr(700mhz，cdcl3)：1.766-1.832(m，1h，chsp)；1.850-1.908(m，1h，chsp)；1.923，1.969，1.982，2.059，2.071，2.099(2)，2.120，2.136，2.148(10s，10×3h，coch3)；3.230-3.289(m，1h，nchsp)；3.521(ddd，1h，h-2c，j1，28.2，j2，311.2，j2，nh7.8)；3.548-3.591(m，1h，ochsp)；3.591-3.648(m，2h，nchsp，h-5a)；3.743(dd≈t，1h，h-4a，j8.6)；3.795(br.t，1h，h-5b，j6.5)；3.852(dd，1h，h-3b，j3，43.6，j2，39.9)；3.873-3.923(m，2h，h-5c，ochsp)；4.002(ddd，1h，h-2a，j1，28.0，j2，39.5，j2，nh8.9)；4.039(dd，1h，h-6’b，j6’，6”11.6，j5，6’6.9)；4.087-4.144(m，3h，h-6’a，h-6”b，h-6’c)；4.160(dd，1h，h-6”c，j6’，6”11.2，j5，6”6.0)；4.409，4.417(2d≈t，2×1h，h-1a，h-1b，j7.6)；4.519(dd，1h，h-6”a，j6’，6”11.8，j5，6”2.5)；4.992(d，1h，h-1c，j1，28.2)；5.043(dd，1h，h-3a，j3，48.6，j2，39.5)；5.066(dd，1h，h-2b，j1，28.0，j2，39.8)；5.350(dd≈d，1h，h-4c，j3.2)；5.372(dd≈d，1h，h-4b，j3.4)；5.399(d，1h，nhacc，j2，nh7.8)；5.449(dd，1h，h-3c，j5，43.4，j2，311.3)；5.856(d，1h，nhaca，j2，nh8.9)；7.361-7.466(m，1h，nhcocf3sp).rf0.24(etoac-iproh，10∶1).ms，[c43h60n3f3o25]h⁺的计算m/z：1076.35，实测值1076。

方案vii

33：¹h-nmr(700mhz，d2o)：1.924-2.002(m，2h，ch2sp)；2.060，2.064(2s，2×3h，ncoch3)；3.102(m≈t，2h，nch2sp，j6.8)；3.592-3.644(m，1h，h-5a)；3.655(dd，1h，h-2b，j1，27.9，j2，39.9)；3.702(br.dd，1h，h-5b，j5，6’3.8，j5，6”8.2，j4，5≤1)；3.713-3.815(m，9h)；3.846(dd，1h，h-6’a，j6’，6”12.3，j5，6’5.3)；3.984-4.062(m，4h，ochsp，h-6”a，h-4b，h-3c)；4.123(dd≈d，1h，h-4c，j2.9)；4.206(br.t，1h，h-5c，j6.3)；4.248(dd，1h，h-2c，j1，23.6，j2，311.0)；4.542(2d≈t，2h，h-1a，h-1b，j7.4)；5.100(d，1h，h-1c，j1，23.5).rf0.55(meoh-1maq.py·acoh，5∶1).ms，[c25h45n3o16]h⁺的计算m/z：644.28；实测值644.[α]546nm+128(c0.3；mecn-h2o，1∶1)。

33β：¹h-nmr(700mhz，d2o)：1.938-1.991(m，2h，ch2sp)；2.055，2.062(2s，2×3h，ncoch3)；3.100(m≈t，2h，nch2sp，j6.9)；3.610(dd，1h，h-2b，j1，27.9，j2，39.9)；3.603-3.636(m，1h，h-5a)；3.682(br.dd，1h，h-5b，j5，6’4.9，j5，6”7.8，j4，5≤1)；3.693-3.826(m，11h)；3.842(dd，1h，h-6’a，j6’，6”12.1，j5，6’5.2)；3.934-3.972(m，2h，h-4b，h-2c)；4.012(dd，1h，h-6”a，j6’，6”12.2，j5，6”2.0)；4.023-4.057(m，1h，ochsp)；4.175(dd≈d，1h，h-4c，j2.9)；4.478(d，1h，h-1b，j1，27.9)；4.531(d，1h，h-1a，j1，28.1)；4.638(d，1h，h-1c，j1，28.4).rf0.48(meoh-1maq.py·acoh，5∶1).ms，[c25h45n3o16]h⁺：644.28的计算m/z；实测值644.[α]546nm+6(c0.3；mecn-h2o，1∶1)。

制备galili-t-17-de(35)(方案viii的步骤ii)

