一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种苯基呋喃类小分子荧光探针及其应用。该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：式中，R1为卤素、烷基或烷氧基的单取代基或多取代基；R2为荧光团；n＝1-6；哌嗪环与荧光团之间以含1-6个碳的烷基链连接。该荧光探针分子可用来标记hERG钾离子通道，可用于hERG钾离子通道抑制剂的活性筛选及上市药物的心脏毒性的评价，另外也可作为工具药来进行hERG钾离子通道相关的药理、病理及生理学研究。此外，该类化合物制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单。
【专利说明】一种苯基呋喃类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苯基呋喃类衍生物及其作为hERG钾离子通道小分子荧光探针， 以及其在hERG钾离子通道抑制剂活性筛选、新药心脏毒性评价及细胞成像中的应用，属于 药物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] hERG的全称是human ether-a-go-go related gene，它是从人的海马神经中分离 出来的基因。hERG基因编码形成电压激活延迟内向整流的钾离子通道，大量分布在人的神 经系统和心脏组织中。在心脏组织中与起调节作用的0亚基KCNE2形成快速激活延迟整 流钾通道（IKr)，是心脏动作电位III期复极化延迟整流钾电流的快相成分。hERG基因突变 将引起LQTS (QT延长综合征）、SQTS (QT缩短综合征）等遗传性疾病。
[0003] hERG通道是III类抗心律失常药物作用的主要靶点。但近年来，发现各类非抗 心律失常药物，包括抗生素类药（如磺胺甲基异恶唑）、抗精神病类药（如氯丙嗪）、抗组 胺药（如特非那定）、胃动力药（如西沙比利）、抗疟药（如氯氟苯醇）等，易引起促心律 失常的副作用，导致用药者突然死亡。这些药物产生导致心律失常副作用的原因是药物与 心脏hERG通道有较高的亲和力，进而引起获得性QT延长综合征，引发像早后除极或严重的 尖端扭转型心律失常。目前药物临床前研宄中都要检测对心脏的毒性，其中检测的靶点为 hERG钾通道。
[0004] 目前对hERG离子通道的高通量筛选方法主要四种，即放射性配体结合或取代实 验、离子流的测量、膜片钳电流分析以及基于荧光探针的检测方法等。放射性配体结合或取 代方法需要使用放射性元素，会造成辐射危害；离子流检测则需要特殊的设备，价格较贵。 膜片钳的电流分析是离子通道活性检测的"金标准"，但其筛选通量较低，测量时技术要求 很高及劳动量高。虽然目前出现了半自动及全自动的膜片钳仪器，提高了筛选通量，但这 种仪器的价格昂贵，一般实验室难以承受。荧光探针的筛选方法无需特殊设备，一般实验 室都具备检测，测定方法简便快捷，是目前最为方便的初筛方法，深入筛选采用电压膜片钳 技术。而基于荧光探针的筛选方法主要是采用电压敏感荧光探针，像带负电荷的菁类染料 DiSBAC 4(3)、M〇lecular Device公司研发的FMP染料、基于荧光共振能量转移的荧光染料对 (CC2-DMPE/DiSBAC2(3)或者CC2-DMPE/DiSBAC4(3)染料对）等。这些荧光染料通过检测药 物对细胞膜电位的影响，来反映药物对离子通道的抑制活性。但这种荧光测定方法只是反 映对细胞所有离子通道的活性的影响，容易出现假阳性的结果。因此，研宄建立针对hERG 钾离子通道的荧光探针高通量筛选方法对药物研发及临床前评价药物的安全性具有重要 意义，这种方法将直接反应化合物对hERG钾离子通道的抑制活性，可有效降低假阳性结果 的出现。
[0005] 另外，在hERG钾离子通道病理、生理学研宄中，电压膜片钳技术仍是离子通道研 宄的最常用手段，也是最可靠的手段，但此方法对实验人员的技术要求较高，且需要特殊设 备。因此，人们经常寻找其他的替代方法进行研宄。近年来伴随着荧光分析法在生物化学、 医学和化学研宄中的发展，大量的荧光探针因其高灵敏度、动态分辨率以及与生物细胞和 生理学分析的兼容性被广泛应用于各种生物分析中。目前荧光探针的种类主要包括有机小 分子、纳米量子点、稀土配合物、蛋白质类等，其中小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量 和易自动化等特点，已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测 中，对疾病机制探讨、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。