本发明属于废弃资源回收利用领域，涉及一种甲壳素的分离提取方法，尤其是涉及一种基于可降解离子液体的虾蟹壳中甲壳素分离提取方法。
背景技术：
随着我国海产品业和人工养殖虾、蟹业的迅速发展，加工过程中每年大约会产生1千万吨的废弃虾、蟹壳。由于加工利用技术的缺乏，这些虾、蟹壳废弃物大部分只用于生产饲料、肥料等低附加值产品，甚至由于直接堆放、随意丢弃，造成了近岸、沿海的空气腐臭，严重污染环境。然而虾、蟹壳中含有丰富的钙(含量大约30-40％)蛋白质(含量大约占20-30％)、甲壳素(含量大约占15-30％)等宝贵的优质生物资源，若将这些物质分离出来并高效回收利用，制备高值化产品，可实现虾、蟹壳经济价值大幅增值。
目前大部分工业上提取甲壳素的方法主要是强酸浓碱高温法，第一步使用盐酸溶解虾、蟹壳中的钙，不仅具有强腐蚀性，而且产生大量废液，存在环境污染。第二步使用强碱来溶解除钙虾、蟹壳中的蛋白质，强碱会产生大量的高浓度废液，严重污染环境。另外蛋白质和甲壳素在虾、蟹壳中并不是以游离状态存在的，而是通过多羟基酚交联结合在一起共生形成糖蛋白，生成蛋白聚糖复合物。蛋白质和甲壳素的共生结构是导致蛋白质从虾、蟹壳中溶解分离不彻底的一个难点问题。而目前虾、蟹壳中蛋白质的常用的处理方法除了采用强碱进行溶解，另外一种是用蛋白酶进行酶解，然而蛋白酶价格较贵，水解率低，需多次酶解，且条件苛刻。
cn103757079a公开了一种甲壳素的分离提取工艺方法，所述方法以甲壳 类动物废弃物为原料加工生产水解蛋白与甲壳素，其先将虾壳或蟹壳烘干，再粉碎至40-80目投入酶切罐中加水并搅拌，在常温下静置溶胀；然后，将酶切罐加热至51-55℃，按投入虾壳粉原料0.6％的重量百分比加混合酶，调整ph值为6.5-7.5，搅拌酶切后压滤得酶切精滤液和净虾壳粉；将精滤液离心分离，下层剩余液体经脱色、二次精滤后，脱盐，再经真空浓缩、喷雾干燥得水解蛋白粉产品；将净壳粉加盐酸液浸泡脱钙后加氢氧化钠至中性后经过滤、清洗、烘干得甲壳素。该发明的方法涉及原料预处理、混合酶酶切、柱层析脱盐、水解蛋白粉制备和甲壳素制备过程，比较复杂，并且由于盐酸的使用会增加氯离子对水的污染，并且盐酸，氢氧化钠等的腐蚀性强，使用量不当会造成环境污染。
因此，在本领域，需要开发一种更为经济高效环保的甲壳素提取分离方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种甲壳素的分离提取方法，尤其是提供一种基于可降解离子液体的虾蟹壳中甲壳素分离提取方法。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种甲壳素的分离提取方法，所述方法包括以下步骤：
(1)利用柠檬酸两步除钙法去除虾蟹壳中的钙得到除钙虾蟹壳；
(2)利用可降解离子液体溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质，分离得到甲壳素。
在本发明中，通过利用所述方法可以实现虾蟹壳原料中钙的回收利用，以及可以分离得到蛋白质和甲壳素，实现了虾蟹壳废弃物的全组份、高值化利用。
优选地，步骤(1)所述柠檬酸两步除钙法包括以下步骤：
a、利用柠檬酸溶液溶解虾蟹壳，过滤得到一次除钙虾蟹壳和一次柠檬酸滤液；
b、利用柠檬酸溶液溶解一次除钙虾蟹壳，过滤得到二次除钙虾蟹壳和二次 柠檬酸滤液；
c、分别向一次柠檬酸滤液和二次柠檬酸滤液中加入柠檬酸钙晶种，静置析出柠檬酸钙。
优选地，步骤a所述柠檬酸溶液的质量百分比浓度为8-15％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。
优选地，步骤a所述柠檬酸溶液与虾壳质量比为5-8:1，例如5:1、5.2:1、5.4:1、5.6:1、5.7:1、5.8:1、5.9:1、6:1、6.2:1、6.4:1、6.6:1、6.8:1、7:1、7.3:1、7.5:1、7.8:1或8:1。
优选地，步骤a所述柠檬酸溶液溶解虾蟹壳的时间为2-4小时，例如2小时、2.2小时、2.4小时、2.6小时、2.8小时、3小时、3.2小时、3.4小时、3.6小时、3.8小时或4小时。
优选地，步骤a所述溶解时的温度为10-30℃，例如10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃。
优选地，步骤b所述柠檬酸溶液的质量百分比浓度为4-10％，例如4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％
优选地，步骤b所述柠檬酸溶液与一次除钙虾蟹壳质量比为4-6:1，例如4:1、4.2:1、4.4:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1、5:1、5.2:1、5.4:1、5.6:1、5.8:1或6:1。
优选地，步骤b所述溶解一次除钙虾蟹壳的时间为1-3小时，例如1小时、1.3小时、1.5小时、1.8小时、2小时、2.2小时、2.4小时、2.6小时、2.8小时或3小时。
优选地，步骤b所述溶解时的温度为10-30℃，例如10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃。
优选地，步骤c所述柠檬酸钙晶种的加入量为柠檬酸钙理论析出量的1-5％，例如1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.4％、2.8％、3％、3.4％、3.8％、4％、4.4％、4.8％或5％。
