一种鉴定HLA‑DQB1第2外显子单倍型的方法与流程

本发明涉及一种鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的方法，是一种等位基因特异测序引物引导的测序鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的技术。属于基因多态性检测及以测序为基础的基因分型
技术领域：
。发明背景人类白细胞抗原II类(humanleukocyteantigenclassII,HLA-II)基因编码一种细胞表面的糖蛋白，在免疫反应中扮演一种很基础的角色：将抗原肽递呈给T辅助细胞(Thelpercell,THcell)，当TH细胞识别自身HLA-II类分子递呈的外来抗原，触发免疫级联反应，最终激活细胞毒T细胞和B细胞，分别杀死抗原递呈细胞和诱导抗体反应。主要行使抗原递呈功能的HLA-II类基因主要包括3个位点，分别是DR、DQ和DP，这三个分子均由A基因(编码α链)和B基因(编码β链)组成，形成异源二聚体发挥功能，A基因较保守，B基因则具有高度多态性，到目前为止已鉴定出1825个DRB1等位基因、876个DQB1等位基因和587个DPB1等位基因。由于个体间的HLA分子差异较大，在进行输血和器官移植前必须进行HLA配型，防止发生强烈的免疫排斥反应。输血及组织配型中需要匹配的HLA位点主要包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP等位点。HLA-DRB1及HLA-DQB1不匹配易引起强烈的免疫排斥反应，器官存活时间缩短。HLA分型主要应用于组织配型、输血配型、疾病相关等位基因检测及遗传进化分析等方面。二十世纪七八十年代的HLA配型方法主要采用微量淋巴细胞毒实验方法，当聚合酶链式反应技术发明以后，开始进入HLA的DNA分型时代，而且建立了DNA等位基因型与血清型的对应关系。从此建立以DNA测序为基础的HLA分型技术(sequencing-basedtyping,简称SBT)，以及以寡核苷酸探针杂交为基础的分型技术。由于HLA-II类基因的多态性主要集中在B基因的第2外显子，现有的分型技术都是基于基因的第2外显子。但现有的SBT技术对HLA-DQB1基因第2外显子的分型存在很多不明确杂合子(约占30％左右)，要进一步鉴定这些不明确杂合子还需要对HLA-DQB1第2外显子进行克隆测序，存在技术难度大和工艺复杂的问题。而寡核苷酸探针杂交为基础的分型技术只能针对已知的数十种等位基因型进行分型，不能满足所有(876个)HLA-DQB1等位基因型的鉴定，也不能发现新的等位基因型。因此，需要研究一种新的精确的HLA-DQB1分型方法。技术实现要素：本发明的目的，是为了解决现有以DNA测序为基础的HLA分型技术不能直接通存在较多不明确杂合子的问题，提供一种鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的方法，具有简便、快速、精确鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的特点。可以对HLA-DQB1基因进行等位基因分型。本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的方法，其特征在于：1)设计HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列的PCR扩增引物和测序引物，所述PRC扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，所述测序引物包括通用测序引物和等位基因特异测序引物；所述测序引物为基于PCR产物进行Sanger法测序的测序引物；2)采用等位基因特异测序引物测序，用一对PCR扩增引物扩增HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列片段，采用1个通用测序引物进行正向测序，再从5-9条不同等位基因特异测序引物中选择1条进行反向测序，利用两个测序反应鉴定出单倍型。本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：进一步地，1)所述PRC扩增引物的上游扩增引物的3’端碱基序列包括：-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’；所述PRC扩增引物的下游扩增引物的3’端碱基序列包括：-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’；2)所述通用测序引物的3’端碱基序列包括：-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，所述等位基因特异测序引物包括针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物和针对参考序列360位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物。进一步地，所述测序引物为基于PCR产物进行Sanger法测序的测序引物。进一步地，所述针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的3’端碱基序列为-GCAGAGGGGCGACGC-3’，5’端碱基序列为-GCAGAGGGGCGACGC-3’所述针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’，5’端碱基序列为-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’；所述针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’，5’端碱基序列为-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’；所述针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’，5’