本发明属生物医药领域，涉及药物安全的评价技术，具体涉及一种体外药物代谢及相关毒性的评价研究方法。
背景技术：
药物代谢及其相互作用的评价研究是在研究中的新药（nce）安全评价的重要内容之一。根据中华人民共和国国家食品药品监督管理总局（cfda）“药物非临床药代动力学研究技术指导原则”（2014）：“非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（absorption,distribution,metabolism,excretion,简称adme）的过程和特征。”。
cfda的该指导原则着重指出：“在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。”
因此，nce是不是被代谢？代谢产物是什么？它们有没有毒性？是nce安全评价必须要回答的问题。
目前回答这些关键问题的常规评价技术路线是：
1.药物的代谢稳定性评价（metabolicstabilityassay）：研究评价nce是否被药物代谢酶所代谢？
2.药物代谢产物的鉴定（metaboliteidentification）：如果被代谢，它的代谢产物是什么？
3.药物代谢产物的毒性评价。
上述常规方法的挑战是：上述的3个评价路线独立进行，因此需要大量的时间和成本。特别是在进行代谢产物鉴定和毒性评价的试验中，用于体代谢产物的合成和提取的时间和成本非常大，在若干情况下，代谢产物合成和提取都是不可能的，比如，有些有毒的中间代谢产物非常不稳定。
上述挑战的直接后果是，有关创新团队在研发早期无法及时了解代谢产物的毒性特性，无法在早期进行分子改造和优化，以避免不必要的失败。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的评价研究的技术路线，尤其是一种评价药物代谢及相关毒性的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种新的评价研究的技术路线，具体涉及一种评价药物代谢及相关毒性的方法。本方法中将体外肝微粒代谢和体外细胞毒性实验结合一起，不需要通过鉴定和合成代谢产物，就可以准确的评价药物代谢后的毒性。本方法有利于节省人力物力并加速nce的创制进展。
本发明的一种评价药物代谢及相关毒性的方法，其包括，调查药物在人肝微粒体中的代谢情况，确定药物是否被代谢；如果被代谢，则进一步进行细胞代谢毒性的评价。
具体的，本发明的一种评价药物代谢及相关毒性的方法，其特征在于，其包括步骤，
1）药物的代谢稳定性评价（metabolicstabilityassay）：
研究评价nce是否被药物代谢酶所代谢？
该评价所依据的原理为
a)测试系统：人或实验动物肝微粒体，肝微粒含有体内最主要的药物代谢酶-cyp450药物氧化代谢酶系；
b)测试系统的辅酶：nadph；为cyp450的供氢体，其没有nadph，cyp450没有氧化代谢活性；
c)测试方法：将在nce与肝微粒体及cyp450辅酶ndaph一起在生理条件下孵育后，定量分析nce的母体浓度；
d)评价参数：在nce母体浓度在上述孵育后的下降程度；
如果nce的母体浓度在孵育后不显著下降，表明nce进入人体后不被代谢；
如果nce的母体浓度在孵育后显著下降，表明nce进入人体后被代谢。需要进一步鉴定代谢产物和评价其安全性；
评价的参数：半数下降时间（t1/2），即nce母体浓度下降50%所需的时间，因此t1/2越短提示nce越容易被代谢；
2)药物代谢的毒性评价（drugmetabolismbasedcytotoxicity）：
评价研究nce在被药物代谢酶代谢后产生的代谢（中间）产物是否对细胞有毒性，毒性是否发生改变？
e)测试系统：
体外药物代谢系统：人肝微粒体及cyp450药物代谢酶辅酶nadph（遵循美国usfda和中国cfda的指导原则）；
体外细胞毒性系统：小鼠3t3纤维母细胞（mouse3t3fibrolasts，3t3）;该系统没有药物代谢酶（遵循美国联邦政府毒性评价体外替代方法协调委员
会iccvam的指导原则）；
f)测试方法按下表1所示，
表1
更具体的，本发明的一种评价药物代谢及相关毒性的方法，其包括步骤：
1，确定待测物，
所述待测物选自新药（包括中药），化妆品，食品添加剂或环境化合物；
2，确定测试系统
所述测试系统包括体外药物代谢系统和体外细胞毒性系统；
所述的体外药物代谢系统选自人肝微粒体；本发明中根据国际医学伦理原则和知情同意原则和本单位标准操作程序-肝微粒体的制备（sop-p-006）制备；本发明的肝微粒含药物代谢i相酶、如cyp450，和药物代谢ii相酶、如葡萄糖醛酸转移酶ugt；不含有传染性病毒如hiv、hbv、hcv；
所述的体外细胞毒性系统选自3t3小鼠成纤维细胞；所述3t3mousefibroblast购自中国科学院上海细胞生物研究所。
3，确定主要的溶剂/缓冲液/培养基
