本发明涉及生物工程技术领域。更具体地，涉及一种从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法。
背景技术：
胶原蛋白多肽具有高度的可消化性，除了少量在口腔、胃受到蛋白酶的作用而近一步分解外，口服进入人体快速地穿过人的口腔、胃，直接进入小肠，被小肠吸收，最终进入人体血液循环系统、器官及细胞组织，迅速发挥其生理作用和生物学功能。国际上对胶原蛋白的研究结论，胶原蛋白的数均分子量在2000～3000的时候，是最利于人体吸收的。
天然生物钙的来源如海洋牡蛎壳等，由于海洋污染问题，所以有报道这类钙剂存在铅镉等元素污染。牡蛎壳中往往含有各种重金属元素，长期服用会使这些重金属沉积于体内造成慢性中毒。
软骨素已被证实可经由口服而达到补充关节软组织结构的效果，临床上服用软骨素可有效的缓解关节炎的疼痛及发炎现象，同时具有延缓关节老化的作用。通过高科技深加工，可以治疗神经性头疼、三叉神经痛、冠心病、心绞痛、心肌缺氧、心脑血管疾病、关节痛、动脉粥样硬化及肝炎等症。可以作为保健品、食品中的添加剂，具有增强人体体质及抗病菌、美容、抗衰老等作用。现出口到欧美多个国家，市场需求旺盛。
现在生产企业大多以盐解法、碱解法和酶解法制备软骨素，使用较多的方法是采用碱与酶解相结合的方法来提取软骨素，采用这种碱法酶解生产工艺存在步骤繁琐、周期较长，在高温蒸煮、碱提取、反复酶解和脱色过程中，软骨素受到破坏，产品收率偏低，生产成本高。
因此，需要提供一种提取收率高，且方法简单、条件温和的胶原蛋白多肽、生物钙、软骨素的联产方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法。该方法工艺条件温和、能耗低、得到的产品纯度高、质量稳定可靠，实现了牛软骨资源的高效综合利用，实现了牛软骨的精深加工以及从牛软骨中联产提取胶原蛋白多肽与软骨素，提高了牛屠宰副产物的附加值，并且生产过程中无新污染产生，全方面减少了对环境的污染，绿色环保。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法，包括如下步骤：
1)选取新鲜牛软骨，洗净，于110℃～120℃蒸煮50～60min后，在2.5～3.0MPa压力下分离，得牛软骨蛋白和牛软骨；
2)将步骤1)得到的牛软骨洗净，粉碎至粒径0.1～0.5mm，得牛软骨粉末，并加入其1～1.5倍质量的纯净水，搅拌均匀，再接种植物乳酸菌，调节pH至5.0～6.0，在35～50℃温度下恒温发酵18～48h，得发酵液；
3)将步骤2)所得发酵液离心分离，分离条件为16000～18000r/min，得清液和沉淀物；
4)将步骤3)所得沉淀物洗净，并加入纯净水，搅拌均匀，再加入木瓜蛋白酶，在48～55℃酶解8～12h，得酶解液；再将酶解液加热至80～100℃保持40～60min，得灭活的酶解液；
5)将步骤4)所得灭活的酶解液经超滤浓缩、阴离子交换树脂柱进行柱层析，收集流出液；再经去离子水洗脱，得洗脱液；将流出液与洗脱液混合均匀，用压力喷雾干躁，得胶原蛋白多肽；
6)将步骤5)中经去离子水洗脱后的阴离子交换树脂柱用食盐溶液洗脱，将得到的洗脱液超滤脱盐，再加入无水乙醇，得混合液，静置4～6h，得沉淀；向沉淀中加入双氧水进行氧化脱色，再经减压干燥，得软骨素。
优选地，步骤2)中，所述植物乳酸菌的添加量为粉碎后的牛软骨的1.5～3wt％。
优选地，步骤4)中，所述木瓜蛋白酶的添加量为沉淀物的0.5～1wt％。
优选地，步骤6)中，所述混合液中无水乙醇的体积浓度为60～80％。
优选地，步骤6)中，所述沉淀与双氧水的质量比为1:4～1:5。
进一步地，本发明中所述的植物乳酸菌包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌等。本发明中的植物乳酸菌的耐酸和耐胆盐能力强，且其能在营养不均的恶劣环境下生存，从而存活率更高，定植能力更强。
本发明中采用的木瓜蛋白酶用于功能性肽的生产，可使蛋白质消解成活性肽和氨基酸，它可分解比胰酶更多、更广泛的蛋白底物。
本发明中使用的植物乳酸菌、木瓜蛋白酶均可通过市售购买获得，如植物乳酸菌包括但不限于购买自深圳市江源化工有限公司，木瓜蛋白酶包括但不限于购买自上海宝曼生物科技有限公司。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过采用植物乳酸菌发酵、生物酶解并结合超滤、进行柱层析和压力喷雾干燥等技术，连续分离获得胶原蛋白多肽、软骨素，得到的产物的纯度高，该联产工艺相比单产工艺设备利用率高，节约能源和辅料，显著降低生产成本。
2、本发明采用植物乳酸菌对牛软骨发酵，与直接采用酶解法相比，条件温和，能耗低，产品纯度高、质量稳定可靠；采用阴离子交换树脂柱进行柱层析，能去除无机离子，增加产品的纯净度。
3、本发明实现了从牛软骨中连续大量获得胶原蛋白多肽、软骨素的联产方法，技术可靠、产品质量稳定，实现了牛软骨资源的高效利用。