端碱基序列为-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’所述针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CTCACGGAGGGTCAACC-3’，5’端碱基序列为-CTCACGGAGGGTCAACC-3’；所述针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CCCATCGCCCCTCCC-3’，5’端碱基序列为-CCCATCGCCCCTCCC-3’；所述针对参考序列360位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，5’端碱基序列为-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’。进一步地，所述上游扩增引物的序列为：3’端碱基序列包括-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’；5’端碱基序列包括-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’，所述下游扩增引物的序列为：3’端碱基序列包括-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’，5’端碱基序列为-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’。进一步地，所述通用测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，5’端碱基序列为-CGCAGAGGATTTCGTG-3’。进一步地，所述HLA-DQB1第2外显子涉及的HLA-DQB1基因的参考序列，如序列表SQEIDNo：14-31所示；其中：序列表SEQIDNo：14-15给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游635bp的碱基序列；序列表SEQIDNo：16-23给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游638bp的碱基序列，序列表SEQIDNo：24-31给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游641bp的碱基序列，上述参考序列的31-300位碱基序列为HLA-DQB1的第2外显子。进一步地，针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与308位G等位基因特异互补；针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为A，与320位T等位基因特异互补；针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与318位G等位基因特异互补；针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与361位G等位基因特异互补；针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为A，与346位T等位基因特异互补；针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与309位G等位基因特异互补；针对参考序列360位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为G，与360位C等位基因特异互补。进一步地，设计扩增ATP结合盒亚家族G1(ABCG1)近端启动子区的扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，设计ABCG1启动子区的等位基因特异测序引物，该引物的3’端碱基序列包括：-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’，3’末端碱基为A，与T等位基因特异互补。进一步地，所述的参考序列SEQIDNo：14-15的总长度为935bp，所述的参考序列SEQIDNo：16-23的总长度为938bp，所述的参考序列SEQIDNo：24-31的总长度为941bp；所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列扩增引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述扩增引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列上游扩增引物的碱基序列为：5’-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’，如序列表SEQIDNo：1，所述上游扩增引物的5’端第5位碱基至其3’末端的碱基序列对应于参考序列的24-39位；所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列下游扩增引物的碱基序列为：5’-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’，如序列表SEQIDNo：2；所述下游扩增引物的5’端第6位碱基至其3’末端的碱基序列对应于参考序列的948-929位；所述通用测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述通用测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，上述通用测序引物的碱基序列为：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，如序列表SEQIDNo：3，通用测序引物的碱基序列对应于参考序列26-39位；所述针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