在1.5h内，将h2o(0.75ml)中的化合物24(4.3mg，5μmol)和et3n(0.5μl)分三部分加入搅拌的化合物34(5mg，6μmol)的干dmso(0.3ml)溶液中。在室温下搅拌混合物24h，然后进行柱层析(sephadexlh-20，meoh-h2o，3∶7)，获得粗产物35。冻干产物中的水，将残留物溶解于3ml水，加入nahco3(10mm)的水溶液至ph6.5，并将溶液冻干，获得3.7mg作为钠盐的化合物35。

¹hnmr(700mhz，d2o/cd3od，2∶1(v/v)，选择的化学位移)δ，ppm：1.06(t，j7.03hz，ch3ofde)，1.28-1.61(m，ch2ofde)，1.71-1.88(m，-coch2ch2ch2ch2co和-coch2ch2-)，1.90-1.99(m，och2ch2ch2n)，2.13-2.27(m，-ch2ch＝chch2-，nhc(o)ch3)，2.35-2.58(m，coch2ch2ch2ch2co-和-coch2ch2-)，2.93-3.24(broad.s，8h；4c-ch2nh)，4.63(dd，j2.49，j12.32，c(o)ochhchoch2o-)，4.67和4.70(2d，j1，27.81，j1，27.95，h-1ⁱ，h-1ⁱⁱ)，5.30(d，j1，23.92，h-1ⁱⁱⁱ)，5.42-5.47(m，-och2-cho-ch2o-)，5.52-5.58(m，4h，2×-ch＝ch-).malditof质谱，m/z：8188(m+na)；8204(m+k)；8226(mna+k)。

方案viii

制备(mal-βala-(gly2cmgly)5gly2-nhch2)3[de-co(ch2)4co-(gly2cmgly)5gly2-nhch2]c(37)(方案ix)

向25.3mg(3.3μmol)化合物24的4ml25％水性异丙醇(ipa)溶液中一次性加入n-马来酰基-β-丙氨酸n′-羟基琥珀酰亚胺酯(36)(5.3mg，20μmol)的mecn(500μl)溶液。加入nmm(1∶10(v/v)在ipa中，约20μl)将反应混合物的ph调节至7-8。将澄清溶液在室温下放置过夜，通过定性斑茚三酮试验检查反应终点。(试验中的阴性结果表明氨基组分已经被消耗)。在真空下用旋转蒸发器除去溶剂，用mecn(500μl)磨碎油性残留物，并将混合物超声处理10分钟。将所得浆料转移至eppendorf管并离心。在超声处理下用无水乙醚和mecn(3x400μl)反复洗涤固体，然后离心，直到通过tlc(chcl3-meoh-acoh，90∶8∶2v/v)无法检测起始试剂(mal-βala-onsu)。在真空下，用分子筛将最终乙醚洗涤后的沉淀干燥至恒重。获得含量为18.9mg(70％)的无定形白色粉末状(mal-βala-cmg3-nhch2)3cch2nh-cmg3-ad-dope(37)。分离物质可能含有约17摩尔叔胺和每摩尔37的一摩尔钠离子(ma⁺)。

rf0.4-0.5，(chcl3-meoh-h2o，1∶3∶1(v/v/v)加0.5％吡啶)。

na/et3n盐(～7.3m/met3n)的¹hnmr(700mhz，[d2]h2o/[d4]ch3oh1∶1(v/v)，30℃)δ，ppm：7.038(s，6h；3ch＝ch)，5.542(m，4h；2cisch＝chofde)，5.446(m，1h；och2-ch(oco)ch2oofde)，4.635(dd，1h，j＝12.2hz/2.3hz；och2-ch(oco)chocoofde)，4.516-4.041(181h；20nch2co，20nch2cooh，48coch2nh，de的och2-ch(oco)choco，och2ch2nhofde)，3.985(t，j＝6.8hz，6h；3nch2ofala)，3.594(t，2h，j＝4.5hz；och2ch2nhofde)，3.384(q，44h，j＝7.3hz；22nch2ch3)，3.079(宽.s，8h；4c-ch2nh)，2.777(t，6h，j＝6.8hz；3ch2coofala)，2.548，2.522，2.515和2.449(三个，总计8h；4co-ch2ch2)，2.195(～dd，8h，j＝11.5hz/5.8hz；2ch2-ch＝ch-ch2ofde)，1.812和1.776(多个，8h；4co-ch2ch2)，1.484和1.454(重叠t和m，总计106h；t，j＝7.3hz，22nch2ch3；m，20ch2ofde)，1.061(t，6h，j＝7.1hz；2ch3ofde)。

