本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX（简写为SPNP-IX）在制备电压门控钠通道工具试剂-Nav1.4型钠通道抑制剂中的用途。
背景技术：
电压门控钠通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钠通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钠通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。它们通过与钠通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX在制备电压门控钠通道工具试剂-Nav1.4型钠通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX（简写为SPNP-IX），其氨基酸序列为：
NH2-GluCysThrLysLeuLeuGlyGlyCysThrLysAspSerGluCysCysPro
HisLeuGlyCysArgLysLysTrpProTyrHisCysGlyTrpAspGlyThrPhe-NH2，
其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-IX作为单一有效活性组份用于制备Nav1.4型钠通道抑制剂。
所述的蜘蛛抑钠肽-IX的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之间分别形成二硫键。
该蜘蛛抑钠肽-IX作为单一有效活性组分用于制备Nav1.4型钠通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成Nav1.4型钠通道工具试剂。
蜘蛛抑钠肽-IX在制备Nav1.4型钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为1μmol/L。
蜘蛛抑钠肽-IX抑制Nav1.4型钠通道的半数有效作用剂量IC50为5.42μmol/L。
蜘蛛抑钠肽-IX对Nav1.4型钠通道的抑制呈现时间依从性，是一种较好的Nav1.4型钠通道工具试剂。
附图说明
图1是1μmol/LSPNP-IX对大鼠DRG神经元上Nav1.4型钠通道的影响。
图2是SPNP-IX作用于大鼠DRG细胞Nav1.4钠通道的时间-效应关系曲线。
图3是SPNP-IX作用于大鼠DRG细胞Nav1.4钠通道的浓度-效应关系曲线。
图4是SPNP-IX对大鼠DRG细胞Nav1.4钠通道电流-电压关系的影响。
图5是SPNP-IX对大鼠DRG细胞Nav1.4钠通道的稳态失活动力学的影响。
具体实施方式
为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用转染HEK293T细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-IX的Nav1.4型钠通道抑制作用。
1、实验材料和方法
1.1人胚肾细胞（HEK293T）的培养及转染
HEK293T细胞适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。
1.1.1细胞的传代培养
(1)HEK293细胞传代时机为达80-90%汇合，待细胞在60mm培养皿中长满后，吸掉培养液。
(2)加适量PBS漂洗两次，吸掉。
(3)加0.5mL0.25%胰酶，摇匀。37℃培养箱中胰酶处理2-3min。于显微镜下观察细胞是否全部脱壁。加入适量10%新生牛血清DMEM培养液终止胰酶反应。
(4)用移液管将细胞团轻轻吸打成单个细胞。将细胞按1∶3平均分入装有预热培养液的培养皿中，于37℃、5%CO2、15%相对湿度培养箱中培养。
1.1.2阳离子性的脂质体法转染方法:
（1）在转染前一天，对于35mm培养皿，每皿用2mL不含抗生素的培养液培养。
（2）转染的当天，细胞密度最好达到80-90%，吸掉旧培养液，PBS漂洗一次，换成2mL无血清opti-MEM培养液。
（3）每皿DNA用量为4μg，用无血清无血清opti-MEM培养液分别稀释到250μL，轻轻混匀,室温静置5min。
（4）同时将10μL脂质体加入250μL无血清opti-MEM培养液中，轻轻混匀，室温静置5min。
（5）将稀释的脂质体加入等体积DNA混匀，室温静置20min。
（6）将0.5mLDNA/脂质体复合物轻轻混匀，滴加入细胞中，轻轻混匀，常规条件培养。
（7）让DNA/脂质体复合物与细胞接触4-6h后，换成10%新生牛血清DMEM培养液培养。24-72h内可以进行膜片钳实验。
1.2膜片钳电生理活性实验
膜片钳实验均在室温（25±1℃）进行，采用全细胞膜片钳技术。挑选质膜光滑可见、胞质均匀的有绿色荧光的HEK293T细胞作为实验细胞。电流记录通过全细胞膜片钳技术利用EPC9放大器(HEKA公司,German)在电脑上进行。计算机记录和分析系统采用Pulse+Pulsefit8.0软件。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管（南京泉水教学实验器材厂）。玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪(Narishige,Japan)抛光后电极尖端直径约为3μm，充灌电极液后电极电阻为1-3MΩ。膜片钳实验要在室温条件下进行，整个实验过程中温度的变动最多上下不超过2℃。采用SigmaPlot9.0软件分析实验结果。
2、实验结果与分析
2.1SPNP-IX对Nav1.4型电压门控钠通道的影响
运用全细胞膜片钳技术，我们研究了SPNP-IX对瞬时表达于HEK293T细胞的钠通道亚型Nav1.4的抑制作用。钠通道亚型电流以同一种去极化方式诱导：将细胞膜电位钳制在-80mV，以50ms的时程给予一测试电压-10mV，每隔5s重复一次。
如图1所示，1μMSPNP-IX对Nav1.4通道有一定的抑制作用，其抑制程度分别为22.4±3.1%（n=5）。SPNP-IX对Nav1.4通道的抑制作用呈现明显的时间依从性，当毒素浓度为1μM时，约在1min左右的时间达到最大抑制。1μMSPNP-IX抑制Nav1.4通道的时间常数为18.5s（图2）。如图3所示，SPNP-IX对Nav1.4通道的抑制作用呈现明显的浓度依从性，半数有效抑制浓度（IC50）是5.42μmol/L。当剂量曲线用Hill公式拟合时，可得出SPNP-IX抑制Nav1.4通道的浓度效应曲线的Hill常数，它的大小为1.02。
2.2SPNP-IX对Nav1.4型电压门控钠通道激活状态的影响
在全细胞电压钳模式下，将细胞钳制在-100mV时，分别给予一系列测试电压，其变化范围为-80～+60mV，持续时间为50ms，步幅为+10mV，我们进一步检测了SPNP-IX对Nav1.4通道I-V曲线的影响，探究其对钠通道亚型激活过程的影响，结果如图4所示。空白对照条件下，当细胞膜电位钳制在-100mV时，Nav1.4通道的起始激活电压为-40mV，最大电流峰值激活电压为-10mV。在细胞周围加入SPNP-IX，毒素与细胞作用3min后，再以相同的去极化脉冲诱导I-V曲线，结果发现SPNP-IX对rNav1.4的上述电位都没有明显影响，说明JZTX-IX不影响rNav1.4的激活过程，同时说明毒素与通道的相互作用没有改变通道对离子通透的选择性。
2.3SPNP-IX对Nav1.4型电压门控钠通道稳态失活的影响
我们运用一标准双脉冲刺激方式，进一步观察了SPNP-IX对Nav1.4通道稳态失活特征的影响。结果如图5，对于Nav1.4通道，对照条件下，V1/2为-66.4±1.4mV（n=5），加SPNP-IX后，V1/2变为-73.6±1.1mV（n=7）。结果表明SPNP-IX能导致Nav1.4通道的稳态失活曲线往超极化漂移约7mV，而且没有明显改变Nav1.4通道对照曲线的斜率。
SEQUENCELISTING
<110>长沙沁才生物科技有限公司
<120>蜘蛛抑钠肽-IX
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<170>PatentInversion3.3
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<213>SPNP-IX
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TrpAspGlyThrPhe
3135