-GCAGAGGGGCGACGC-3’，如序列表SEQIDNo：4；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列322-308位；所述针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’，如序列表SEQIDNo：5；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列336-320位；所述针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列；所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’，如序列表SEQIDNo：6；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列334-318位；所述针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列、所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’，如序列表SEQIDNo：7；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列365-346位；所述针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CTCACGGAGGGTCAACC-3’，如序列表SEQIDNo：8；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列325-309位；所述针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CCCATCGCCCCTCCC-3’，如序列表SEQIDNo：9；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列375-361位。进一步地，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，如序列表SEQIDNo：10。所述ABCG1扩增引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述扩增引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述ABCG1上游扩增引物的碱基序列为：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’，如序列表SEQIDNo：11；所述ABCG1下游扩增引物的碱基序列为：5-CCCCAAACTACAAATGATGAT-3’，如序列表SEQIDNo：12。所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’，如序列表SEQIDNo：13。本发明具有如下突出的的优点和有益效果：1、本发明设计HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列的PCR扩增引物和测序引物，所述PRC扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，所述测序引物包括通用测序引物和等位基因特异测序引物；所述测序引物为基于PCR产物进行Sanger法测序的测序引物；采用等位基因特异测序引物测序，用一对PCR扩增引物扩增HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列片段，采用1个通用测序引物进行正向测序，再从5-9条不同等位基因特异测序引物中选择1条进行反向测序，利用两个测序反应鉴定出单倍型。因此，能够解决解决现有以DNA测序为基础的HLA分型技术不能直接通存在较多不明确杂合子的问题，具有简便、快速、精确鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的特点。可以对HLA-DQB1基因进行等位基因分型。2、本发明对于HLA-DQB1的组织配型、研究HLA-DQB1与疾病的相关性以及研究群体遗传学等方面有重要价值。附图说明图1为本发明中涉及到的引物在HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列中的相对位置示意图。图2为Sanger法测序产生的色谱图。图3为ABCG1近端启动子杂合峰示意图及等位基因特异测序引物位置示意图。图1中，序列是从HLA-DQB1基因数据库(ftp.edu.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/)中下载的DQB1全基因序列，利用ClustalX1.81比对后的截取图，带圆圈的数字为本发明中所涉及引物的编号，序列中的阴影部分为引物在序列中的位置。图2中，上部为正向通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测序所得序列的部分色谱图，图中箭头所示位点为设计等位基因特异引物的3’末端位点，以与C互补的碱基G为等位基因特异引物的3’末端，引物序列为DQB1*0S_SEQR：5’-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’。下部为利用等位基因特异测序引物DQB1*0S_SEQR测序所得序列的部分色谱图。具体实施方式具体实施例1：本实施例涉及的鉴定HLA-DQB1第2外显子单倍型的方法，其特征在于：1)设计HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列的PCR扩增引物和测序引物，所述PRC扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，所述测序引物包括通用测序引物和等位基因特异测序引物；所述测序引物为基于PCR产物进行Sanger法测序的测序引物；2)采用等位基因特异测序引物测序，用一对PCR扩增引物扩增HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列片段，采用1个通用测序引物进行正向测序，再从5-9条不同等位基因特异测序引物中选择1条进行反向测序，利用两个测序反应鉴定出单倍型。