方案ix

制备(mut21-mal-βala-(gly2cmgly)5gly2-nhch2)3[de-co(ch2)4co-(gly)2cmgly)5gly2-nhch2]c(38)(方案x)

将一定量(12.5mg，7.4μmol)的命名为mut21的14-聚体寡肽(m.w.1693.17da)：

serglnthrasnasplyshislysargaspthrtyrprocys(seqidno：01)制备为4mlph6.6的在30％水性异丙醇中的0.1mnmm溶液。

方案x

将溶液与5ml溶有一定量(13.5mg，1.64μmol)37的相同缓冲液合并。在室温下搅拌反应混合物过夜，并离心。用未缓冲的30％(v/v)ipa-水透析上清液24小时，使用milli-q水透析袋，截留分子量为3.5kda(spectra/por3)以除去残留的寡肽物质。然后将所得浆料转移至冻干瓶，并冻干至恒重。获得质量为18.4mg(84％)的无定形白色粉末状构建体38。表征构建体的肽和脂质部分的低场质子的预期信号比示于¹hnmr(d2o/cd3od2∶1中3mg/ml，303k，700mhz)(图8)。

比较化学

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯(7)(对比方案i的步骤i)

使用其他方法制备化合物7。向搅拌的boc-甘氨酰-甘氨酸(23.2g，0.1mol)的150ml二氯甲烷悬浮液中加入n-甲基吗啡啉(11.0ml，0.1mol)，将溶液冷却至-15℃，在10分钟内加入氯甲酸异丁酯(13.64g，0.1mol)。然后在相同温度下向含有化合物39的反应混合物中加入1-羟基苯并三唑和(甲氧基羰基甲基氨基)-乙酸甲酯(7)(16.1g，0.1mol)的50mldmf溶液。将所得混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2h，蒸发至干燥。将残留物溶解于200ml二氯甲烷，并用100ml0.5mhcl和200ml2％aq.nahco3洗涤。在真空下蒸发溶剂，并在硅胶上的柱层析(chcl3中3％meoh)纯化残留物，得到无色玻璃状纯化合物7(34.08g，91％)。tlc：rf＝0.40(chcl3中的5％meoh)，rf＝0.49(7∶1(v/v)氯仿/甲醇)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)δ，ppm：7.826(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.979(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.348和4.095(s，2h；nch2coo)，3.969(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.689和3.621(s，3h；och3)，3.559(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3).rf0.49(7∶1(v/v)氯仿/甲醇)。

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(8)(对比方案i的步骤ii)

向搅拌的{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(8)(24.42mg，65.12mmol)的甲醇(325ml)溶液中加入0.2m水性naoh(325ml)，并将反应混合物在室温下放置15分钟，用乙酸(5ml)酸化，并蒸发至干燥。在硅胶上对残留物进行柱层析(甲醇-乙酸乙酯1∶1)，获得作为na-盐(20.44g)的目标化合物，将其溶解于甲醇/水/吡啶混合物(20∶10∶1，350ml)，并通过离子交换柱(dowex50x4-400，吡啶形式，5ml)以除去na阳离子。然后用相同的混合物洗涤该柱，蒸发洗脱液，并在真空下干燥，获得白色固体状纯化合物8(20.15g，86％)。tlc：rf0.47(i-proh/乙酸乙酯/水4∶3∶1)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体的混合物c.3∶1.主要构象异构体；δ，ppm：7.717(t，j＝5hz，1h；nhco)，7.024(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.051(s，2h；nch2cooch3)，3.928(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.786(s，2h；nch2cooh)，3.616(s，3h；och3)，3.563(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.381(s，9h；c(ch3)3)ppm；次要构象异构体，δ＝7.766(t，j＝5hz，1h；nhco)，7.015(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.288(s，2h；nch2cooch3)，3.928(d，j＝5hz，2h；coch2nh)，3.858(s，2h；nch2cooh)，3.676(s，3h；och3)，3.563(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.381(s，9h；c(ch3)3).rf0.47(4∶3∶1(v/v/v)i-proh/乙酸乙酯/水)。

制备{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸n-氧代琥珀酰亚胺酯(boc-gly2(mcmgly)nos)(9)(对比方案i的步骤iii)

向搅拌的{[2-(2-叔-丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(26.40g，73.13mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺(8.70g，75.65mmol)的冰冷dmf(210ml)溶液中加入n，n’-二环己基碳二亚胺(14.03g，68.10mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。滤掉沉淀的n，n’-二环己基脲，用dmf(80ml)洗涤。将滤液和洗液浓缩，用et2o(500ml)搅拌残留物1h。倾析乙醚提取物，并浓缩残留物，获得白色泡沫状化合物9(32.57g，97％)。tlc：rf＝0.71(丙酮/乙酸40∶1)。¹hnmr(500mhz，dmso[d6]，30℃)，n-羧甲基甘氨酸单元的顺式和反式的混合物c.3∶2。

