一种新型小分子肽和其在阿尔兹海默症检测中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种新型可与人ad7c-ntp特异性结合的小分子肽及其应用。

背景技术：

阿尔兹海默症是一种中枢神经退行性疾病，多发于老年人，主要症状为渐进性记忆丢失、认知功能障碍、智力水平的慢性缺失。据统计数据表明，65岁以上老人中发病率约为6％-12％，80岁以上的老人发病率为20％-40％，每年新增的痴呆人数达到近770万人，且每二十年老年痴呆患者数量增长一倍。到2020年，患者数目将高达6000万人；预计到2050年，将有约1.2亿人受到老年痴呆的影响。2013年，我国65岁以上的老年人人口数量达到1.4亿，我国目前至少有600万老年痴呆症患者，加之中国人口基数大、老龄化程度高，因此对于中国来说，该疾病也是一个强大的负担。2010年全球痴呆成本约6040亿美元，相当于全球总gdp的1％，其增长幅度可能会比患病率还要高，因而给家庭、社会带来了巨大的经济、人力负担。因此，阿尔兹海默症的及时诊断与治疗越来越受到广泛的关注与重视，早期诊断也成为了一个热点的话题。

到目前为止，阿尔兹海默症的诊断存在着如下的问题：1.基于美国精神医学学会出版的《精神疾病诊断与统计手册》为基础的结合量表诊断，在可信度、有效度、方便性等方面受到很大的局限；同时，量表存在一定的主观性，对于病人的心理因素、文化差异、地域差异、年龄等相关因素影响较大，所以可能造成针对不同医护人员与患者造成诊断结果不一的情况。2.基于病理学的检查需要获取脑组织，这一有创性检查实施难度较大，且难以让患者与其家属接受，可行性较差。3.对于影像学检查来说，脑核磁共振(mri)是老年痴呆临床鉴别诊断最主要的工具，可以很好的显示出脑的形态的改变，是ad检测很好的指标，但是该种方法需要持续观测，因此需要定期检查，这对于一些家庭可能会造成较大的经济负担，因此普及性不强。pet检查可以诊断与ad相关的代谢异常，但是价格昂贵，不适用于常规的检查。功能核磁共振(fmri)可以在ad早期提供更多的信息，但受其它功能影响较大，因此在临床上其诊断价值还需要进一步提高。

对于早期诊断来说，又具有如下局限：1.标志物存在于脑脊液中，获取困难，取材受到严重的影响，因此临床上难以运用。2.目前检测采用的磷酸化的tau蛋白无特异性，在其它神经系统疾病中也有变化，难以诊断。3.其它如igfbp6、cxcl8、icam-1等的标志物发现以及酶的测定对诊断没有指导意义，仅限于描述性研究，并无实用价值。

ntp又称为神经丝纤维蛋白，是人体大脑中一类磷蛋白，可以与神经丝蛋白(ptp)发生交叉反应，该类蛋白与神经细胞的发生与分化和神经变性以及突出丢失有关。suzannedelamonte等首次在ad患者的脑脊液中发现ad7c-ntp蛋白，该蛋白大小为41kd，含有375个氨基酸。随着研究发现，脑脊液与尿液中该蛋白的表达水平与ad的严重程度呈显著性相关关系，因此ad7c-ntp作为ad的一个生化指标，是一个敏感性和特异性极强的蛋白，对ad的检测有着极其重要的作用，这种无创性检测对于老年人常规体检有着非常广阔的前景。

目前，基于ad7c-ntp检测的方法均以ad7c-ntp的抗原决定簇肽段交联血兰蛋白作为抗原制备抗体，从而进一步检测使用。该方法具有如下的缺陷：1.多克隆抗体特异性低、易发生交叉反应。2.制备过程复杂、方法批间重复性差。3.价格较高、无普适性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异性结合ad7c-ntp的小肽及其应用。

本发明提供了一种小肽，其序列为seqidno.1和seqidno.2中的任一项所示。

本发明的小分子亲和肽，所述小分子亲和肽与人ad7c-ntp特异性结合。进一步的，本发明的小肽可用于检测ad7c-ntp。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1)高效：该小肽可以与ad7c-ntp特异性结合。

2)安全：该小分子亲和肽分子量小(小于6肽)，其残基序列取自20种必需氨基酸。

3)经济：该小肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控。

附图说明

图1为检测dewh与ad7c-ntp结合能力以及结合率。

图2为检测wrdw与ad7c-ntp结合能力以及结合率。

具体实施方式

实施例1：小分子肽合成

1)活化树脂：吸取0.75mlaf-amino-650m树脂，加入10-15mldmf浸泡，使其充分溶胀。

2)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取fmoc-氨基酸的用量是1.4mmol/g树脂，910mgtbtu，加入10mldmf和0.45ghobt混和均匀后，加入0.52mldiea配成反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用dmf洗涤树脂三次。检测氨基。

3)脱保护：浸泡树脂的dmf压滤除去，加入10ml含有20％哌啶的dmf溶液，氮气吹沸反应15min，然后压滤除去，脱除氨基的fmoc基团，用10ml异丙醇洗涤树脂三次，再用10mldmf洗涤三次，而后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。

4)重复步骤2)-3)过程：按多肽的顺序自c端向n端延伸多肽。重复脱保护.洗涤.缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。

5)除去其它保护：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按tfa/h2o/tis(95/2.5/2.5)的比例配成混和切割试剂，氮气保护下吹沸40min，而后再将其用氮气吹干，置于无水乙醇中，4℃保存。

根据上文方法共合成seqidno：1-2的2种小分子肽。

实施例2：亲和吸附验证

1)装柱：将连接肽段的树脂作为填料，做成柱子，在上安装。

2)上样：150mmpbs溶解蛋白，流速设为0.3ml/min，基线跑平后，上0.5mg蛋白质。

3)碱洗脱：10min时，注入0.5mlph9.0、150mm硼酸洗脱。

4)酸洗脱：20min时，注入0.5mlph2.0100mm盐酸洗脱。

6)计算洗脱比以及洗脱率。

结果见图，图1为dewh结果图，图2为wrdw结果图，由实验数据，wrdw吸附率在90％以上，dewh吸附率在85％以上，二者均为特异性吸附。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。