本实施例中：所述PRC扩增引物的上游扩增引物的3’端碱基序列包括：-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’；所述PRC扩增引物的下游扩增引物的3’端碱基序列包括：-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’；所述通用测序引物的3’端碱基序列包括：-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，所述等位基因特异测序引物包括针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物、针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物和针对参考序列360位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物。所述测序引物为基于PCR产物进行Sanger法测序的测序引物。所述针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的3’端碱基序列为-GCAGAGGGGCGACGC-3’，5’端碱基序列为-GCAGAGGGGCGACGC-3’；所述针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’，5’端碱基序列为-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’；所述针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’，5’端碱基序列为-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’；所述针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’，5’端碱基序列为-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’所述针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CTCACGGAGGGTCAACC-3’，5’端碱基序列为-CTCACGGAGGGTCAACC-3’；所述针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CCCATCGCCCCTCCC-3’，5’端碱基序列为-CCCATCGCCCCTCCC-3’；所述针对参考序列360位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，5’端碱基序列为-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’。所述上游扩增引物的序列为：3’端碱基序列包括-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’；5’端碱基序列包括-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’，所述下游扩增引物的序列为：3’端碱基序列包括-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’，5’端碱基序列为-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’。所述通用测序引物的序列为：3’端碱基序列为-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，5’端碱基序列为-CGCAGAGGATTTCGTG-3’。所述HLA-DQB1第2外显子涉及的HLA-DQB1基因的参考序列，如序列表SQEIDNo：14-31所示；其中：序列表SEQIDNo：14-15给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游635bp的碱基序列；序列表SEQIDNo：16-23给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游638bp的碱基序列，序列表SEQIDNo：24-31给出的参考序列包括HLA-DQB1第2外显子上游30bp至HLA-DQB1第2外显子下游641bp的碱基序列，上述参考序列的31-300位碱基序列为HLA-DQB1的第2外显子。针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与308位G等位基因特异互补；针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为A，与320位T等位基因特异互补；针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与318位G等位基因特异互补；针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与361位G等位基因特异互补；针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为A，与346位T等位基因特异互补；针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为C，与309位G等位基因特异互补；针对参考序列360位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物，3’末端碱基为G，与360位C等位基因特异互补。