主要构象异构体；δ，ppm：7.896(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.972(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.533(s，2h；nch2coon)，4.399(s，2h；nch2cooch3)，3.997(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.695(s，3h；och3)，3.566(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

对比方案i

次要构象异构体；δ，ppm：7.882(t，j＝5.1hz，1h；nhco)，6.963(t，j＝5.9hz，1h；nhcoo)，4.924(s，2h；nch2coon)，4.133(s，2h；nch2cooch3)，4.034(d，j＝5.1hz，2h；coch2nh)，3.632(s，3h；och3)，3.572(d，j＝5.9hz，2h；coch2nhcoo)，1.380(s，9h；c(ch3)3)。

rf0.71(40∶1(v/v)丙酮/乙酸)。

制备h2n-cmg2-nh2(45)(对比方案ii和iii)

向搅拌的boc-gly2-(mcm)gly-osu(9)(15.42g，33.68mmol)的dmso(50ml)溶液中加入乙二胺(40)(808mg，13.47mmol)和et3n(1.87ml，13.5mmol)的dmso(5ml)溶液。将混合物在室温下搅拌30分钟，用乙酸(1.2ml)酸化，然后用sephadexlh-20柱(柱体积1200ml，洗脱液-meoh/水2∶1+0.2％acoh)分馏。将含有化合物boc2mcmg(41)的馏分合并，蒸发溶剂，并在真空下浓缩残留物。产物再次用硅胶柱层析纯化，用2-丙醇/乙酸乙酯/水(2∶6∶1)作为洗脱液。将含有纯boc2mcmg(41)的馏分合并，蒸发溶剂，并在真空下干燥残留物，获得无色泡沫状目标boc2mcmg(41)(8.41g，84％)。tlc：rf＝0.48(ⁱproh/乙酸乙酯/水2∶3∶1)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，构象异构体的混合物～3∶2∶8.166，8.125，7.917和7.895(m，总计2h；2conhch2)，7.793(m，2h；nhch2ch2nh)，7.001(br.t，2h；2nhcoo)，4.277-3.893(总计12h；2ch2coo，4nch2co)，3.690和3.635(s，总计6h；2cooch3)，3.567(d，j＝5.8hz，4h；2ch2nhcoo)，3.131(m，4h；nhch2ch2nh)，1.379(s，18h；2c(ch3)3)ppm。

ms，m/z：769[m+na]，785[m+k]。

向搅拌的boc2mcmg(41)(4.88g，6.535mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液加入三氟乙酸(25ml)，将溶液在室温下放置1h。然后将反应混合物浓缩，用无水meoh(50ml)蒸发残留物三次，然后用et2o(100ml)提取残留物三次以除去痕量三氟乙酸。干燥所得沉淀(白色固体)，获得5.06g(～100％)作为双-三氟乙酸盐的mcmg(42)。tlc：rf＝0.23(乙醇/水/吡啶/乙酸5∶1∶1∶1)。

¹hnmr(500mhz，d2o，30℃)，构象异构体的混合物～5∶4∶4.400-4.098(总计12h；2ch2coo，4nch2co)，3.917(s，4h；2coch2nh2)，3.829和3.781(s，总计6h；2cooch3)，3.394(m，4h；nhch2ch2nh)ppm。

ms，m/z：547[m+h]，569[m+na]，585[m+k]。

向搅拌的h2n-mcmg-nh2(42)(5.06g，6.796mmol)的dmso(13ml)溶液加入boc-gly2-(mcm)gly-osu(9)(7.79g，16.994mmol)的dmso(17ml)溶液和et3n(2.83ml，20.4mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2h后，用乙酸(4.0ml)酸化，并用sephadexlh-20柱层析(柱体积1200ml，洗脱液-meoh/水2∶1+0.2％acoh)分馏。将含有纯boc2mcmg2(43)的馏分合并，蒸发溶剂，并在真空下浓缩残留物，获得无色泡沫状目标boc2mcmg2(43)(8.14g，97％)。tlc：rf＝0.25(ⁱproh/乙酸乙酯/水2∶3∶1)。