目前还没有文 献报道小分子荧光探针在离子通道结构和功能的研宄及离子通道参与的病理生理机制研 宄中的应用，文献大多报道采用功能性荧光蛋白（FPs)标记技术、免疫荧光技术、应用于细 胞的Ca 2+或Na+荧光探针等对离子通道进行研宄，这使得采用荧光小分子探针对离子通道 的生物、生理学性质研宄发展滞后。因此，如果能构建出针对hERG钾离子通道的高选择性、 高灵敏度的小分子荧光探针，并以此探针分子作为工具药去研宄hERG钾离子通道生物学 和生理学特征，将会为离子通道的研宄提供更方便、更有效、全新的研宄手段，从而推动离 子通道相关研宄的发展。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种苯基呋喃类小分子荧光探针及其制 备方法和在制药领域的应用。该小分子荧光探针对hERG钾离子通道具有高选择性和高灵 敏度，可以作为工具药去研宄hERG钾离子通道生物学和生理学特征。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种苯基呋喃类小分子焚光探针，该焚光探针的结构通式如式（I )所不：
[0009]
【权利要求】
1. 一种苯基呋喃类小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如式（I)所示：
式中，R1为卤素、烷基或烷氧基的单取代基或多取代基；R2为荧光团；η= 1-6 ;哌嗪环 与荧光团之间以含1-6个碳的烷基链连接。
2. 如权利要求1所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，所述Ri为卤素、甲 基、甲氧基及叔丁氧基；馬为萘二酰亚胺类、荧光素类、香豆素类、尼罗红类或Cy类荧光团。
3. 如权利要求2所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，所述1为卤素；1?2为 萘二酰亚胺类或荧光素类荧光团。
4. 如权利要求1所述的苯基呋喃类小分子荧光探针，其特征在于，该荧光探针选自具 有如下结构式的化合物：
O
5. 权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 识别基团的制备：将取代苯胺在酸性条件下，与亚硝酸钠反应，生成重氮盐，再与 糠醛在&1(：12的催化下发生偶联反应，生成4-取代苯基呋喃醛，再与1-氨基海因盐酸盐在 水溶液中反应，生成（E)-3-(4-氯丁基）-1-(((5-(4-取代苯基）呋喃-2-基）亚甲基） 氨基）咪唑啉-2, 4-二酮，接着再与单BOC保护的哌嗪发生取代反应，最后将BOC用TFA脱 除，得到（E)-1-(((5-(4-氯苯基）呋喃-2-基）亚甲基）氨基）-3-(4-(哌嗪-1-基）丁 基）咪唑啉-2, 4-二酮； (2) 探针分子的制备：在荧光团上引出卤素、磺酸酯或能发生取代的基团，最后通过取 代反应与（E)-I-(((5-(4-氯苯基）呋喃-2-基）亚甲基）氨基）-3-(4-(哌嗪-1-基） 丁基）咪唑啉-2, 4-二酮反应，制备探针分子；或者在荧光团上引入哌嗪环，然后再与 (E)-3-(4-氯丁基）-1-(((5-(4-取代苯基）呋喃-2-基）亚甲基）氨基）咪唑啉-2, 4-二 酮发生取代反应，制备探针分子。
6. 如权利要求5所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（1) 中，取代苯胺、亚硝酸钠和糠醛的加入的摩尔比为I:1 :1. 5。
7. 如权利要求5所述的苯基呋喃类小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述苯 胺为卤素取代的苯胺。
8. 权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道识别 中的应用。
9. 权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道抑制 剂高通量筛选及其在新药心脏毒性评价中的应用。
10. 权利要求1至4任一项所述的苯基呋喃类小分子荧光探针在hERG钾离子通道细胞 及组织成像中的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104449670SQ201410632550
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】杜吕佩, 李敏勇, 刘真真 申请人:山东大学