本发明涉及一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法与菌株。
背景技术：
长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。十二碳二元酸(dc12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。
dc12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。
然而，生物法合成十二碳二元酸的现有方法中，依然存在发酵水平不高，产品纯度达不到制备长链二元酸酯的要求，特别是二元酸产品中由于发酵菌株α，ω-氧化位点的不同，会产生一定含量的一元酸杂质，由于一元酸和二元酸不容易分离，这给后面合成尼龙1212的工艺带来巨大不便。
技术实现要素：
令人意外地，本发明的发明人通过长期生产实践过程中，意外地在发酵后废液(即含有废弃的生产菌株的发酵液中)筛选出一株热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201(保藏号cctccno.m2014545，保藏日期为2014年11月4日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心，分类命名candidatropicalisc1201)，其一方面能保持现有高水平发酵生产dc12的能力或略有提高，又具有高度专一的α，ω-氧化能力，使得产品一元酸的含量大大降低，即热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201为具有单一产品二元酸的高产菌株。此外，该菌株发酵获得产品二元酸，具有更大晶形，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求，更加符合欧美市场特别是欧盟市场对无尘化产品的要求
热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201的生理特征如下：
一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。
二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，l-阿戊糖+，d-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三、生长素的需要：生物素++，维生素b1++，维生素b2+，维生素b6+，维生素b12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。
形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。
发明所述的发酵转化正十二烷(nc12)生产十二碳二元酸(dc12)的方法是以热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201为发酵菌种，在以正十二烷为基质的培养基混合液中同步发酵，生产α，ω-十二碳二元酸。
发明所述的发酵转化正十二烷(nc12)生产十二碳二元酸(dc12)的方法的步骤为：
第一阶段为生产热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201的种子培养，即
优选地，把用一株热带假丝酵母c1201(candidatropicalis)培养成的种母液接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。
优选地，本发明的种子培养基：
(1)10巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；
(2)10巴林糖度的麦芽汁液体培养基；
(3)烷烃种子培养基包含：kh2po46～12g/l，酵母膏3～8g/l，玉米浆3～8g/l，蔗糖3～6g/l，重蜡40～70g/l，自来水配置，自然ph。
优选地，培养种子的过程为：取一接种环热带假丝酵母(candidatropicalis)c1201酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(
应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到od值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。
优选地，用本发明的c1201菌株生产长链二元酸，特别是十二碳二元酸的第二阶段是：
优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。
更优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph6.0～6.8的含有15～30％(v/v)的c12的正烷烃和85～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。
优选地，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～15g/l，最好为6～10g/l，氯化钠0.5～2.5g/l，最好为1.0～2.0g/l，消泡剂400～1200ppm，重蜡或蔗糖15～30g/l及一些其他公知的营养源。
应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以根据菌体在不同培养罐中的环境对上述条件进行改变。
优选地，所述热带假丝酵母c1201(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：将所述混合液在24～34℃下转化48～168小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。
更优选地，所述热带假丝酵母c1201(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：在ph6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最优选地在27～31℃通气发酵72～168小时。
优选地，发酵阶段的第一阶段中，体系ph控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系ph控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。更优选地，从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从kh2po4或nah2po4中选一种。
优选地，本发明还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段：
即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至ph10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集dc12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集dc12钠盐和dc12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到dc12白色结晶。
用本发明的热带假丝酵母c1201菌株和发酵方法，可在50m3发酵罐，从nc12发酵生产dc12时，发酵163小时，产酸量达220g/l以上，转化率达到90％以上，dc12纯度达到98％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。此外，令人意外地，如说明书附图图1所示，本发明的dc12产品具有令人满意的晶体状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。
附图说明
图1a为本发明方法实施例1制备的十二碳二元酸晶体；
图1b为对比例1方法制备的十二碳二元酸粉末产品。
具体实施方式
实施例1：
(1)、取一接种环热带假丝酵母c1201菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。
(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有kh2po48g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，ph5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6nnaoh调一次ph至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含kh2po410g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nc12200ml/l，自来水配置，ph7.2。在110℃下灭菌30分钟。
发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc12白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc12含量为89.8g/l，纯度99.43％，其中一元酸含量0.009％。
实施例2：
(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。
(2)把3000ml培养两天，od(×30，620nm)为0.81ph3.8，健壮，无杂菌种液接入装有700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm2，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700l种液接入装有6.5m3种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有33m3发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.5，开始时，nc124m3，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生28.5g/ldc12，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到120g/l，70小时后每天补加一定量nc12，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达205.8g/l，发酵到163小时结束，产酸量达225g/l。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。nc12转化率为92.8％，后处理总收率达到90.5％，dc12纯度达到99.35％，其中一元酸的含量0.008％。
实施例3：
(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
(2)把3000ml培养两天，od(×30，620nm)为0.81ph3.8，健壮，无杂菌种液接入装有2个700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm2，通气量1∶0.8，培养36小时，合并作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的2个700l种液分别接入2个装有26.5m3种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.7，培养40～48小时，合并作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有66m3发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的100m3发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.5，开始时，nc128m3，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生32g/ldc12，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到125g/l，70小时后每天补加一定量nc12，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵140小时，产酸量达215g/l，发酵到163小时结束，产酸量达213g/l。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc12产品。nc12转化率为90.8％，后处理总收率达到91.6％，dc12纯度达到99.45％，其中一元酸的含量0.009％。
对比例1：
该对比例使用中国科学院微生物所许可专利菌株热带假丝酵母uh-2-48，保藏号为cgmccno.0239菌株(参见专利zl95117436.3)，其他方法同实施例1即：
(1)、取一接种环热带假丝酵母uh-2-48菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。
(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有kh2po48g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，ph5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6nnaoh调一次ph至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含kh2po410g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nc12200ml/l，自来水配置，ph7.2。在110℃下灭菌30分钟。
发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc12白色粉末，用15ml中型乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc12含量为62.7g/l，纯度97.23％，其中一元酸的含量为大于1.2％。
此外，通过附图1的比较，本发明的实施例1获得产品晶体更大，而对比例1获得产品基本为粉末状。
对比例2：
该对比例使用微生物所许可专利菌株热带假丝酵母uh-2-48，保藏号为cgmccno.0239菌株(参见专利zl95117436.3)，其他方法同实施例2即：
(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。
(2)把3000ml培养两天，od(×30，620nm)为0.81ph3.8，健壮，热带假丝酵母uh-2-48无杂菌种液接入装有700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm2，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。
(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700l种液接入装有6.5m3种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m3二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。
(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液，接入装有33m3发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m3发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm2，通气量1∶0.5，开始时，nc124m3，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生20.1g/ldc12，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到108g/l，70小时后每天补加一定量nc12，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达133g/l，发酵到163小时结束，产酸量达143g/l。
发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc12，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色粉末状dc12产品。nc12转化率为88.8％，后处理总收率达到85％，dc12纯度达到96.35％，其中一元酸的含量大于1.5％。
以上实施例仅用以说明本发明专利的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明专利进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明专利的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明专利的权利要求范围当中。