¹hnmr(500mhz，[d6]dmso，30℃)，构象异构体的混合物：8.393-7.887(总计6h；6conhch2)，7.775(m，2h；nhch2ch2nh)，6.996(br.t，2h；2nhcoo)，4.299-3.730(总计28h；4ch2coo，10nch2co)，3.691和3.633(s，总计12h；4cooch3)，3.564(d，j＝5.8hz，4h；2ch2nhcoo)，3.129(m，4h；nhch2ch2nh)，1.380(s，18h；2c(ch3)3)ppm。

ms，m/z：1256[m+na]，1271[m+k]。

将boc2mcmg2(43)(606mg，0.491mmol)溶解于cf3cooh(2ml)，并将溶液在室温下放置30分钟。在真空下蒸发三氟乙酸，并用et2o提取残留物三次(用25mlet2o磨碎，然后过滤)以除去残留的cf3cooh，在真空下干燥所得白色粉末。将粉末溶解于4ml水，然后冻干。定量估计h2n-mcmg2-nh2(44)(tfa盐)的产量(由于水合物的稳定性，实际重量比理论值大～10％)。tlc：rf＝0.21(乙醇/水/吡啶/乙酸5∶1∶1∶1)。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，构象异构体的混合物：4.430-4.014(总计28h；4ch2coo，10nch2co)，3.911(s，4h；2coch2nh2)，3.823和3.772(s，总计12h；4cooch3)，3.386(m，4h；nhch2ch2nh)ppm。

ms，m/z：1034[m+h]，1056[m+na]。

向h2n-mcmg2-nh2(44)(～0.49mmol)的水溶液(20ml)加入et3n(0.5ml)，并将溶液在室温下放置15h。将混合物蒸发至干燥，在sephadexlh-20柱(两种方法)上使残留物脱盐：方法a，将残留物溶解于水(3ml)，并在sephadexlh-20柱(柱体积250ml，洗脱液-meoh/水1∶1+0.05m吡啶乙酸酯)上使溶液脱盐。分别合并含有被盐污染的h2n-cmg2-nh2(45)的级分，蒸发，并将残留物再次脱盐。将含有纯h2n-cmg2-nh2(45)的合并级分蒸发至～4ml体积，并冻干。h2n-cmg2-nh2(45)(内盐)的产量为431mg(90％)。方法b，将残留物溶解于水(3ml)，并在sephadexlh-20柱(柱体积250ml，洗脱液-meoh/水1∶1+1％浓度aq.nh3）上使溶液脱盐。将含有纯h2n-cmg2-nh2(45)的级分蒸发至～4ml体积，并冻干。将残留物(h2n-cmg2-nh2(45)的氨盐)溶解于ⁱproh/水1∶1混合物(10ml)，加入et3n(0.2ml)，并将溶液蒸发至干燥。重复该过程两次；将残留物溶解于4ml水并冻干。h2n-cmg2-nh2(45)的二-et3n盐的产量为549mg(95％)。

tlc：rf＝0.50(iproh/meoh/乙腈/水4∶3∶3∶4+3％浓度aq.nh3)，或rf＝0.43(iproh/etoh/meoh/水1∶1∶1∶1，0.75mnh3)。

h2n-cmg2-nh2(45)内盐的¹hnmr(500mhz，[d2]h2o，30℃)，构象异构体的混合物：4.328-4.006(总计28h；4ch2coo，10nch2co)，3.907(s，4h；2coch2nh2)，3.381(m，4h；nhch2ch2nh)ppm。

ms，m/z：977[m+h]，999[m+na]，1015[m+k]。

制备h2n-cmg2-ad-dope(46)(对比方案iv)

