本发明属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种具有抗氧化活性的红松籽肽及其制备方法，利用排阻色谱法和高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS/MS)从3～10kDa红松籽肽中鉴定出抗氧化肽，其特征在于，氨基酸序列是Phe-Thr-Gly-Ser-Lys(FTGSK)，分子量538.61，纯度为97％以上，该肽序列在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，其二级结构经过傅里叶红外光谱仪(FTIR)和圆二色谱仪(CD)测定后得出，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％。
背景技术：
目前，红松籽广泛应用于主菜，小吃等的制作，由于具有美容养颜，健脑益智的功效，在市场中颇受女性及中老年人群的欢迎。红松籽富含油脂和蛋白质，除此之外，还含有维他命，多酚组分等等。近几年来，研究者都将目光集中于红松籽油的研究，而红松籽蛋白的研究相对较少。另外，红松籽制油后废弃了大量的松子粕，采用松子粕为原料开发蛋白制品可以说是满足了环境友好型社会的要求，而且价格低廉，可进行工业化生产，因此具有广阔前景。近年来，抗氧化肽是研究热点，因为抗氧化肽除了具有清除体内自由基的功能，还具有防辐射，抗衰老等其他生物活性，因此抗氧化肽除了在功能性食品、保健食品方面有广泛应用，还可以应用于医药和化妆品等方面。
目前，很多抗氧化肽从动植物蛋白中鉴定出来，比如，从螺旋藻中鉴定的肽序列LAHICGVP，具有·OH清除能力；从大米中鉴定的肽序列FRDEHKK，KHDRGDEF，具有抑制脂质自动氧化，清除DPPH、·OH、O2-·的能力；从火麻仁中鉴定出的肽序列FLKLTAER，具有Fe2+螯合能力和清除DPPH、·OH、O2-·的能力，从草鱼中鉴定出肽序列PSKYEPFV，具有清除O2-·的能力，等等。相关研究表明，红松籽蛋白酶解物具有免疫活性和抗氧化活性，本发明提供了一种具有抗氧化活性的红松籽肽的制备方法。
在本专利中，DPPH清除率，电位稳定性，含有的官能团和二级结构含量，由于操作简单，准确度和精确度高，被用来作为抗氧化肽的评价指标。DPPH清除率越高，即代表抗氧化活性越强，电位通常用表示溶液中带电粒子的表面电荷，且电位的绝对值越大则溶液的稳定性则越大。二级结构包括α-螺旋，β-折叠，β-转角以及无序结构。本发明对于红松籽产品多样化、红松籽生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。
本发明的技术优势主要体现在以下三个方面：
第一，申请专利提供一条新的抗氧化肽序列Phe-Thr-Gly-Ser-Lys(FTGSK)，可广泛应用于功能性食品、保健食品等方面。
第二，申请专利的原料创新。是以3～10kDa红松籽肽为原料。
第三，申请的专利技术方法多元化。是以排阻色谱法，高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)为核心技术，以纳米粒度仪，傅里叶红外光谱仪(FTIR)和圆二色谱仪(CD)为辅助技术，其技术优势突出体现在：
(1)以排阻色谱法结合高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)纯化鉴定3～10kDa红松籽肽，得到抗氧化松子肽，并将合成肽纯化。其特征在于，氨基酸序列是FTGSK，分子量538.61，纯度为97％以上。
(2)鉴定出来的肽序列测定DPPH自由基清除率和电位，并且经过FTIR和CD的分析，可得知该肽序列在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；其二级结构测定结果为α-螺旋含量为1～3％，β-折叠含量为45～46％，β-转角含量为20～24％，无序结构含量为24～27％。
综上所述，纵观国内外相关研究与技术报道，肽序列FTGSK并未被发现。而且，也未见以排阻色谱法，HPLC-MS/MS为核心技术，以纳米粒度仪，FTIR和CD为辅助技术，纯化鉴定3～10kDa红松籽肽，并确定抗氧化肽二级结构特性。红松籽抗氧化肽的特征在于，氨基酸序列为FTGSK，分子量为538.61，纯度为97％以上，浓度1mg/mL～3mg/mL样品具有DPPH自由基清除率为16％～50％，电位为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1～3％，β-折叠含量为45～46％，β-转角含量为20～24％，无序结构含量为24～27％。
技术实现要素：
申请发明所需要解决的技术问题：公开一种具有抗氧化活性的红松籽肽及其制备方法，其特征在于，氨基酸序列是Phe-Thr-Gly-Ser-Lys(FTGSK)，分子量538.61，纯度为97％以上，浓度1mg/mL～3mg/mL样品具有DPPH自由基清除率为16％～50％，电位为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1～3％，β-折叠含量为45～46％，β-转角含量为20～24％，无序结构含量为24～27％。
本发明所涉及的一些缩写具有以下含义：
Phe(F)：苯丙氨酸
Thr(T)：苏氨酸
Gly(G)：甘氨酸
Ser(S)：丝氨酸
Lys(K)：赖氨酸
申请发明的技术方案是：
1.一种具有抗氧化活性的红松籽肽，其特征在于，氨基酸序列是Phe-Thr-Gly-Ser-Lys(FTGSK)，分子量538.61，纯度为97％以上，该肽序列在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，电位为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％。
2.一种具有抗氧化活性的红松籽肽的制备方法，其特征在于，以3～10kDa红松籽肽为原料，利用排阻色谱法和HPLC-MS/MS鉴定出松子肽序列，并对合成的抗氧化肽进行纯化；
1)所述的排阻色谱法，是指称取SephadexG-25或G-50凝胶，使其与蒸馏水比例为1:3～1:5(v/v)，室温溶胀时间2～5h，沸水溶胀0.5h～2h，将凝胶在2℃～6℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约5cm～10cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为200nm～280nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL～60mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为0.5mL～6mL，控制流速1mL/min～2.5mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥；