准备1l100mm磷酸缓冲液（napo4buffer）：称取约11.93g无水na2hpo4和2.22g一水合nah2po4溶于1lmili-q水中，用磷酸调节ph至7.4，或者取22.6gna2hpo4•7h2o替代上述的11.93g无水na2hpo4；上述的试剂如有必要可以提前准备好或者预混合进行商业化出售；
i相药物代谢酶cyp450的辅酶-nadph工作液（nadphsolution）：准备5mm新鲜配制的预温的nadph：称取83mgnadph溶入20ml37oc预温的100mmnapo4buffer(ph7.4)；
肝微粒体工作液（livermicrosomesolution）：取0.78ml蛋白浓度为20mg/ml的肝微粒体加入24.22ml经37oc预温的100mmnapo4buffer(ph7.4)中，使蛋白终浓度为0.625mg/ml。
4，评价药物代谢及相关毒性
3t3细胞培养：胰酶消化3t3细胞，调节培养基体积使细胞密度达到2.8×105个/1ml，按100μl/孔的量加入96孔板中，空白孔加入100μl/孔的pbs作为试剂对照组，37°c，5%二氧化碳培养箱中培养24小时，弃去培养液，每孔各加入50μl含有5%新生牛血清的培养基，备用；
试验给药：
测试组：取25μl测试物溶液同200μl蛋白浓度为0.625mg/ml的肝微粒体溶液混合，37°c预孵育10分钟，预孵育结束后，每个样本中加入25μl5mmnadph溶液并混合以启动反应，37°c孵育60分钟后离心取50μl上清加入到3t3细胞中；
空白对照组：50μl5%的新生牛血清加入到3t3细胞中；
阳性对照组：加入50μl2xcpa溶液（与测试组一样经微粒体代谢后的上清）到3t3细胞中，cpa终浓度为：1、5、10、50、100、1000μm.；
试剂对照组：加入50μl1%dmso溶液到3t3细胞中。dmso的终浓度为0.5%；
显色反应：置二氧化碳培养箱中培养4小时，弃去培养液，每孔加入250μl的中性红溶液，培养3小时；弃去中性红溶液后，加入100μl的中性红显色液，振荡半小时后于570nm的酶标仪中进行检测，细胞活率越大显色越深；
5按系数公式计算数据
相对活率（%）=（实验组o.d.值-空白对照组o.d.值）/（试剂对照组o.d.值-空白对照组o.d.值）×l00%。
结果显示，cpa经小鼠肝微粒代谢后对3t3细胞有毒性；此结果与有关的文献报道一致，证明本发明的评价药物代谢及相关毒性的方法的可行性。
本发明的体外药物代谢及相关毒性的评价研究方法其优点有，
将体外肝微粒代谢和体外细胞毒性实验结合，不需要通过鉴定或提取合成代谢产物，能准确评价药物代谢后的毒性，本方法能明显节省人力物力财力，可广泛被运用到实际的代谢性毒性评价中，利于加速nce的创制进展。
具体实施方式
实施例1用本发明方法对环磷酰胺（cpa）进行代谢性毒性评价
将2xcpa的溶液加入到小鼠肝微粒体中，分成2组加减辅酶nadph，37°c孵育1小时后，离心取上清加入到已准备好的3t3细胞中，继续孵育4小时后，去除培养液，加入中性红进行显色反应；最后通过测570nm处的od值计算细胞的相对活率，判断cpa及其代谢产物对3t3细胞是否具有毒性；
试验结果显示：在无辅酶启动酶代谢反应的测试组中，cpa母体本身对3t3细胞的活率没有影响，说明对3t3细胞不具有毒性（如表2所示），然而，在经辅酶启动酶对其的代谢后，其代谢产物降低了3t3细胞的活率，说明对3t3细胞有毒性（如表3所示）；以上结果表明：cpa经小鼠肝微粒代谢后的代谢产物对3t3细胞具有毒性，此结果与其他的文献报道一致，证明本发明的技术方法的可行性。
表2.无辅酶nadph条件下（不启动酶代谢），cpa对3t3细胞的毒性
表3加入辅酶nadph后（启动酶代谢），cpa对3t3细胞的毒性
实施例2用本发明方法对他莫昔芬（tomaxifen；tox）进行代谢性毒性评价
将不同浓度的tox的溶液加入到肝微粒体中，分成2组加减辅酶nadph，37°c孵育1小时后，离心取上清加入到准备的3t3细胞中，继续孵育4小时后，去除培养液，此后每孔加入15μl3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide（mtt），使最后浓度为5mg/ml；再培育3小时，每孔加入150μl二甲亚砜（dmso），置于水平振动仪，以每分钟50次的水平摇动，在室温下培养10分钟，在570nm测光密度；
试验结果显示：在无辅酶启动酶代谢反应的测试组中（如表4所示），tom母体对3t3细胞的毒性明显大于经辅酶启动酶对tom代谢后的测试组（如表5所示），以上结果表明：与实施例1中cpa的代谢增毒过程相反，tox经肝微粒代谢后对3t3细胞的毒性减低，说明tox的代谢性质为解毒；另外，结果证明了本发明的方法的可行性，且适用于mtt和中性红染色。
表4无辅酶nadph条件下（不启动酶代谢），tom对3t3细胞的毒性
表5加入辅酶nadph后（启动酶代谢），tom对3t3细胞的毒性