向剧烈搅拌的h2n-cmg2-nh2(45)(425mg，0.435mmol内盐)的i-proh/水混合物(i-proh/水3∶2，10ml)溶液中加入1mnahco3(0.435ml，0.435mmol)水溶液，然后加入dope-ad-osu(23)(211mg，0.218mmol)的二氯乙烷溶液(0.4ml)。将反应混合物搅拌2h，然后用0.2mlacoh酸化，并在35℃蒸发至最小体积。在真空下干燥固体残留物(固体泡沫)，然后用chcl3/meoh混合物(chcl3/meoh4∶1，数次用10ml，tlc对照)充分提取。提取的残留物由未反应的h2n-cmg2-nh2(45)和盐组成(将根据合成h2n-cmg2-nh2(45)中所述的程序在硅胶上层析后的合并的残留物和级分脱盐回收约50％的h2n-cmg2-nh2(45))。在真空下蒸发合并的chcl3/meoh提取物(h2n-cmg2-ad-dope(46)、dope-ad-cmg2-ad-dope、n-氧基琥珀酰亚胺和一些h2n-cmg2-nh2(45)的溶液)并干燥。在硅胶柱(2.8x33cm，～200ml硅胶在chcl3/meoh5∶1中)上分离所得混合物。将混合物置于meoh/chcl3/水混合物(meoh/chcl3/水6∶3∶1+0.5％吡啶)中的柱上，逐步以三元梯度洗脱组分：从6∶3∶1至6∶2∶1，然后至6∶2∶2的meoh/chcl3/水组合物(均含有0.5％吡啶)。首先洗脱dope-ad-cmg2-ad-dope(rf＝0.75，meoh/chcl3/水3∶1∶1)，然后是期望的h2n-cmg2-ad-dope(46)(rf＝0.63，meoh/chcl3/水3∶1∶1)，最后洗脱的是h2n-cmg2-nh2(45)(rf＝0.31，meoh/chcl3/水3∶1∶1)。合并含有纯h2n-cmg2-ad-dope(46)的级分，并蒸发至干燥。为除去任何低分子量的杂质和溶解的硅胶，将残留物溶解于ⁱproh/水1∶2混合物(2ml)，并通过sephadexlh-20柱(柱体积130ml，洗脱液-ⁱproh/水1∶2+0.25％吡啶)。合并含有纯h2n-cmg2-ad-dope(46)的级分，并蒸发(加入～20％的2-丙醇以防止起泡)至干燥，将残留物溶解于水(～4ml)并冻干。h2n-cmg2-ad-dope(46)的产量为270mg(dope-ad-osu为68％或h2n-cmg2-nh2(45)为34％)。

¹hnmr(500mhz，[d2]h2o/[d4]ch3oh2∶1，30℃)：5.505(m，4h；2ch2ch＝chch2)，5.476(m，1h；och2chch2o)，4.626(dd，jgem＝11.6hz，1h；ochchch2o)，4.461-4.084(total37h；4ch2coo，11nch2co，ochchch2o，och2ch2n)，4.002(s，2h；coch2nh2)，3.573(m，4h；nhch2ch2nh)，2.536-2.463(m，总计8h；4ch2co)，2.197(m，8h；2ch2ch＝chch2)，1.807(m，8h；4ch2ch2co)，1.480(m，40h；20ch2)，1.063(～t，j≈6hz，6h；2ch3)ppm。

ms，m/z：1831[m+h]。

制备galili-cmg2-ad-dope(47)(对比方案v)

向搅拌的化合物34(66mg，0.079mmol)的干dmso(6ml)溶液分三次加入15μlet3n和粉末状h2n-cmg2-ad-dope(46)(95mg，0.0495mmol)。将混合物在室温下搅拌24h，然后进行柱层析(sephadexlh-20，i-proh-h2o，1∶2，0.5v％py，0.25v％acoh)，产生py-盐形式的粗化合物47。将该化合物冻干水两次，然后再溶解于10ml水，加入nahco3(50mm)水溶液至ph6.5，以获得na-盐形式的化合物47，并冻干溶液。化合物47(na-盐)的产量为114mg(86％基于nh2-cmg2-de)，rf0.6(i-proh-meoh-mecn-h2o，4∶3∶6∶4)。

¹hnmr(700mhz，d2o-cd3od，1∶1(v/v)，40℃；选择的信号)δ，ppm：1.05(t，j7.03hz，6h；2ch3)，1.40-1.58(m，40h；20ch2)，1.73-1.87(m，12h；2×-coch2ch2ch2ch2co和2×-coch2ch2-)，1.90-1.99(m，2h；och2ch2ch2n)，2.15-2.25(m，11h；2×-ch2ch＝chch2-，nhc(o)ch3)，2.39-2.59(2m，总计12h，2×-coch2ch2ch2ch2co-和2×-coch2ch2-)4.63(dd，1h，j2.51，j12.20，c(o)ochhchoch2o-)，4.67和4.69(2d×1h，j1,27.81，j1,27.95，h-1ⁱ，h-1ⁱⁱ)，5.30(d，1h，j1,23.88，h-1ⁱⁱⁱ)，5.42-5.46(m，1h，-och2-cho-ch2o-)，5.49-5.59(m，4h，2×-ch＝ch-)；malditof质谱，m/z：2567(m+na)；2583(m+k)；2589(mna+na)；2605(mna+k)；2611(mna2+na)。

制备galnacα1-3galβ1-4glcnac-ad-dope(33)(对比方案vi)

