一种乳房炎的快速检测方法与流程

本发明涉及奶牛分子生物学技术领域，具体是一种乳房炎的快速检测方法。

背景技术：

几十年来，国内外针对奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但该病仍是导致奶牛场损失最为严重的疾病之一。目前，国内尚缺乏有效的疫苗用来预防奶牛乳房炎。防治该病的关键因素在于鉴定其致病菌，一旦确定致病菌，则可立即采取相应的措施。

经研究发现金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌是目前导致奶牛乳房炎最重要的四种致病菌。将多重PCR快速诊断方法同时应用于无细胞壁的支原体与其他致病菌，至今还没有过类似的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种乳房炎的快速检测方法，选取金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌4种奶牛乳房炎主要致病菌的四对特异性引物，通过优化反应条件，建立可同时检测奶牛乳房炎四种主要致病菌的多重PCR方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种乳房炎的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)待检测基因组DNA的提取；

(2)设置多重PCR反应体系：由TaqDNA聚合酶1U/25μL、金黄色葡萄球菌DNA模板150ng/25μL、无乳链球菌DNA模板150ng/25μL、大肠杆菌DNA模板150ng/25μL、牛支原体DNA模板150ng/25μL、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)200μmol/L、Mg²⁺1.5mmol/L、1×PCR缓冲液组成；

(3)多重PCR扩增反应：将设计好的引物组加入到多重PCR反应体系中进行多重PCR扩增反应，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃延伸10min，得到多重PCR扩增产物；

(4)结果检测：将上述多重PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据待检测样品所出现的电泳条带，判断待检测样品是否为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、牛支原体的单一或混合感染。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中，引物组为：

A、菌种：金黄色葡萄球菌；上/下游引物：GGACGACATTAGACGAATCA CGGGCACCTATTTTCTATCT，如SEQ ID NO：1所示；扩增片段：1319bp；

B、菌种：无乳链球菌；上/下游引物：CGACCTTTTGGACAAGTAGTAAGATACC GGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTAC，如SEQ ID NO：2所示；扩增片段：199bp；

C、菌种：大肠杆菌；上/下游引物：GCTTGACACTGAACATTGAG GCACTTATCTCTTCCGCATT，如SEQ ID NO：3所示；扩增片段：663bp；

D、菌种：牛支原体；上/下游引物：CCAGCTCACCCTTATACATGAGCGC TGACTCACCAATTAGACCGACTATTTCAC，如SEQ ID NO：4所示；扩增片段：442bp。

作为本发明进一步的方案：所述引物组中各引物的用量为0.1～0.4μmol/L。

作为本发明进一步的方案：所述引物组的用量为0.4μmol/L，各引物的摩尔数均为0.1μmol/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明建立的经济、快速、敏感、特异的多重PCR检测方法，可以同时检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和牛支原体四种奶牛乳房炎常见致病菌，从而快速、有效地防控奶牛乳房炎。

本发明选取金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌4种奶牛乳房炎主要致病菌的四对特异性引物，通过优化反应条件，建立可同时检测奶牛乳房炎4种主要致病菌的多重PCR方法；建立的多重PCR方法，检测临床采集的乳样，并与病原菌检测的“金标准”-培养法的结果进行比较。结果表明，Chelex-100法可经济、快速、有效地直接提取乳样细菌DNA，用于PCR检测奶牛乳房炎主要致病菌；建立的多重PCR方法可同时扩增引起奶牛乳房炎4种主要致病菌，具有良好的特异性和敏感性(检测无乳链球菌、牛支原 体、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小浓度分别为1.25×10³、6.25×10²、6.25×10²、1.25×10³CFU/ml)。多重PCR法与培养法检测临床采集乳样的结果表明，两种方法检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌3种细菌的结果基本一致，差异不显著(P＞0.05)；多重PCR法检测到的牛支原体乳样数多于培养法，差异极显著(P＜0.01)。

附图说明

图1是各个菌种的单一PCR检测结果图(M：2000bp DNA ladder；1：无乳链球菌；2：牛支原体；3：大肠杆菌；4：金黄色葡萄球菌)；

图2是多重PCR凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下针对本发明所涉及的技术术语进行解释说明：

PCR——即聚合酶链式反应，指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

多重PCR——在同一PCR体系里加入2对以上引物，可同时扩增2种以上核酸片段，用于多种病原体的同时检测。

引物——即一对合适的核苷酸片段，使其有效地扩增模板DNA序列。

退火温度——为引物和模板结合时候的温度参数，是影响PCR特异性的主要因素。

dNTP——脱氧核糖核苷三磷酸，在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR中起到原料作用。

1、引物设计

引物长度为18～24bp或更长，但不能超过38bp；G、C含量占总脱氧核苷酸量的30％～ 60％，可使PCR反应的退火温度在55℃～58℃。设计好的引物需要检测各对引物自身、引物之间的相互作用，如有无发卡结构或稳定的引物二聚体等。引物与非目的DNA序列之间不应有错误聚合位点。