设计扩增ATP结合盒亚家族G1(ABCG1)近端启动子区的扩增引物，所述扩增引物包括上游扩增引物和下游扩增引物，设计ABCG1启动子区的等位基因特异测序引物，该引物的3’端碱基序列包括：-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’，3’末端碱基为A，与T等位基因特异互补。所述的参考序列SEQIDNo：14-15的总长度为935bp，所述的参考序列SEQIDNo：16-23的总长度为938bp，所述的参考序列SEQIDNo：24-31的总长度为941bp；所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列扩增引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述扩增引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列上游扩增引物的碱基序列为：5’-aggaCTCGCAGAGGATTTCG-3’，如序列表SEQIDNo：1，所述上游扩增引物的5’端第5位碱基至其3’末端的碱基序列对应于参考序列的24-39位；所述HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列下游扩增引物的碱基序列为：5’-gttacCATACCAGTCAATGTGTCAG-3’，如序列表SEQIDNo：2；所述下游扩增引物的5’端第6位碱基至其3’末端的碱基序列对应于参考序列的948-929位；所述通用测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述通用测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，上述通用测序引物的碱基序列为：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’，如序列表SEQIDNo：3，通用测序引物的碱基序列对应于参考序列26-39位；所述针对参考序列308位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-GCAGAGGGGCGACGC-3’，如序列表SEQIDNo：4；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列322-308位；所述针对参考序列320位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’，如序列表SEQIDNo：5；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列336-320位；所述针对参考序列318位为G/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列；所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’，如序列表SEQIDNo：6；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列334-318位；所述针对参考序列346位为C/T杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列、所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’，如序列表SEQIDNo：7；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列365-346位；所述针对参考序列309位为G/C杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CTCACGGAGGGTCAACC-3’，如序列表SEQIDNo：8；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列325-309位；所述针对参考序列361位为G/A杂合子的等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CCCATCGCCCCTCCC-3’，如序列表SEQIDNo：9；所述等位基因特异测序引物5’至3’端的碱基序列对应于参考序列375-361位。所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，如序列表SEQIDNo：10。所述ABCG1扩增引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述扩增引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述ABCG1上游扩增引物的碱基序列为：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’，如序列表SEQIDNo：11；所述ABCG1下游扩增引物的碱基序列为：5-CCCCAAACTACAAATGATGAT-3’，如序列表SEQIDNo：12。所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-40bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的5’端包括长度为0-30bp、0-20bp、0-10bp或0-5bp的碱基序列，所述等位基因特异测序引物的碱基序列为：5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’，如序列表SEQIDNo：13。关于PCR扩增：PCR扩增体系为：5μl10×LAbuffer(Takara)，2.5μlDMSO，3.0μldNTP(2.5mM)，2.0μl等位基因特异测序引物，0.8μlLATaq聚合酶(5U/μl)，加入3μl上述步骤1)提取的基因组DNA，补充无菌超纯水至50μl。