一种基因重组表达中国鲎C因子特异性检测内毒素增强比浊法的制作方法

本发明属于基因工程和生物检测
技术领域：
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背景技术：
：细菌内毒素又名脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构。人体中微量的内毒素便可引起人体发热、休克甚至死亡，而且普遍存在且不易灭活。所以食品、药品、医疗器械在出厂前都要进行内毒素检测，同时也广泛应用于临床细菌感染的快速检测。目前鲎试剂(LAL/TAL)是国际上至今为止检测内毒素最常用的方法，已被广泛用于药物，外科器械、水和食品中内毒素检测。主要的检测方法有:凝胶法、浊度法和比色法。其中凝胶检测法具有检测速度快、操作方便等优点,但在检测时出现药品阳性对照假阴性的问题,这时需要重复实验,给检测带来很大的不便。浊度法可以定量检测,但是由于鲎试剂是从鲎血中提取出来的，其稳定性和特异性较差，导致在制作标准曲线时经常出现斜率变化大甚至无法作出合格标准曲线的问题。比色法的灵敏度和精密度都较高但操作复杂，目前主要用在血液、体液中微量内毒素测定。然而由于近年来过度运用鲎资源，再加上海洋环境污染等原因，鲎资源濒临枯竭，鲎现已经列入国家二级保护动物，因此鲎试剂的成本较高，样品还要进行前处理，测定时间长。由此可见，现今国内外对内毒素的测定方法都不是很理想。因此迫切需要开发鲎试剂的替代品，并建立真菌感染、食品、药品以及医疗器械中内毒素的检测新方法。技术实现要素：本发明的目的是：提供一种基因重组表达中国鲎C因子特异性检测内毒素增强比浊法，通过合成中国鲎C因子SSCrFCES序列，这段序列长923bp。将该基因片段克隆到分泌型表达载体上，再转化到宿主大肠杆菌细胞中，表达出中国鲎C因子SSCrFCES重组蛋白。利用得到的重组蛋白建立一种特异性检测内毒素的比浊法。本发明的技术方案是：将合成的SSCrFCES基因片段克隆到分泌型表达载体上，转化到宿主细胞中，从重组的大肠杆菌细胞株中筛选出能够高效表达的基因工程菌株。诱导重组SSCrFCES表达，结果显示重组蛋白在宿主细胞中主要以分泌蛋白形式存在。经过表达条件优化，确定优化的表达条件是：培养基PH6.0，培养温度27-29℃，诱导时菌体浓度OD600为1.3，诱导时间为48小时以上(含48小时)。通过Ni-NTA亲和层析纯化，并做SDS-PAGE电泳，利用凝胶成像分析软件测得纯度达到95％以上。纯化回收率达到40％。在聚乙二醇作用下，重组蛋白与羧基化的乳胶微球偶联，然后再与内毒素作用会形成悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；在340nm波长的光线通过该反应混合物时，随着反应混合物的浊度增大，检测体系的吸光值增大，故在0.03EU-0.48EU/ml范围内吸收度与复合物量呈正相关；当重组蛋白浓度固定时，检测体系的浊度与其所含内毒素量成正比，绘制标准曲线，从而测出未知内毒素的含量。本发明的有益效果是：发明得到的高纯度的SSCrFCES重组蛋白，利用比浊法对内毒素进行测定，具有成本低、快速、灵敏度高等特点。可广泛应用在检测真菌感染，食品，药品以及医疗器械检测等领域。本专利具有较高的实用价值和广阔的市场前景。附图说明图1是质粒提取电泳图1，2，3为带目的片段质粒；4，5不含目的片段载体；M1：DNAmarkerDL15000；M2：DNAmarkerDL2000；图2是线性化鉴定电泳图M1：DNAmarkerDL15000；M2：DNAmarkerDL2000；1为不含目的片段载体；2为带目的片段质粒；3，4为线性化产物；图3是PCR鉴定电泳图M1：DNAmarkerDL15000；1为带目的片段质粒；2为不含目的片段载体；3，4为低浓度PCR扩增产物；5，6为高浓度PCR扩增产物；M2:DNAmarkerDL2000；图4和图5是生工测序结果图图6是表达电泳图M为低分子量蛋白Marker；空为没有进行诱导的对照1，2，3分别为诱导12h,48h,24h后表达电泳图；图7是实验总体路线图；图8是比浊法在一定范围内测内毒素的标准曲线。