2、多重PCR的体系浓度

由于DNA聚合酶和dNTP等有限，扩增效率高的目的片段会抑制效率低的片段。采用相同摩尔数各引物对浓度(0.2～0.4μmol/L)，根据扩增结果改变各引物对的浓度(0.04～0.6μmol/L)，增加扩增产物少的引物对的量，降低扩增产物多的引物对的量。

dNTP不稳定，忌反复冻融，若冻融3～5次，多重PCR就不能有效扩增。因此，可对dNTP进行分装，冻存于-20℃。dNTP浓度保持200μmol/L不变，增加Mg²⁺浓度可增加多重PCR的特异性，但过高的Mg²⁺浓度可抑制多重PCR反应。

提高缓冲液浓度，可提升多重PCR的扩增效率。但是，长目的片段在较低浓度缓冲液下扩增较好，短目的片段在较高浓度缓冲液下扩增较好。

3、多重PCR的循环参数

退火温度是PCR最重要的参数之一。根据单一PCR的最适退火温度，多重PCR时，可将退火温度下调1～4℃，有利于多重PCR各目的片段的扩增，但这会增加非特异性产物的量。

退火时间对PCR扩增的影响较小，一般选择20～90s均可。延伸温度即TaqDNA聚合酶工作的最适温度，过高的延伸温度会减少产物的量，增加延伸时间，长片段产物的产量增加，而短片段没有变化；PCR循环在25次左右时，目的产物仍在成倍增加，表现为琼脂糖凝胶电泳产物的明显变化，28～32个循环时，已足够通过琼脂糖凝胶电泳检出扩增产物。

4、多重PCR的优化

预设计一套共用的PCR循环参数，单一PCR采用该循环参数可扩增各条目的片段。如采用引物0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1U/25μL、150ng/25μL DNA、200μmol/L dNTP、Mg²⁺1.5mmol/L、1×PCR缓冲液，94℃预变性5min、循环(94℃变性45s、退火40s、72℃ 延伸40s)次数32次左右及最后的延伸时间约10min。调整退火温度，各物质浓度，找到各单一PCR最优条件。

使用等摩尔数的各引物，如0.1～0.4μmol/L，采用上述单一PCR的最优条件，进行多重PCR试验。根据多重PCR结果，调整各单一引物浓度及其他参数。

PCR方法可弥补细菌学培养的不足，尤其是多重PCR方法具有高效、节约实验成本的优点。因此建立多重PCR方法，快速检测引起奶牛乳房炎的主要病原菌——金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和牛支原体。

本发明实施例中，一种乳房炎的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)待检测基因组DNA的提取；

(2)设置多重PCR反应体系：由TaqDNA聚合酶1U/25μL、金黄色葡萄球菌DNA模板150ng/25μL、无乳链球菌DNA模板150ng/25μL、大肠杆菌DNA模板150ng/25μL、牛支原体DNA模板150ng/25μL、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)200μmol/L、Mg²⁺1.5mmol/L、1×PCR缓冲液组成；

(3)多重PCR扩增反应：将设计好的引物组加入到多重PCR反应体系中进行多重PCR扩增反应，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃延伸10min，得到多重PCR扩增产物；

(4)结果检测：将上述多重PCR扩增产物进行凝胶电泳，根据待检测样品所出现的电泳条带，判断待检测样品是否为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、牛支原体的单一或混合感染。

上述步骤(3)中，根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌和牛支原体分别设计了以下4对特异性引物，如表1所示，分别如SEQ ID NO：1～4所示。

表1 4对特异性引物的序列号及目的片段大小

请参阅图1～2，本发明分别按照各菌种的单一PCR反应条件、多重PCR反应条件，其中多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃延伸10min，总反应时间约2h20min。

本发明可同时扩增引起奶牛乳房炎4种主要致病菌，具有良好的特异性和敏感性(检测无乳链球菌、牛支原体、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小浓度分别为1.25×10³、6.25×10²、6.25×10²、1.25×10³CFU/ml)。

多重PCR法与培养法检测临床采集乳样的结果表明，两种方法检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌3种细菌的结果基本一致，差异不显著(P＞0.05)；多重PCR法检测到的牛支原体乳样数多于培养法，差异极显著(P＜0.01)。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将 说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。