向产物23(33μmol)的n，n-二甲基甲酰胺(1ml)溶液加入30μmol3-氨基丙基三糖33和5μl三乙胺(et3n)。将混合物在室温下搅拌2h。硅胶上的柱层析(ch2cl2-etoh-h2o；6∶5∶1)获得81％产量的构建体48。

48：¹hnmr(700mhz，cdcl3-cd3od，1∶1v/v，选择)，δ，ppm：1.05(t，6h，j7.05，2ch3)，1.39-1.55(m，40h，20ch2)，1.75-1.84(m，8h，coch2ch2ch2ch2co和2×coch2ch2-)，1.84-1.96(m，2h，o-ch2ch2ch2-nh)，2.15-2.22(m，14h，2×(-ch2-ch＝ch-ch2-)，2×nhc(o)ch3)，2.34-2.46(m，4h，2×-ch2-co)，2.36-2.44(m，4h，2×-ch2-co)，3.29-3.34(m，1h，-ch2-chh-nh)，4.17-4.20(m，2h，-cho-ch2op-)，4.34-4.39(m，2h，-ch2opo-ch2-ch2)，4.57(d，1h，j1，28.39，h-1ⁱ)，4.50(dd，1h，j3.78，j10.82，-c(o)ochhchoch2o-)，4.58-4.61(m，2h，h-1ⁱⁱ，c(o)ochhchoch2o-)，5.15(d，1h，j1，23.76，h-1ⁱⁱⁱ)，5.38-5.42(m，1h，-och2-cho-ch2o-)，5.47-5.53(m，4h，2×-ch＝ch-).rf0.5(ch2cl2-etoh-h2o；6∶5∶1)

对比方案vi

制备galα1-3galβ1-4glcnac-ad-dope(49)(对比方案vii)

根据制备构建体48所用的相同方法制备构建体49。硅胶上柱层析的洗脱液：ch2cl2-etoh-h2o；6∶5∶1，构建体49的产量-84％。

49：¹hnmr(700mhz，cdcl3-cd3od，1∶1v/v，选择的信号)，δ，ppm：1.05(t，6h，j6.98，2ch3)，1.36-1.55(m，40h，20ch2)，1.73-1.84(m，8h，coch2ch2ch2ch2co和2×(coch2ch2-)，1.85-1.96(m，2h，o-ch2ch2ch2-nh)，2.14-2.22(m，11h，2×(-ch2-ch＝ch-ch2-)，nhc(o)ch3)，2.45-2.52(m，4h，2×-ch2-co)，2.36-2.45(m，4h，2×-ch2-co)，3.29-3.35(m，1h，-ch2-chh-nh)，3.52-3.62(m，3h，po-ch2-ch2-nh，-ch2-chh-nh)，4.13-4.18(m，2h，-cho-ch2op-)，4.19(d，1h，j3，42.48，h-4ⁱⁱ)，4.36(dd，1h，j6.8，j12.00，-c(o)ochhchoch2o-)，4.56(d，1h，j1，28.39，h-1ⁱ)，4.60(dd，1h，j2.87，j12.00，c(o)ochhchoch2o-)，4.61(d，1h，j1，27.57，h-1ⁱⁱ)，5.18(d，1h，j1，22.52，h-1ⁱⁱⁱ)，5.34-5.43(m，1h，-och2-cho-ch2o-)，5.45-5.54(m，4h，2×-ch＝ch-).rf0.45(ch2cl2-etoh-h2o；6∶5∶1)。

对比方案vii

生物学

制备kodecyte

在红血细胞(rbc)保存液(celpresol^tm，csllimited)中制备浓度为1mg/ml的构建体(35、47、48和49)的母液。稀释前，将各母液在室温(r.t.)下旋转45秒。向100μl体积的离心紧密的rbc(红细胞压积；pcv)添加100μl体积的稀释母液。将总体积为200μl的悬浮的rbc在37℃孵育2小时，然后用celpresol^tm洗涤，并在celpresol^tm中以5％pcv的浓度重悬修饰的rbc(“kodecyte”)。

制备drabkin溶液

将量为200mg的铁氰化钾(k3fe(cn)6、50mg的氰化钾(kcn)和140mg的磷酸二氢钾(kh2po4)和体积为1ml的非离子表面活性剂(tritonx-100)溶解于去离子水中，补至体积1l。将溶液储存于黑暗中的玻璃瓶，使用前确认ph为7.0-7.4。

制备edta溶液

将量为4.45g的乙二胺四乙酸(edta)的二钾盐(k2h2edta)和0.3g氢氧化钠(naoh)溶解于去离子水中，补至体积100ml。

检测患者血浆中的抗体

用与bovin等(2009)所述的方法类似的方法比较用不同构建体制备的kodecyte检测血浆样品中存在抗体的能力。结果如表1所示，这与受试者血清中mut21结合抗体(如果存在)的增加的亲和力一致。