优选地，向步骤c所述析出柠檬酸钙后的柠檬酸液中补充步骤a和步骤b使用的柠檬酸总量的25-35％(例如25％、27％、29％、30％、32％、34％或35％)后可循环使用。
在本发明中，去除虾蟹壳中的钙的方法需要使用如上所述的两步法，是因为一次性加入柠檬酸溶液溶解虾蟹壳，若是酸浓度稍高，除钙率虽高(大于98％)但是生成的柠檬酸钙又溶解进了柠檬酸里，不再析出或析出量少。若是酸浓度低，析出的柠檬酸钙量虽多，但是会使得去除虾蟹壳中钙不完全，除钙率低。两步法除钙工艺中，两次柠檬酸的加入总量与一次性加入柠檬酸总量大致相同，并且采用梯级除钙法(即第一次柠檬酸浓度和酸总量相对于第二次较高，第一次除钙使得虾蟹壳大部分钙溶解后，虾蟹壳结构松动，然后再使用浓度较低的第二次酸除钙)，所以除钙率较高(大于98％)；但是将一次性的柠檬酸量分成两份分别来除钙，而后过滤，一次柠檬酸滤液和两次柠檬酸滤液分别析出柠檬酸钙，因两次的滤液酸量分别都不大，所以分别析出的柠檬酸钙不会再次溶解进一次和二次柠檬酸滤液里，所以两步法除钙工艺，既可以保证虾蟹壳除钙率，又可以保证柠檬酸钙析出量。
优选地，步骤(2)所述可降解离子液体为胆碱氨基酸离子液体。
优选地，步骤(2)所述可降解离子液体为胆碱甘氨酸离子液体、胆碱丙氨酸离子液体、胆碱亮氨酸离子液体、胆碱丝氨酸离子液体、胆碱赖氨酸离子液体、胆碱谷氨酸离子液体、胆碱天冬氨酸离子液体、胆碱苯丙氨酸离子液体、胆碱色氨酸离子液体、胆碱异亮氨酸离子液体、胆碱苏氨酸离子液体、胆碱缬 氨酸离子液体、胆碱精氨酸离子液体、胆碱组氨酸离子液体、胆碱谷酰氨酸离子液体、胆碱脯氨酸离子液体、胆碱甲硫氨酸离子液体或胆碱天冬酰氨酸离子液体中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述胆碱氨基酸离子液体的名称和离子结构如下表所示：
优选地，步骤(2)所述可降解离子液体与除钙虾蟹壳的质量比为5-20:1，例如5:1、5.3:1、5.5:1、5.8:1、6:1、6.5:1、6.8:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
优选地，步骤(2)所述利用可降解离子液体溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质的温度为80-130℃，例如80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃或130℃。
优选地，步骤(2)所述利用可降解离子液体溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质的时间为4-6小时，例如4小时、4.2小时、4.4小时、4.6小时、4.8小时、5小时、5.3小时、5.5小时、5.8小时或6小时。
优选地，步骤(2)所述分离为过滤分离，由于可降解离子液体可溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质，但是几乎不溶解甲壳素，因此通过过滤分离，可以得到甲壳素产品。
优选地，步骤(2)中溶解的蛋白质利用再生溶剂再生出蛋白质。
优选地，所述再生溶剂为水和/或乙醇。
优选地，再生出蛋白质后的可降解离子液体与再生溶剂分离后，向可降解离子液体中补充步骤(2)所述可降解离子液体使用量的10-20％后可以循环使用，多次循环使用效果与初次相当。
在本发明步骤(2)所述的去除虾蟹壳中蛋白质过程中，利用可降解离子液体，是因为其对蛋白质具有很强的溶解能力，虽然许多非可降解性离子液体对蛋白质也具有良好的溶解性，但是由于其不可降解性，甚至有些非可降解性离子液体具有毒性，这些离子液体作为溶剂一旦在工业化中大规模使用，过程中可能有一部分会流失到环境中，或者残留对生物体产生危害。而可降解离子液体绿色环保、易生物降解等特点，作为绿色溶剂为工业生产的环境问题提供了良好保障。
作为优选技术方案，本发明所述甲壳素的分离提取方法具体包括以下步骤：
(1)利用质量百分比浓度为8-15％的柠檬酸溶液于10-30℃下溶解虾蟹壳 2-4小时，所述柠檬酸溶液与虾壳质量比为5-8:1，过滤得到一次除钙虾蟹壳和一次柠檬酸滤液；利用质量百分比浓度为4-10％的柠檬酸溶液于10-30℃下溶解一次除钙虾蟹壳1-3小时，所述柠檬酸溶液与一次除钙虾蟹壳质量比为4-6:1，过滤得到二次除钙虾蟹壳和二次柠檬酸滤液；分别向一次柠檬酸滤液和二次柠檬酸滤液中加入为柠檬酸钙理论析出量的1-5％的柠檬酸钙晶种，静置析出柠檬酸钙，得到除钙虾蟹壳；
(2)利用可降解离子液体于80-130℃下溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质4-6小时，所述可降解离子液体与除钙虾蟹壳的质量比为5-20:1，过滤分离得到甲壳素。
在本发明中所述“虾蟹壳”是指虾壳和/或蟹壳。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过利用柠檬酸两步除钙法，结合利用可降解离子液体溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质，使得虾蟹壳中的甲壳素得以分离，与此同时得到的柠檬酸钙是食品钙强化剂，可产生除甲壳素之外的高附加值产品，并且还分离得到了蛋白质，实现了废弃虾蟹壳的全组份、高值化利用，变废为宝，不产生化境污染，解决了现有虾蟹壳制备甲壳素技术中使用盐酸除钙和碱除蛋白造成的环境问题，具有广泛的工业应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法分离提取甲壳素，具体包括以下步骤：