PCR循环参数：92℃，预变性5min；然后按95℃(变性)10s，62℃(复性)30s，68℃(延伸)1min，进行35个循环；68℃，3min延伸完全；12℃保存。关于PCR产物检测：取4.5μlPCR产物与0.5μl10×上样缓冲液混合，加入到1.5％的琼脂糖凝胶的上样孔中，同时以DNAMarker(DL2000)作为对照，120V，120mA，电泳20分钟，于凝胶成像仪中观察结果，与DL2000的条带相比，位于1kb条带稍前位置的特异条带为目的条带。PCR产物目的条带的纯化：将45μlPCR产物与5μl10×上样缓冲液混合，加入到1.0％的琼脂糖凝胶的上样孔中，同时以DNAMarker(DL2000)作为对照，90V，90mA，电泳40-60分钟，于紫外灯箱中切下目的条带，置于1.5mlEP管中，用DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrepTMDNAGelExtractionkit，货号AP-GX-250)进行纯化，操作步骤按试剂盒说明书进行。上述纯化后的PCR产物以通用测序引物进行Sanger法测序，上述通用测序引物序列为：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’；测序结果与参考序列(SEQIDNo.14-31)进行比对；根据第2外显子3’端旁侧序列特定位点杂合子的情况选择等位基因特异测序引物进行Sanger法测序；以上两次测序结果进行比对，从而确定杂合子个体的两条单倍型；将两条第2外显子单倍型序列与HLA-DQB1等位基因型数据库进行比对，从而得到相应的等位基因型。上述等位基因特异测序引物的选择依据图1所示参考序列308、309、318、320、346和361位的杂合状态。308位为G/T杂合状态，不管其它位点是否为杂合状态，利用等位基因特异测序引物DQB1*02S_SEQR：5’-GCAGAGGGGCGACGC-3’进行Sanger法测序；308位为纯合状态，309位为C/G杂合状态，无论其它位点是否为杂合状态，利用等位基因特异测序引物DQB1*0601S_SEQR:5’-CTCACGGAGGGTCAACC-3’进行Sanger法测序。308和309位均为纯合状态，318位为T/G杂合状态，无论其它位点是否为杂合状态，则利用等位基因特异测序引物DQB1*03S_SEQR:5’-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’进行Sanger法测序。308、309和318位均为纯合状态，而346位为C/T杂合状态，无论其它位点是否为杂合状态，则利用等位基因特异测序引物DQB1*05S_SEQR:5’-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’进行Sanger法测序。进一步的，308、309、318和346位均为纯合状态，而320位为C/T，361位为A/G，则利用等位基因特异测序引物DQB1*56S_SEQR:5’-CCCATCGCCCCTCCC-3’或DQB1*234S_SEQR:5’-CAAGAATGGGCCTCGCA-3’进行Sanger法测序。进一步的，若308、309、318、320、346和361位点全为纯合状态，则根据HLA-DQB1第2外显子及其3’旁侧序列的正向测序结果，以其3’旁侧序列中杂合位点碱基的互补碱基为等位基因特异测序引物的3’末端设计反向测序引物。进一步的，如图2的2A所示，通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测序所得序列在308、309、318、320、346和361位均为纯合位点，但在360位存在C/T杂合位点，则以该位点C的互补碱基G为等位基因特异测序引物的3’末端设计反向测序引物，引物序列为DQB1*0S_SEQR：5’-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，利用该引物进行反向测序所得序列的部分色谱图如图2的2B所示。利用等位基因特异测序引物进行Sanger法测序所得序列均为单倍型序列，即所有位点均为纯合位点。进一步的，所述测序结果比对，举例说明如下：如果通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测得某个体DQB1第2外显子序列中有5个杂合位点，序列为(”-”表示纯合位点)---A/C----G/T----C/T---A/G----G/C-----，而用等位基因特异测序引物测得该个体DQB1第2外显子序列为---A----T----C---G----G-----，这是该个体DQB1第2外显子的一条单倍型序列，其另外一条单倍型序列则可根据以上杂合位点序列和单倍型序列共同确定，因为该个体为杂合子，已测得其5个杂合位点在其中一条单倍型上的组合为A、T、C、G、G，则这5个杂合位点在另外一条单倍型上的组合必然为C、G、T、A、C，因此另一条单倍型序列必然为---C----G----T---A----C-----。将以上两条单倍型序列分别与HLA-DQB1等位基因数据库进行比对，即可确定该杂合子个体的两个HLA-DQB1等位基因型。对于绝大部分(>99％)HLA-DQB1等位基因杂合子组合，都能以其第2外显子3’旁侧序列中杂合位点碱基的互补碱基为等位基因特异测序引物的3’末端设计反向测序引物，从而进行等位基因特异引物测序获得单倍型序列。对于极少部分样本(<1％)用正向引物测序所得序列在以上所述位点和第二外显子旁侧序列中的所有位点均为纯合状态，以其第二外显子中靠近3’端的最后一个杂合位点碱基的互补碱基为反向等位基因特异测序引物的3’末端设计反向测序引物，再以第二外显子中靠近5’端的第一个杂合位点碱基的互补碱基为等位基因特异测序引物的3’末端设计正向测序引物，利用以上等位基因特异测序引物进行双向测序，对得到的两条单倍型序列进行比对分析确定HLA-DQB1第二外显子的两条单倍型序列。