补体诱导的细胞裂解

使用前，用磷酸缓冲盐水(pbs)洗涤并重悬kodecyte(5％pcv)。通过以下来确定rbc浓度的均匀性：向体积为1ml的drabkin溶液添加体积为40μl的kodecyte悬浮液并在540nm测量其相对于drabkin溶液(空白)的吸光度。通过调整悬浮体积将测量的吸光度的变化降低至小于1o％。

通过与henry和komarruju(2012)的出版物所述的方法类似的方法评估构建体诱导补体介导的自溶的能力。对于本次研究，用构建体49制备的kodecyte用作100％裂解对照。体积为200μl的汇集ab血清和体积为100μl的浓度为750μg/ml的用构建体49制备的kodecyte用作100％裂解对照。体积为200μl的汇集ab血清和体积为100μl的o型rbc(制备为没有添加构建体的kodecyte)用作o％裂解对照。为测量构建体诱导补体介导的kodecyte自溶的能力，将体积为200μl的汇集ab血清分配到两组试管中。向管添加体积为100μl的kodecyte，然后在37℃孵育1小时。孵育后，向各试管加入1μl乙二胺四乙酸(edta)的二钾盐以提供0.1mmedta的最终浓度。然后将试管离心，然后观察沉降rbc和上清液的特征(表2和图2)。此外，取出体积为160μl的不含细胞的上清液，将其加入体积为1ml的drabkin溶液。然后在540nm测量该溶液相对于添加有体积为160μl汇集ab血清的体积为1ml的drabkin溶液(空白)的吸光度。上清液的吸光度计算为kodecyte悬浮液的初始吸光度。根据标准曲线计算裂解的细胞的百分比。

表1.用以下样品测定的凝集分数：天然存在的miarbc(“阳性”对照)、用指示浓度的构建体38及其单体对应物制备的kodecyte和未修饰rbc(阴性对照)。¹根据bovin等(2009)的出版物公开的方法用构建体46制备构建体“单体mut21”。

表2.用于制备kodecyte的构建体和观察到的细胞裂解程度(定性)。

表3.用于制备kodecyte的构建体、两组样品中测量的吸光度(abs，450nm)，相对于100％对照的裂解细胞百分比和使用标准曲线计算的裂解细胞百分比。

用多价配体构建体35制备的kodecyte对自溶的敏感度似乎是用构建体49制备的kodecyte的约两倍。半摩尔和摩尔当量产生大致相等的细胞裂解程度。用构建体47制备的kodecyte比用命名49的构建体制备的kodecyte对裂解稍微更敏感。(该观察结果与用构建体38制备的kodecyte的抗体诱导的凝集的观察结果一致)。用构建体48制备的kodecyte似乎比用构建体49制备的kodecyte对裂解敏感两倍。当如galili等(2015)的出版物所公开的用于治疗患有肿瘤的患者的方法时，这些观察被认为是对构建体功效的预测。

尽管已经参考实施方案或实施例描述本发明，应当理解，在不背离本发明范围的情况下可以对这些实施方案或实施例进行变化和修改。例如，在化合物23和34的制备中，预期双(n-羟基琥珀酰亚胺基)琥珀酸双酯、双(n-羟基琥珀酰亚胺基)戊二酸双酯、双(n-羟基琥珀酰亚胺基)庚二酸酯和双(n-羟基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯中的每一个可以替代双(n-羟基琥珀酰亚胺基)己二酸酯(21)使用。

当存在特定要素、特征或整数的已知等效物时，如同其在本说明书中具体引用般引入这种等效物。例如，除了在本文具体描述的那些外，3-氨基丙基糖苷的制备公开于以下的出版物：audibert等(1987)，bovin等(1993)、galanina等(1997)、karelin等(2010)、korchagina和bovin(1992)、korchagina等(2009)、krylov等(2007)、nifant’ev等(1996)、pazynina等(2003)、pazynina等(2014)、ryzhov等(2012)、sherman等(2001)、vodovozova等(2000)和yashunsky等(2016)。尤其是，包括公开于或选自引用的出版物的要素、特征或整数的实施方式和实施例的变化和修改落入本发明范围，除非特意指明放弃。预期在别处公开的3-氨基丙基糖苷可以在本文所述的合成方案中替代化合物29和33。

本发明提供和在说明书中讨论的优点可以在本发明的这些不同实施方式的替代物或组合中提供。

引用的出版物

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