具体实施方式实施例1实施所需的材料、试剂(1)酶类及其它生化试剂：质粒小提试剂盒(上海生工)；凝胶回收试剂盒(上海生工)。胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖，琼脂，低相对分子量标准蛋白，标准核酸：markerDL2000，markerDL15000，TEMED，溴酚蓝，SDS，Amp，CaCl2，考马氏亮蓝R-250，Tris-HCl，EDTA，NaOH，CH3COOH，山梨醇，葡萄糖，甲醇，甘油，生物素，Tris等(从Sigma公司购买)。其余试剂均为分析纯或生化试剂；所用引物及序列由上海生工公司合成。第一步骤、重组质粒，表达载体及菌株的构建(1)、设计合成重组质粒查找鲎血C因子的SSCrFCES段基因序列，为防止错配中间使用TT连接，并在序列前后加上XhoI和XbaI两个酶切位点。根据酵母密码子偏好性将片段进行优化，送至上海生工合成。根据引物设计原则，利用primerprimer软件设计引物：上游引物：5’-CTCGAGAAGAGAATGGTACTAGCATC-3’下游引物：5’-TCTAGAAACATCAGAAAGTAATTCCCTGAGC-3’(2)、重组质粒提取及鉴定使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒：①取3ml菌液于1.5mlEP管中，12000rpm离心30s.②加入250μlBufferP1，用枪吹打，混匀。③加入250μlBufferP2，立即温和颠倒5-10次，室温静置4min。④加入350μlBufferP3，立即温和颠倒5-10次，室温静置2min。⑤于离心机12000rpm离心10min，将上清全部小心倒入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑥向吸附柱中加入500μlWashSolution，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑦重复步骤⑥一次⑧将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm离心30min，将收集管扔掉，吸附柱于37℃烘箱烘干1h，同时预热无菌水，向每管加入20μl无菌水，放入新的1.5mlEP管，12000rpm离心2min。⑨配1％琼脂糖电泳胶，鉴定结果。(3)、重组质粒的转化及鉴定一、将提取出的重组质粒进行线性化。反应条件：置于恒温金属浴中，37℃抚育2h，在于65℃灭活20min。得到线性化的重组质粒。3.1线性化配制1％琼脂糖电泳胶，鉴定结果。二、线性化产物纯化①将酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的BufferB3，充分混匀。②将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。③向吸附柱中加入500μlWashSolution，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。④重复步骤③一次。⑤将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。将收集管扔掉，吸附柱于37℃烘箱烘干30min，同时预热ElutionBuffer。⑥将吸附膜中央加入25μlElutionBuffer，室温静止2min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续实验。配制1％琼脂糖电泳胶，鉴定结果。三、感受态细胞制备将扩大好的菌液冰浴30min。准备两个50mL离心管，每个离心管加入40mL菌液，4℃低温离心机1500g离心5min，充分弃上清，向沉淀内继续补充菌液，直至完成120mL菌液的菌沉淀收集工作。向其中一个离心管加入30mL冰浴的超纯水ddH2O重悬，并将菌悬液转移至另一菌沉淀离心管，重悬菌沉淀。1500g离心，弃上清，加20mL冰浴1MSorbitol轻轻吹洗。