为了说明等位基因特异测序引物测序法鉴定SNP(单核苷酸多态)单倍型的通用性，本发明还提供了一种ABCG1基因近端启动子中SNP单倍型的鉴定方法，具体步聚如下：DNA样品的收集及提取；PCR扩增引物：ABCG1近端启动子上游扩增引物：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’；ABCG1近端启动子下游扩增引物：5-CCCCAAACTACAAATGATGAT-3’；进一步的，上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物加入无菌超纯水配制成100μM浓度作为保存液；工作液浓度为10μM。PCR扩增：PCR扩增体系为：25μlPrimerStar酶混合物(Takara)，1.0μl上述步聚2)所述的引物，加入1.6μl上述提取的基因组DNA，补充无菌超纯水至50μl。PCR循环参数：92℃，预变性3min；然后按95℃(变性)10s，60℃(复性)30s，68℃(延伸)1min，进行35个循环；68℃,3min延伸完全；12℃保存。PCR产物检测：取4.5μl上述所得PCR产物与0.5μl10×上样缓冲液混合，加入到1.5％的琼脂糖凝胶的上样孔中，同时以DNAMarker(DL2000)作为对照，120V，120mA，电泳20分钟，于凝胶成像仪中观察结果，与DL2000的条带相比，位于500bp条带稍前位置的特异条带为目的条带。上述中条带比DL2000的500bp条带亮的PCR产物进行Sanger法测序。进一步的，上述中的测序引物为ABCG1近端启动子的上游扩增引物，引物序列为：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’。进一步的，上述扩增的ABCG1近端启动子所包含的碱基序列中从5’至3’端有3个SNP位点，依次为①A/G，②A/C，③G/T。上述测序结果中，若③为G/T杂合子，①和②为纯合子，无需利用等位基因特异测序引物进行测序。进一步的，若③为G/T杂合子，①和②任意一个位点为杂合子，则利用等位基因特异测序引物ABCG1SEQ2R：5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’进行Sanger法测序，如图3。以上两次测序结果进行比对，从而确定杂合子个体的两条单倍型；本发明中，术语“等位基因”一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。本说明书中是指位于一对同源染色体相同位置上的一段同源DNA片段或位于染色体相同位置上的同源DNA片段中相同位置的单个碱基。本发明中，术语“等位基因特异引物”在本发明说明书中是指以DNA序列中单核苷酸多态(SNP)位点的其中一种碱基的互补碱基作为引物的3’末端，如序列5’--A/C(1)--G/T(2)--A/G(3)CCCTAGGAATTTCG-3’，以第(3)个SNP位点(A/G)的互补碱基为等位基因特异引物的3’末端，可设计等位基因特异引物为3’-tGGGATCCTTAAAGC-5’或3’-cGGGATCCTTAAAGC-5’。利用引物3’-tGGGATCCTTAAAGC-5’进行Sanger法测序可得到第(3)个SNP位点为A的单倍型序列，而利用引物3’-cGGGATCCTTAAAGC-5’进行Sanger法测序可得到第(3)个SNP位点为G的单倍型序列。如果利用引物3’-tGGGATCCTTAAAGC-5’进行Sanger法测序列，得到的单倍型在第(1)和第(2)个SNP位点的碱基分别为C和G，则该DNA片段的一条单倍型序列为5’--C(1)---G(2)--A(3)--3’，另外一条单倍型序列必然为5’--A(1)--T(2)--G(3)--3’。本发明中，术语“单倍型或单体型”是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合；本说明书中的单倍型是指位于同一染色体上的两个以上碱基组成的DNA片段，组成单倍型的单位是单个核苷酸碱基。如：一个个体的一段DNA序列为5’--G/T--A/C--3’，该DNA片段的单倍型可能为5’--G--A--3’和5’--T--C--3’，或者为5’--G--C--3’和5’--T--A--3’，两条单倍型之间只存在两个单核苷酸碱基的差异，“-”表示所有单倍型在该位点的碱基相同。应用实例1：本应用实例2对实验室收集的474份全血样本进行研究，提取DNA，进行PCR扩增后，以正向通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’进行测序，成功测序了474个样本，得到474条序列，与图1所示的参考序列比对，其中有25条序列在所有多态位点均为纯合状态，有57条序列在308位为G/T杂合状态；61条序列在309位为C/G杂合状态，而308位为纯合状态；153条序列在318位为T/G杂合状态，而在308和309位为纯合状态；109条序列在346位为C/T杂合状态，而在308、309和318位为纯合状态；48条序列在320位为C/T杂合状态，361位为A/G杂合状态，而308、309、318和346位为纯合状态。根据表2所示选择等位基因特异测序引物，308位为G/T杂合状态的57条序列所对应样本的PCR产物再用DQB1*02S_SEQR：5’-GCAGAGGGGCGACGC-3’进行Sanger法测序；309位为C/G杂合状态，而308位为纯合状态的61条序列所对应样本的PCR产物再用DQB1*0601S_SEQR：5’-CTCACGGAGGGTCAACC-3’进行Sanger法测序；318位为T/G杂合状态，而308和309位为纯合状态的153条序列所对应样本的PCR产物再用DQB1*03S_SEQR：5’-AGAGTGGGCCTCGCAGC-3’进行Sanger法测序；346位为C/T杂合状态，而308、309和318位为纯合状态的109条序列所对应样本的PCR产物再用DQB1*05S_SEQR:5’-CTCCCAGCACAGAGACTAGA-3’进行Sanger法测序；320位为C/T杂合状态，361位为A/G杂合状态，而308、309、318和346位为纯合状态的48条序列所对应样本的PCR产物再用DQB1*56S_SEQR:5’-CCCATCGCCCCTCCC-3’进行Sanger法测序。