4、本发明将屠宰车间的鲜牛软骨立即置于加工化制间，杜绝了冷冻、运输中牛骨的霉变，最大限度的保持了牛软骨的营养成分；缩短了提取时间。实现了牛软骨资源的高效综合利用和精深加工，提高了牛屠宰副产物的附加值。在整个加工过程中，均在封闭环境中完成，各环节严格分开，避免了二次污染。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法，步骤如下：
1)蒸煮
选取新鲜屠宰厂鲜牛软骨为原料，洗净，选取新鲜牛软骨，洗净，在110℃温度下蒸煮55min后，用高压2.5MPa分离，得牛软骨蛋白和牛软骨；
2)粉碎发酵
将步骤1)得到的牛软骨洗净、粉碎至平均粒径为0.2mm，得牛软骨粉末；向牛软骨粉末中加入其等量的纯净水并搅拌均匀，再加入占牛软骨质量1.5％的植物乳酸菌，调节pH至5.0，在40℃温度下恒温发酵28h，得发酵液；
3)离心分离
将步骤2)所得发酵液用离心分离机分离，转速为16000r/min，得清液和沉淀物；
4)酶解
将步骤3)所得沉淀物洗净，并加入纯净水，搅拌均匀，再加入沉淀物质量0.5％的木瓜蛋白酶，在50℃下酶解10h，得酶解液；再将酶解液加热至90℃，酶灭活50min，得灭活的酶解液；
5)制备胶原蛋白多肽
将步骤4)所得灭活的酶解液经超滤浓缩、阴离子交换树脂柱进行柱层析，收集流出液；再经去离子水洗脱，得洗脱液；将流出液与洗脱液混合均匀，用压力喷雾干燥，得胶原蛋白多肽；
6)制备软骨素
将步骤5)中去离子水洗脱后的阴离子交换树脂柱用食盐溶液洗脱，取洗脱液进行超滤脱盐，再加入无水乙醇至所得溶液中无水乙醇的体积浓度为75％，将得到的溶液静置5h，得沉淀；向沉淀中加入其3倍质量的双氧水，进行氧化脱色、减压干燥，得软骨素。
利用本发明制备方法制取的胶原蛋白多肽的得率为95.3％，软骨素纯度达99％。
实施例2
从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法，步骤如下：
1)蒸煮
选取新鲜屠宰厂鲜牛软骨为原料，洗净，送入蒸煮槽中在120℃温度下蒸煮55min后，用高压2.8MPa分离，得牛软骨蛋白和牛软骨；
2)粉碎发酵
将步骤1)得到的牛软骨洗净、粉碎至平均粒径为0.2mm，得牛软骨粉末；向牛软骨粉末中加入纯净水并搅拌均匀，再加入占牛软骨质量2.5％的植物乳酸菌，调节pH至6.0，在45℃温度下恒温发酵48h，得发酵液；
3)离心分离
将步骤2)所得发酵液用离心分离机分离，转速为17000r/min，得清液和沉淀物；
4)酶解
将步骤3)所得沉淀物洗净，并加入纯净水，牛软骨粉末与纯净水的质量比为搅拌均匀，再加入沉淀物质量0.8％的木瓜蛋白酶，在55℃下酶解12h，得酶解液；再将酶解液加热至100℃，酶灭活60min，得灭活的酶解液；
5)制备胶原蛋白多肽
将步骤4)所得灭活的酶解液经超滤浓缩、阴离子交换树脂柱进行柱层析，收集流出液；再经去离子水洗脱，得洗脱液；将流出液与洗脱液混合均匀，用压力喷雾干燥，得胶原蛋白多肽；
6)制备软骨素
将步骤5)中去离子水洗脱后的阴离子交换树脂柱用食盐溶液洗脱，取洗脱液进行超滤脱盐，再加入无水乙醇至所得溶液中无水乙醇的体积浓度为80％，将得到的溶液静置6h，得沉淀；向沉淀中加入其3倍质量的双氧水进行进行氧化脱色、减压干燥，得软骨素。
利用本发明制备方法制取的胶原蛋白多肽的得率为95.8％，软骨素纯度达99.3％。
实施例3
从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法，步骤如下：
1)蒸煮
选取新鲜屠宰厂鲜牛软骨为原料，洗净，送入蒸煮槽中在115℃温度下蒸煮60min后，用高压3MPa分离，得牛软骨蛋白和牛软骨；
2)粉碎发酵
将步骤1)得到的牛软骨洗净、粉碎至平均粒径为0.5mm，得牛软骨粉末；向牛软骨粉末中加入纯净水并搅拌均匀，再加入占牛软骨质量3％的植物乳酸菌，调节pH至5.5，在35℃温度下恒温发酵38h，得发酵液；
3)离心分离
将步骤2)所得发酵液用离心分离机分离，转速为18000r/min，得清液和沉淀物；
4)酶解
将步骤3)所得沉淀物洗净，并加入纯净水，牛软骨粉末与纯净水的质量比为搅拌均匀，再加入沉淀物质量1％的木瓜蛋白酶，在48℃下酶解8h，得酶解液；再将酶解液加热至80℃，酶灭活40min，得灭活的酶解液；
5)制备胶原蛋白多肽
将步骤4)所得灭活的酶解液经超滤浓缩、阴离子交换树脂柱进行柱层析，收集流出液；再经去离子水洗脱，得洗脱液；将流出液与洗脱液混合均匀，用压力喷雾干燥，得胶原蛋白多肽；
6)制备软骨素
将步骤5)中去离子水洗脱后的阴离子交换树脂柱用食盐溶液洗脱，取洗脱液进行超滤脱盐，再加入无水乙醇至所得溶液中无水乙醇的体积浓度为80％，将得到的溶液静置4h，得沉淀；向沉淀中加入其3倍质量的双氧水，减压干燥，得软骨素。
利用本发明制备方法制取的胶原蛋白多肽的得率为95.1％，软骨素纯度达99.1％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。