2)所述的HPLC-MS/MS方法，是指针对上一步骤中收集的组分Ⅰ进行分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为10μL～30μL，流速为0.5mL/min～1mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列；
3)所述的肽序列纯化过程，是指流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中，洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为10μL～30μL。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的红松籽肽，其特征在于，制得所述的红松籽肽后，其特性的确定是先测定其DPPH清除率，然后采用纳米粒度仪测定其电位，最后采用FTIR和CD测定其二级结构；
1)所述的FTIR测定，是指将溴化钾在100℃～150℃环境下干燥8h～12h，以备压片，150mg～300mg溴化钾压片作为空白样，1mg～3mg冻干粉和150mg～300mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样；
2)所述的CD测定，是指将起始波长设定为190nm～290nm，步长0.5nm～1nm，待测样品溶于去离子水，样品浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，上样量为200μL～500μL。
4.根据权利要求2所述的抗氧化红松籽肽的制备方法，其特征在于，所述的排阻色谱法，固定相选择的是SephadexG-25或G-50凝胶。
5.根据权利要求2所述的抗氧化红松籽肽的制备方法，其特征在于，所述的排阻色谱法，蒸馏水均过0.22μm的滤膜。
6.根据权利要求2所述的抗氧化红松籽肽的制备方法，其特征在于，所述的HPLC-MS/MS方法，肽序列可在1.5min～2min时被鉴定出来。
7.根据权利要求2所述的抗氧化红松籽肽的制备方法，其特征在于，所述的合成肽的纯化，洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min。
本发明技术效果：
(1)按照本专利叙述的技术方法，可以得到一条红松籽抗氧化肽，其特征在于，氨基酸序列为FTGSK，分子量538.61，纯度为97％以上，肽序列在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，电位为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；二级结构含量分别为：α-螺旋含量1％～3％，β-折叠含量45％～46％，β-转角含量20％～24％，无序结构含量24％～27％。
(2)以3～10kDa红松籽肽为原料，是一种红松籽粕的综合利用及减少污染的有效方法。
(3)提供了一条抗氧化肽，可应用于功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用，具有重要的意义。
附图说明
图1为以3～10kDa红松籽肽为原料，利用排阻色谱法得到组分Ⅰ的纯化图。
图2为以组分Ⅰ为原料，利用HPLC-MS/MS鉴定得到肽序列FTGSK。
图3为以FTGSK为原料，利用HPLC-MS/MS纯化得到纯度为97％以上的肽序列FTGSK。
图4为肽序列FTGSK的FTIR图谱。
图5为肽序列FTGSK的CD图谱。
具体实施方式
实施例1：
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水的比例为1:3(v/v)，室温溶胀时间2h，沸水溶胀0.5h，将凝胶在2℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约5cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为260nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为30mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为3mL，控制流速1mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥。将组分Ⅰ溶于去离子水中进行HPLC-MS/MS分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为10μL，流速为0.5mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列。将肽序列合成并进行纯化，流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中。洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为10μL。
测定合成肽的DPPH自由基清除率并采用纳米粒度仪测定其电位。将溴化钾在100℃环境下干燥8h，以备压片，150mg溴化钾压片作为空白样，1mg冻干粉和150mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样，用傅里叶红外光谱仪进行分析。用圆二色谱仪分析肽序列二级结构含量，将起始波长设定为190nm～270nm，步长0.5nm，待测样品溶于去离子水中，样品浓度为0.5mg/mL，上样量为200μL。最终得到纯度为97％以上，在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％的抗氧化肽序列。
实施例2：
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水的比例为1:3(v/v)，室温溶胀时间3h，沸水溶胀1h，将凝胶在3℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约6cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为260nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为40mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为2mL，控制流速2mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥。将组分Ⅰ溶于去离子水中进行HPLC-MS/MS分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为20μL，流速为1mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列。将肽序列合成并进行纯化，流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中。洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为20μL。