全部样本都用反向等位基因特异测序引物测序成功，为每个HLA-DQB1杂合子样本得到了一条单倍型序列，与正向通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测序所得序列进行比对，得到每个样本的两条HLA-DQB1第二外显子单倍型序列，再将单倍型序列与HLA-DQB1等位基因型数据库进行比对，为每个样本得到两个HLA-DQB1等位基因型。此应用实例说明97％的样本可通过以上6个位点的等位基因特异测序得到HLA-DQB1第二外显子的单倍型序列。应用实例2：本应用实例对实验室收集的474份全血样本进行研究，提取DNA，进行PCR扩增后，以正向通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’进行测序，成功测序了474个样本，得到474条序列，与图1所示的参考序列比对，其中有12个样本所对应的12条序列在308、309、318、320、346和361位均为纯合状态，则根据旁侧序列中其它位点的杂合状态重新设计等位基因特异测序引物，其正向测序引物测序结果峰图如图2所示，引物3’末端对应的杂合峰如图2中上部所示，特异测序引物序列为DQB1*0S_SEQR:5’-CCCTTCGTCCCTCCTG-3’，利用等位基因特异测序引物进行Sanger法测序得到12条无杂合峰的测序结果，测序结果的部分峰图如图2中下部所示，并与正向通用测序引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测序所得结果进行比对，为每个样本确定两条单倍型序列，与HLA-DQB1等位基因数据库比对，得到以上12个样本的两个HLA-DQB1等位基因型。应用实例2说明了对于少部分样本利用正向通用引物DQB1SEQ1：5’-CGCAGAGGATTTCGTG-3’测序所得序列在以上给定位点都是纯合状态的情况下，可根据其它位点杂合位点选择等位基因特异测序引物进行Sanger法测序，同样可成功鉴定出HLA-DQB1第二外显子的两个单倍型序列。应用实例1和应用实例2对474个样本的HLA-DQB1第二外显子的分型结果汇总见表3。应用实例3：本就用实例对ATP结合盒亚家族G1(ATP-bindingcassettesubfamilyGmember1,ABCG1)的近端启动子区有3个单核苷酸多态位点(SNP)，依次为①A/G、②A/C和③T/G，在中国汉族人群中约有50％的个体在这三个位点是杂合子状态，为了研究这三个位点组成的不同单倍型与冠心病的易感性是否存在相关性，我们对100个冠心病患者样本和100个正常对照组样本进行研究，采集受试者全血2ml，EDTA抗凝，提取基因组DNA备用。针对ABCG1基因启动子区保守序列设计PCR扩增引物，使扩增片段包含上述3个SNP位点，PCR扩增引物序列为ABCG1APF5：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’，ABCG1APR5：5’-CCCCAAACTACAAATGATGAT-3’。同时，针对扩增片段中第3个SNP位点(T/G)设计等位基因特异测序引物，即测序引物的3’末端与SNP位点的T互补，等位基因特异测序引物序列为ABCG1SEQ2R：5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’。利用PCR反应扩增以上片段，PCR扩增体系为：25μlPrimerStar酶混合物(Takara)，1.0μl上述所述的引物，加入1.6μl上述提取的基因组DNA，补充无菌超纯水至50μl。PCR循环参数：92℃，预变性3min；然后按95℃(变性)10s，60℃(复性)30s，68℃(延伸)1min，进行35个循环；68℃,3min延伸完全；12℃保存。以上PCR产物采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，利用ABCG1APF5：5’-TCCATTCGTCCTTGTTACC-3’作为正向测序引物进行Sanger法测序，在200个样本测序完成后所得200条序列中，有41条序列在以上三个SNP位点均为杂合状态，有63条序列仅在第二个和第三个SNP位点为杂合状态，对以上104个存在两个以上位点呈杂合状态的样本的PCR产物，利用等位基因特异引物ABCG1SEQ2R：5’-GCAGTTCTGTTCCCTCA-3’进行反向测序，得到104条单倍型序列，将每个样本的单倍型序列与其正向测序结果进行比对，得到每个样本的另外一条单倍型序列。此实施例说明：对于存在两个以上杂合位点的任何基因位点，若需确定杂合位点的单倍型组合，都可先利用一条通用测序引物进行Sanger法测序，以所得序列靠近3’端的杂合位点某一碱基的互补碱基为等位基因测序引物的3’末端特异碱基，设计一条反向测序引物进行Sanger法测序，按说明书中
发明内容(V)中所述方法进行比对，则无需克隆测序即可获得该基因位点的两条单倍型。表1：本方法所涉及到的引物信息表2：测序引物选取需依从的多态位点碱基信息308309318320346361反向测序引物AG/T*****4B-C/G****8C--T/G***6D---C/T-A/G5或9，优选9E---*C/T*7F------10注：“-”表示此位点为纯合子；“*”表示此位点既可是杂合子，也可是纯合子。表3：HLA-DQB1第2外显子等位基因型分型结果本发明采用等位基因特异引物测序只需用一对PCR引物扩增HLA-DQB1第2外显子及其旁侧序列片段，采用附表1所示的1个通用测序引物进行正向测序，再从7条不同等位基因特异测序引物中选择1条进行反向测序，总共只需两个测序反应即可为99％的个体鉴定出单倍型，既减少了现有SBT技术中PCR反应的数目，也减少了测序反应的数目。对于少数不能依赖于以上7条特异测序引物进行分型的杂合子，可以按本方法的原理，根据目的片段3’端区域的杂合状态设计等位基因特异测序引物进行Sanger法测序分析(图2)。本发明提供的单倍型鉴定方法具有通用性，还可用于其它基因片段中单核苷酸多态组成的单倍型的鉴定，如ABCG1基因近端启动子中3个SNPs组成的单倍型的鉴定(图3)。当前第1页1 2 3