(1)将0.500g干燥的新鲜虾壳放入到100ml烧杯中，加入3.0g的10％柠 檬酸，反应2小时，过滤得一次除钙虾壳和一次柠檬酸滤液，然后再次加入1.5g的6％柠檬酸，反应1小时，过滤得二次除钙虾壳和二次柠檬酸滤液，将一次柠檬酸滤液和二次柠檬酸滤液分别放置，分别加入0.005g柠檬酸钙晶种，10小时后析出柠檬酸钙，共计0.1622g，除钙率为99％以上；将过滤出柠檬酸钙后的滤液合并，补充1.200g的10％柠檬酸溶液，可以循环使用。
(2)使用胆碱丙氨酸([cho][ala])离子液体5g溶解除钙虾壳，在110℃下搅拌4小时。反应结束，过滤的滤渣干燥后得到甲壳素0.1800g。过滤后的离子液体使用乙醇再生出蛋白质0.1200g，旋干乙醇后，补充离子液体1g，可继续循环使用。
实施例2
与实施例1不同之处在于，步骤(1)中过滤得二次除钙虾壳和二次柠檬酸滤液，将一次柠檬酸滤液和二次柠檬酸滤液分别放置，分别加入0.0025g柠檬酸钙晶种，10小时后析出柠檬酸钙，共计0.1422g，除钙率为99％以上；除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同。
实施例3
与实施例1不同之处在于，步骤(1)中溶解虾壳和溶解二次除钙虾壳时，所用均为3g的10％柠檬酸溶液将，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，析出0.1320g柠檬酸钙，除钙率为99％以上。
实施例4
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体溶解除钙虾壳反应温度是80℃，搅拌6小时，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素0.1770g，再生出的蛋白质为0.090g。
实施例5
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述再生溶剂使用水，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素0.1770g，再生出的蛋白质为0.050g。
实施例6
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱甘氨酸([cho][gly])离子液体，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1720g。
实施例7
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱丝氨酸([cho][ser])离子液体，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1550g。
实施例8
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱天冬氨酸([cho][asp)离子液体，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1490g。
实施例9
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱亮氨酸([cho][leu])离子液体，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1400g。
实施例10
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱色氨酸([cho][trp)离子液体，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1310g。
实施例11
与实施例1不同之处在于，步骤(2)所述离子液体为胆碱丙氨酸([cho][ala])离子液体2.5g溶解除钙虾壳，除此之外所用方法以及其余条件的选择均与实施例1相同，得到甲壳素质量为0.1502g。过滤后的离子液体使用乙醇再生出蛋白质0.1080g。
对比例1
在该对比例中，使用柠檬酸对虾壳进行一次除钙，分离提取甲壳素的具体步骤如下：
(1)将0.500g干燥的新鲜虾壳放入到100ml烧杯中，加入10％的柠檬酸溶液5g，反应4小时，过滤后得除钙虾壳。过滤后的滤液中加入0.010g柠檬酸钙晶种，10小时后析出0.1080g柠檬酸钙，虾壳除钙率在95-99％之间。
(2)使用胆碱丙氨酸([cho][ala])离子液体5g溶解除钙虾壳，在110℃下搅拌4小时。反应结束，过滤的滤渣干燥后得到甲壳素0.1755g。过滤后的离子液体使用乙醇再生出蛋白质0.1108g，旋干乙醇后，离子液体每次补充2g，可继续循环使用。
对比例2
在该对比例中不使用柠檬酸对虾壳进行两步除钙，而是直接使用1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐([emim][oac]离子液体10g溶解虾壳0.5g，在110℃下搅拌4小时。反应结束，离心得不溶物0.26g，上清液乙醇再生得再生物0.15g，分析不溶物及再生物成分，不溶物中碳酸钙含量46％，蛋白质43％，甲壳素11％，再生物中碳酸钙含量28％，蛋白质含量18％，甲壳素54％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。