1500g离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约1ml(500μL)Sorbitol混匀，待用。四、转化吸取80μL感受态菌液至1.5mL离心管内，加入10μL(约100μg)的线性化重组质粒，混匀后转移至2mm电转杯中，冰上静置5min。电击参数：1.5KV，25μF，250欧姆。转移至无菌操作台，立即在电转杯中加入1mlSorbitol，28.0℃恒温培养箱中静置1小时，再加入500μl培养基28℃，200rpm振荡培养1小时。分别取50、100、200μL菌液涂布含抗生素的平板培养基上。28.0℃恒温培养箱中倒置培养2-3天。观察平板中菌落生长状态。五、PCR鉴定：3.2PCR利用琼脂糖凝胶电泳进行验证。将经鉴定含有目的片段测序载体(送到上海生工进行基因测序，查看基因序列并与报道序列进行序列比对。第二步骤、转化克隆子的表达鉴定及筛选(1)在平板中挑取单克隆菌落，接种于25mL培养基中培养。28℃，240rpm摇床震荡培养过夜。18-24小时，细胞计数仪检测OD600为2到6之间。(2)将菌液室温离心3000g，5min。加入等体积的另一培养基，充分重悬菌体，28℃，240rpm摇床震荡培养，开始诱导。每24h补加一次诱导剂，按终浓度为0.5％进行诱导。(3)在0h，24h，48h，72h时间点取1mL菌液，补加培养基。菌液室温10000rpm，离心3min，-20℃冰箱中保存上清。48h后收集10000rpm离心3min，含有终浓度30％甘油的培养基重悬，-80℃冰箱保存。(4)将诱导表达后的上清液浓缩后各取40μL，加入10μL5x上样缓冲液混匀，置于恒温金属浴中100℃加热5min，使蛋白质变性。(5)凝胶制备：分离胶本实验用12％30％AcrBis分离胶贮液6(ml)12(ml)分离胶缓冲液Tris1.8753.75SDS0.150.3TEMED1.53H2O5.32510.65Ap0.150.33％浓缩胶①.用两块电泳玻璃板制成垂直板槽(用1％琼脂封底，不能漏胶)，垂直放置。用枪将配置好的分离胶溶液加入板槽中，再加入去离子水，水封，待凝胶聚集后，倒出去离子水，用吸水纸吸干，加入浓缩胶，再小心插入梳子。②.上样：分别取样品于20μl离心管中，按30μl样品，10μl上样缓冲液混匀后再沸水浴中煮沸5min左右，用移液枪上样，上样结束后调节电泳仪电流到10mA，保持电流稳定不变，当溴酚蓝移动到离分离胶底1-2cm时停止电泳。(7)将胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，摇床染色1h，染色结束后，换为脱色液脱色。(8)电泳胶置于凝胶成像仪中观察，照相并保存。(9)电泳鉴定，经软件分析得目的蛋白占总蛋白表达量40％左右，分子量为38KD。第三步骤、建立特异性检测内毒素比浊法将纯化好的目的蛋白与羧基微球偶联1)取一定量180nm的微球，用0.02M的MES溶液调整到15mg/ml，混匀；2)逐滴加入10mg/mlEDC溶液，边加入边混匀，终浓度0.1mg/ml，37度旋转混匀(或室温混匀),反应25分钟后，取下离心20分钟；3)沉淀悬浮在0.05MPBS溶液中，超声确保微球均匀分散；4)逐滴加入抗体边加入边混匀，通常抗体的包被比10mg微球：1-1.5mg抗体；5)37度反应3小时后加入100mg/mlBSA溶液，终浓度3mg/ml；6)1小时候后加入1M甘氨酸溶液，终浓度0.05M,室温反应过夜即可。增强比浊法做四组一样的样品进行测定，内毒素标准品0.48EU/ml，将内毒素按体积梯度稀释，向96孔板内加入(50μl),再加入100μg/ml(100μl)的特异性蛋白质，混匀，反应5分钟，以蒸馏水代替内毒素的样品进行测定，作为空白值，在340nm到570nm的波长下进行测定，每组数据的吸光值是实际吸光度值减去空白值，以内毒素浓度为x轴，以这4组数据的平均吸光值为y轴，绘制曲线，得到较好的线性关系，如图8所示，此增强比浊法可以检测内毒素的下限为0.03EU/ml。合成中国鲎C因子SSCrFCES序列共有909bp，第1-909编码成熟，该成熟含有303个氨基酸。当前第1页1 2 3