一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法与流程

文档序号:19231787发布日期:2019-11-27 17:48阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组人源胶原蛋白,其特征在于,所述蛋白为序列表中的seqidno:1。

2.如权利要求1所述的重组人胶原蛋白,其特征在于,所述蛋白的等电点为9.5。

3.如权利要求1或2所述的重组人胶原蛋白,其特征在于,用于表达所述蛋白的宿主细胞为毕赤酵母pichia.pastoris。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述的重组人胶原蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)制备质粒:人工全基因合成序列表中的seqidno:3的序列,然后对ppic9k载体及人工全基因合成的seqidno:3的人源胶原蛋白进行xhoⅰ和ecorⅰ双酶切,回收酶切产物,用dna连接酶连接,并转化大肠杆菌,提取质粒;

(2)转化:将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化,获得转化后菌落;

(3)多拷贝插入重组子的筛选:将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养,筛选转化子;

(4)发酵:将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液;

(5)纯化:将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

5.如权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述步骤(5)的纯化的具体步骤为:将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离,取上清液,对发酵上清液用孔径为0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤,收集滤液,再用截留分子量为10kd的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩,收集浓缩液,然后用cmsepharoseff进行离子交换层析,即可得到产品。

6.如权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)制备质粒

人工全基因合成序列表中的seqidno:3的序列,然后对ppic9k载体及人工全基因合成的seqidno:3的序列人源胶原蛋白进行xhoⅰ和ecorⅰ双酶切,回收酶切产物,用dna连接酶连接,并转化大肠杆菌,提取质粒,命名为ppic9k-ncol;

(2)毕赤酵母电转化

将经salⅰ内切酶线性化的ppic9k-ncol质粒,与毕赤酵母感受态细胞混匀,转至冰预冷的电转化杯中,电击4~10毫秒,加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,涂布md培养基平板,倒置培养2~3天,在md培养基平板上长出菌落;

(3)多拷贝插入重组子的筛选

将md培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到g418浓度分别为0.5g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l的ypd平板上培养,筛选获得转化子;

(4)基因重组人源胶原蛋白的发酵

将筛选到的转化子接种于bmgy培养基中,振荡培养24小时,作为一级种子转接于装有fbs培养基的发酵罐中,ph值为5.0培养16~20小时,作为二级种子转接入装有fbs培养基的大罐发酵,生长温度30℃,诱导温度低于生长温度,ph值为5.0,溶氧控制在20%~30%,诱导发酵36~42小时;

(5)基因重组人源胶原蛋白的纯化

将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离,取上清液,对发酵上清液用孔径为0.1μm或0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤,收集滤过液,再用截留分子量为10kd的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩,收集浓缩液,然后用cmsepharoseff进行离子交换层析,获得纯度为95%以上的基因重组人源胶原蛋白。

7.一种编码重组人源胶原蛋白的基因,其特征在于,所述基因为序列表中的seqidno:2。

8.含有权利要求7所述基因的表达载体。

9.含有权利要求7所述基因的细胞系。

10.一种用于组织工程、美容护肤的生物材料,其特征在于,所述生物材料包含权利要求1-3任一项所述人源胶原蛋白,或者,权利要求7所述基因编码的重组人源胶原蛋白。

11.如权利要求1-3任一项所述的重组人胶原蛋白,其特征在于,所述重组人胶原蛋白的纯度为95%以上。

12.如权利要求4-6任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法制备得到的重组人胶原蛋白的纯度为95%以上。

13.如权利要求7所述的编码重组人源胶原蛋白的基因,其特征在于,所述基因编码的重组人胶原蛋白的纯度为95%以上。

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