技术领域本发明属于分子生物学领域，具体涉及畜禽肉中猪、牛、羊源性PCR鉴定用的引物体系及PCR鉴定方法与试剂盒，适用于上述三种动物肉类源性快速检测与真假鉴别。
背景技术：
肉与肉制品质量安全问题一直以来是全社会共同关注的热点话题。随着市场上猪肉和牛肉、羊肉价格差距的拉大，一些不法商家或个人为了追求自身利益，使用相对廉价的猪肉，通过各种手段的深加工，冒充牛肉、羊肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益，更直接影响着消费者的健康。近年来，随着“牛肉膏”、假冒牛、羊肉卷等事件的多次曝光，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检测显得尤为重要。而传统的以经验为主的鉴别方法已远不能满足科学监管的需要，因此，建立快速、准确的畜禽肉中猪、牛、羊肉源性成分鉴定方法势在必行。对食品进行动物源性成分鉴定，有利于维护消费者利益，避免假冒伪劣食品的出现，也有利于肉类产业健康发展。聚合酶链式反应（PCR）技术由于其操作简便、快速高效等特点，已逐步成为肉类种属鉴定的核心方法，在国内外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得创新性成果。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。而在目标基因的选择上，动物线粒体基因组DNA序列具有种内高度保守性和物种特异性，且由于拷贝数多而在食品加工过程未完全降解，因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。近年来根据线粒体基因组DNA序列差异位点设计物种特异性引物，建立PCR以及实时荧光PCR方法在国外已有相关报道，而在国内目前仅有少数文献报道了使用PCR技术对肉类来源的鉴别，且其扩增序列多数基于动物基因组中的微卫星序列，方法的灵敏度受到基因组DNA提取效率的影响很大，而且所涉及到的物种覆盖面少，检测范围窄，是否能够精确的从若干混合的肉类中检测出牛源性、羊源性或猪源性成分还有待于进一步考证。目前，基于线粒体DNA16SrRNA基因建立畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别的方法还未见相关报道。建立能够鉴别大量常见物种包括猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅等动物肉中猪牛羊源性成分的引物体系以及PCR方法，是提高肉品真假鉴别效率的有效途径之一，对打击假冒伪劣，维护市场秩序，提升食品安全监管能力具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种畜禽肉猪、牛、羊源性鉴别用引物体系和PCR鉴定方法及试剂盒，利用该引物体系和方法可快速准确的检测畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，并可对牛、羊肉真伪和掺假进行识别。本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：一种畜禽肉中猪牛羊三种肉类源性成分PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：（1）对猪16SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：正向引物序列为：CTCAACAAATTCACCAACAT，反向引物序列为：GTGCGAGGAGAAAGGC；（2）对牛16SrRNA基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：正向引物序列为：AAGGAATAACAACAATCTC，反向引物序列为：AGTGATTTGACTTGTGGG；（3）对羊16SrRNA基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：正向引物序列为：CCAGCAATAACATTAGCC，反向引物序列为：CTTTGAATCTTTCCTGGGT。本发明通过比对分析猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅九种动物线粒体DNA16SrRNA基因的差异性位点，设计猪、牛、羊的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其它物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对猪、牛、羊进行定性检测。本发明还提供了一种猪肉、牛肉、羊肉的PCR鉴定方法。以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据1.5%琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述样品总DNA模板来自猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅肌肉样品的混合，或上述各物种肌肉样品的一种。所述PCR扩增实验中特定的反应体系为20μL体系：2×PCRMix10ul，10μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，10μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，模板DNA1μL，双蒸灭菌水8.4μL。所述PCR扩增实验中特定的反应程序为：先进行95℃预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为：所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中猪物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为126bp，126bp扩增片段见以下序列划线部分：ACCAAAGCTAGCTCAACATATTAAACAAATACAAAAATACACCAAAATAAAATAAAACATTCACCTAACACTAAAGTATAGGAGATAGAAATTTTTATCCTGACGCTATAGAGATAGTACCGTAAGGGAAAGATGAAAGAATAAAATAAAAGTAAAAAAAAGCAAAGATTACCCCTTCTACCTTTTGCATAATGGTTTAACCAGAAAAAATCTAACAAAGAGAACTTTAGCTAGATACCCCGAAACCAGACGAGCTACCTATGAGCAGTTTAAAAGAACCAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGACTTGTAGGTAGAGGTGAAAAGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCGAGAAAGAATTTTAGTTCAACCTTAAAAATACCCCAAAAACCCTAAATTCCAATGTATTTTTAAGAGATAGTCTAAAAAGGTACAGCTTTTTAGAAACGGATACAACCTTGACTAGAGAGTAAAATCTTAATACTACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTGAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAAATTCACCAACATAATCCCAAAAACTAATAACAAACTCCTAGCCCAATACCGGACTAATCTATTGAAACATAGAAGCAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAGCCTTTCTCCTCGCACACGCTTACATCAGTAACTAATAATATACTGATAATTAACAATCAATAAACCAAAACAACACTAAAGCGTTTATTAATTATATTGTTAACCCAACACAGGAGTGCACCAAGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCTAGCATTACTAGTATTAGAGGCAATGCCTGCCCAGTGACACCAGTTTAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTTCTCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATAAAAAAATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTAACTATTCCAAAAGTTAAACAATTCAACCACAAAGGGATAAAACATAACTTAACATGGACTAGCAATTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGTACAAAAAACCCTCCGAGTGATTTTAATCTAGACAAACCAGTCAAAATAACCATAACATCACTTATTGATCCAAAATTTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAGAGTTCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACACCCAAATGGTGCAACCGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCGGTTTCTATCTATTATAAATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATGGGACCAACCTCACAAACGCGTCTCAGAGATAATTAATGATATAATCTTAACCTAATTAACTCATAATAAATCCAGCCCTAGAACAGGGCAC。牛物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为108bp，108bp扩增片段见以下序列划线部分：ACTAGACCTAGCCCAAAGATACCCTCTCGACTAAACAACCAAGATAGAATAAAACAAAACATTTAATCCCAATTTAAAGTATAGGAGATAGAAATCTAAGTACGGCGCTATAGAGAAAGTACCGCAAGGGAACGATGAAAGAAAAAAACTAAAAGTATAAAAAAGCAAAGATTACCCCTTGTACCTTTTGCATAATGAATTAACTAGTATAAGACTTAACAAAATGAATTTTAGCTAAGCAGCCCGAAACCAGACGAGCTACTCACAAACAGTTTACCAAGAACTAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGATTTGTAAGTAGAGGTGACATGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAGAAAATGAATCTAAGTTCAGCTTTAAAGATACCAAAAATTCAAATAAACCCCACTGTAGCTTTAAAAGTTAGTCTAAAAAGGTACAGCCTTTTAGAAACGGATACAACCTTGACTAGAGAGTAAAATTTAACACTACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTAAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAACAAAAATTAAATAGATTCCAACAACAAATGATTAACTCCTAGCCCCAATACTGGACTAATCTATTATAGAATAGAAGCAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAAAATTTTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGCCTGATAATACTCTGACCACTAACAGTCAATAAAAATAATCCAACAATAAACAATTTATTGATTATACTGTTAACCCAACACAGGAGTGCATCTAAGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCCAGCATTCCCAGTATTGGAGGCATTGCCTGCCCAGTGACAACTGTTTAACGGCCGCGGTATCCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTTCTCTAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCGCACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGCACAAATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACCAACCCAAAGAGAATAGATTTAACCATTAAGGAATAACAACAATCTCCATGAGTTGGTAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAATAAAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACCCACAAGTCAAATCACTCTATCGCTCATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCTATTACGTATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCAACTTTAAATCAAGCGCCTTAAGACAACCAATGATAACATCTCAACTGACAACACAAAACCCTGCCCTAGAACAGGGCTTA。羊物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为229bp，229bp扩增片段见以下序列划线部分：ACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCAGTTTAAATAACTAAATTAATTAAAATAAAACATTTACCCTAATTAAAGTATAGGAGATAGAAATTCTAAACACGGCGCTATAGAGAAAGTACCGCAAGGGAATGATGAAAGAAAAAAATCATAGTACAAAAAAGCAAAGATTAACCCTTGTACCTTTTGCATAATGAATTAACGAGCAAAAAACTTAACAAAACGAATTTTAGCTAAGTAACCCGAAACCAGACGAGCTACTTATAGACAGTTTATTAGAACCAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGATCCATAAGTAGAGGTGACATGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAGAAAATGAATTTTAGTTCAGCTTTAAAGATACCAAAAATACAAATAAATCCCACTGTATCTTTAAAAGTTAGTCTAAAAAGGTACAGCCTTTTAGAAATGGGTACAACCTTCACTAGAGAGTAAGATCTAAAAATACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTAAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAACAATAGTATTATTAATCCCAGCAATAACATTAGCCAACTCCTAGATTTAATACTGGACTATTCTATTACTAAATAGAAGAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAATATTTTCTCCTCGCACAAGTTTAAGTCAGTAACTGATAATACCCTGACCGTTAACAGTAAATAAAAATAACCCAACAATAAATGATTTATTACTTATACTGTTAACCCAACACAGGAGTGCACCCAGGAAAGATTCAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACTAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCCAGCATCCCTAGTATTGGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACTAAACGTTAAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTTCTCTAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTCCCCGTGAAGAGGCGGGGATAAATCAACAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTATGAGTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAAACCATCGCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACACCCCGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCTGTTATGTATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCAACTTTAACAAAGCGCCTTAAACCAATTAATGACTTTATCTTAATTAATTTCACAACAAAACCTGCCCTAGAAAAGGGCCCA。分别使用猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉来源的DNA模板，对引物进行特异性验证和比较，三种目标肉类均在设计位置观察到特异性条带，未见明显非特异性扩增。将猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉来源的DNA模板以及双蒸灭菌水按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1等比例混合，对引物特异性进行研究，三种目标肉类引物仅与对应肉类DNA发生扩增反应，均与其它肉类DNA无交叉反应。将157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别进行10倍梯度稀释，并进行灵敏度检测，目标DNA稀释104倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。本发明又提供了一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。可以将本发明所述引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂，也可以为其他适用的除样品总DNA模板以外的试剂。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。本发明的试剂盒可以由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器可以分别装有本发明中各物种的引物对。根据需要该引物可以是冻干形式或者溶于缓冲液中的状态。本发明所述试剂盒可用于单物种总DNA模板以及多物种混合总DNA模板进行猪肉、牛肉、羊肉源性鉴定。所述试剂盒尤其适用于牛、羊肉掺假判定。本发明的有益效果是：通过使用本发明的引物体系，可以有效检测多种畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，检测方法快速简单，准确性高，检测灵敏度达到皮克级，不仅能为检测牛源性和羊源性食品提供新的方法，而且能够抵御牛、羊肉掺假，维护消费者利益；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，具有较好的应用前景和良好的社会效益。附图说明图1是以本发明所述猪16SrRNA基因引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL2000DNAmarker；图2是以本发明所述牛16SrRNA基因引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL2000DNAmarker；图3是以本发明所述羊16SrRNA基因引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL2000DNAmarker；图4是以本发明所述引物对Ⅰ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL2000DNAmarker；图5是以本发明所述引物对Ⅱ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL2000DNAmarker。图6是以本发明所述引物对Ⅲ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL2000DNAmarker。图1-6中DL2000DNAmarker为标准核酸分子量标签，该标签自下向上以此为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的主要材料、试剂与仪器具体如下：样品：新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉购于超市和农贸市场。试剂：离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×PCRMix（南京博尔迪公司）；电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂（宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖（Promega公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；DNA测序由上海华大基因科技有限公司完成。仪器和设备：PCR仪（德国EPPENDORF公司）；凝胶成像系统（基因有限公司）；核酸蛋白检测仪（德国EPPENDORF公司）；高速冷冻离心机（日本日立）。