测定合成肽的DPPH自由基清除率并采用纳米粒度仪测定其电位。将溴化钾在120℃环境下干燥9h，以备压片，200mg溴化钾压片作为空白样，1mg冻干粉和200mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样，用傅里叶红外光谱仪进行分析。用圆二色谱仪分析肽序列二级结构含量，将起始波长设定为190nm～280nm，步长1nm，待测样品溶于去离子水中，样品浓度为1mg/mL，上样量为250μL。最终得到纯度为97％以上，在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％的抗氧化肽序列。
实施例3：
称取SephadexG-50凝胶，使其与蒸馏水的比例为1:5(v/v)，室温溶胀时间4h，沸水溶胀2h，将凝胶在4℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约7cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为280nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为50mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为4mL，控制流速2.5mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥。将组分Ⅰ溶于去离子水中进行HPLC-MS/MS分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为30μL，流速为0.5mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列。将肽序列合成并进行纯化，流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中。洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为30μL。
测定合成肽的DPPH自由基清除率并采用纳米粒度仪测定其电位。将溴化钾在130℃环境下干燥10h，以备压片，270mg溴化钾压片作为空白样，1.3mg冻干粉和270mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样，用傅里叶红外光谱仪进行分析。用圆二色谱仪分析肽序列二级结构含量，将起始波长设定为190nm～270nm，步长0.5nm，待测样品溶于去离子水中，样品浓度为0.5mg/mL，上样量为400μL。最终得到纯度为97％以上，在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％的抗氧化肽序列。
实施例4：
称取SephadexG-50凝胶，使其与蒸馏水的比例为1:3(v/v)，室温溶胀时间5h，沸水溶胀2h，将凝胶在6℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约8cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为250nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为60mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为6mL，控制流速1mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥。将组分Ⅰ溶于去离子水中进行HPLC-MS/MS分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为10μL，流速为0.5mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列。将肽序列合成并进行纯化，流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中。洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为20μL。
测定合成肽的DPPH自由基清除率并采用纳米粒度仪测定其电位。将溴化钾在150℃环境下干燥11h，以备压片，300mg溴化钾压片作为空白样，1.5mg冻干粉和300mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样，用傅里叶红外光谱仪进行分析。用圆二色谱仪分析肽序列二级结构含量，将起始波长设定为190nm～290nm，步长1nm，待测样品溶于去离子水中，样品浓度为1mg/mL，上样量为500μL。最终得到纯度为97％以上，在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％的抗氧化肽序列。
实施例5：
称取SephadexG-25凝胶，使其与蒸馏水的比例为1:4(v/v)，室温溶胀时间2h，沸水溶胀2h，将凝胶在4℃条件下注入层析柱中，待凝胶沉积至离层析柱顶约6cm时，停止注入凝胶，采用蒸馏水平衡层析柱，使其基线走平，紫外检测器的波长范围为260nm，将肽粉溶于蒸馏水中，使其浓度为45mg/mL，将样品经0.45μm滤膜过滤，上样体积为5mL，控制流速2.5mL/min，最终收集到组分Ⅰ，将组分Ⅰ真空冷冻干燥。将组分Ⅰ溶于去离子水中进行HPLC-MS/MS分析，其洗脱程序为10％～90％乙腈在10min～15min时结束程序，上样体积为10μL，流速为0.8mL/min，在1.5min～2min时可鉴定出肽序列。将肽序列合成并进行纯化，流动相A为0.1％的三氟乙酸溶于100％乙腈，流动相B为0.1％的三氟乙酸溶于去离子水中。洗脱程序为7％A～32％A以及93％B～68％B，在20min～25min时结束，流速0.5mL/min～1mL/min，将合成肽溶于去离子水中，上样体积为20μL。
测定合成肽的DPPH自由基清除率并采用纳米粒度仪测定其电位。将溴化钾在130℃环境下干燥12h，以备压片，200mg溴化钾压片作为空白样，1mg冻干粉和200mg溴化钾研磨混匀，压片后作为处理样，用傅里叶红外光谱仪进行分析。用圆二色谱仪分析肽序列二级结构含量，将起始波长设定为190nm～290nm，步长0.5nm，待测样品溶于去离子水中，样品浓度为1mg/mL，上样量为350μL。最终得到纯度为97％以上，在浓度1mg/mL～3mg/mL具有DPPH自由基清除率为16％～50％，其电位经过纳米粒度仪测定得出为18mV～30mV，含有的官能团有-OH，＝C-H，C＝O，C＝C，C-N，C-S；α-螺旋含量为1％～3％，β-折叠含量为45％～46％，β-转角含量为20％～24％，无序结构含量为24％～27％的抗氧化肽序列。