实施例1特异性引物体系的设计：根据GenBank上公布的猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅九种动物线粒体DNA16SrRNA基因序列，经BLAST比对分析，针对各物种特异性碱基位点利用PrimerPremier5.0软件筛选出猪、牛、羊特异性引物对。各引物如下所述：对猪16SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：正向引物序列为：CTCAACAAATTCACCAACAT（SEQIDNO.1），反向引物序列为：GTGCGAGGAGAAAGGC（SEQIDNO.2）；对牛16SrRNA基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：正向引物序列为：AAGGAATAACAACAATCTC（SEQIDNO.3），反向引物序列为：AGTGATTTGACTTGTGGG（SEQIDNO.4）；对羊16SrRNA基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：正向引物序列为：CCAGCAATAACATTAGCC（SEQIDNO.5），反向引物序列为：CTTTGAATCTTTCCTGGGT（SEQIDNO.6）。实施例2（1）各物种肌肉总DNA提取：将新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉分别充分搅碎混匀，采用上述离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，提取好的总DNA样品分别溶于100ul洗脱液TE中，1%琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白测定仪测定260nm和280nm处吸光度值，计算DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。（2）采用实施例1中的3对引物，分别以上述猪肉、牛肉、羊肉DNA为模板，以其它动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。（3）20μL反应体系的配制：2×PCRMix10ul，10μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，10μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，模板1μL，双蒸灭菌水8.4μL。（4）PCR反应程序的制定：先进行95℃预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。（5）琼脂糖凝胶电泳：取（4）中所得PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1至图3所示：其中图1是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以猪线粒体DNA16SrRNA基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对Ⅰ仅对猪肉DNA模板特异扩增出126bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。图2是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以牛线粒体DNA16SrRNA基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示牛物种特异引物对Ⅱ仅对牛肉DNA模板特异扩增出108bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。图3是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以羊线粒体DNA16SrRNA基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示羊物种特异引物对Ⅲ仅对羊肉DNA模板特异扩增出229bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。通过上述实验及实验结果可知，当猪、牛、羊的各自引物对均分别与九种动物总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物仅对其自身物种的总DNA模板有反应，而对其它八个物种的总DNA模板没有反应，从而以单物种DNA模板方式验证了猪、牛、羊三个物种引物对的特异性。实施例3以所述各物种总DNA样品按照一定比例混合后的混合总DNA样品为模板：（1）混合总DNA样品的处理：将实施例2中九种动物总DNA样品等体积混合，其中每种动物肌肉DNA各占0.1体积，并与0.1体积的双蒸灭菌水混匀，作为混合DNA模板。（2）采用实施例1的3对引物，以混合DNA为模板，以9种动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。（3）20μL反应体系的配制：2×PCRMix10ul，10μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，10μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，混合DNA模板1μL，双蒸灭菌水8.4μL。（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。所得凝胶成像结果如图1至图3中的2孔所示。该方法以猪、牛、羊三个物种特异性引物分别与混合总DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了复杂总DNA模板条件下猪、牛、羊特异性引物的有效性和特异性。所述三种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。实施例4以所述猪、牛、羊肌肉DNA分别按照10倍梯度稀释后为模板，进行灵敏度实验。（1）DNA模板稀释处理：将实施例2中157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍和105倍。（2）分别采用实施例1的3对引物，以不同稀释倍数DNA为模板，建立PCR检测体系。（3）20μL反应体系的配制：2×PCRMix10ul，10μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，10μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ0.3μL，经稀释处理的DNA模板1μL，，双蒸灭菌水8.4μL。（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。所得凝胶成像结果如图4至图6所示。目标DNA稀释104倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。根据上述实施例2和实施例3中所述的PCR反应体系，本发明所述的引物体系可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，可用于畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴定，尤其适用于牛、羊食品的真伪和掺假鉴别。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，再不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。