植酸酶突变体YkAPPA‑L162V/L327V和YeAPPA‑L162V/L327V及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V及其编码基因和应用。

背景技术：

植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase)是一类重要的工业酶，降解植酸中磷酸单酯键生成无机磷和低级磷酸肌醇的一类酶的总称。目前大多数植酸酶的热稳定性和肠胃耐受性差，不能满足饲料工业中的要求，并且耐热耐酸和抗蛋白酶的植酸酶具有降低酶制剂的成本及对化学变性剂及相关金属利息具有较高的耐受力。基于此寻找有效方法，提高植酸酶在高制粒温度、低pH和高蛋白酶浓度的肠胃环境中的稳定性已成为植酸酶工业的当务之急。

随着蛋白结构和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工改造已是当前酶工程领域研究的热点。本发明应用定点突变技术改造植酸酶，分别获得植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V，其热稳定性明显提高，对肠胃低pH和高浓度蛋白酶的耐受性明显改良，而最适pH降低0.5个单位，扩大了其在工业上的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是通过定点突变的方法对植酸酶进行改造，使改造后的植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V或YeAPPA-L162V/L327V在耐受性上性质更加优良。

本发明另一目的是提供编码上述植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V或YeAPPA-L162V/L327V的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V或YeAPPA-L162V/L327V的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V或YeAPPA-L162V/L327V的重组菌株。

本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA或小肠结膜炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)来源植酸酶YeAPPA基因进行定点突变，该植酸酶的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4，所示的核苷酸序列编码的。

SEQ ID NO.1

MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

SEQ ID NO.2

Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

SEQ ID NO.3

MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

SEQ ID NO.4

Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

采用定点突变的方法，获得了2个提高耐酸性和胃蛋白酶抗性的突变体，分别命名为YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V，即YkAPPA或YeAPPA的第162位和第327位的亮氨酸突变为缬氨酸。

因此根据本发明的耐酸性和胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示

SEQ ID NO.5

MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKVDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKVLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.突变体YeAPPA-L162V/L327V的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示

MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKVDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

本发明还提供了编码上述耐酸性和胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示。

SEQ ID NO.7

AtgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaaGtggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaaGtgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

SEQ ID NO.8

AtgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaaGtggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaaGtgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

将上述编码耐酸性和胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V或YeAPPA-L162V/L327V的阅读框插入到所述载体的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pET-22b(+)，得到突变体的重组原核表达质粒。本发明优选的宿主菌为BL21(DE3)。所述植酸酶突变体的核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V的耐酸性和胃蛋白酶抗性明显提高，且最适pH降低，有利于发展节约型饲料酶工业。

附图说明

图1为改造前、后的植酸酶的蛋白酶抗性比较；

图2为改造前、后的植酸酶的耐酸性比较。

具体实施方式

1、菌株及载体：原核表达载体pET-22b(+)(图1)购自Novagen公司。BL21(DE3)细胞购自天根公司。

2、酶类及其它生化试剂：DNA纯化试剂盒购自TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、内切酶和连接酶购自天根。植酸钠和胃蛋白酶(p0685)购自Sigma。

3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

实施例1：突变基因的获得

采用Overlap PCR方法产生YKAPPA和YeAPPA的突变体YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V。该方法以含有野生植酸酶基因的重组质粒pEASY-T3-YkAPPA和pEASY-T3-YeAPPA为模板，通过两轮PCR反应引入突变。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,55℃30sec,72℃30-90sec,30个循环；72℃10min。根据野生型植酸酶YkAPPA和YeAPPA的基因序列设计合成扩增突变基因完整编码序列的上下游引物和在特定位置引入突变的上下游引物(见表1)。引物中下划线标记的核苷酸序列为突变位点。通过over-PCR扩增得到突变基因产物回收后连接到pEASY-T3载体上并经测序证实。

表1本实验所需引物

实施例2：突变植酸酶与野生酶在细菌中表达与纯化

除去信号肽序列的野生酶和突变酶，插入到表达载体pET-22b(+)上并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中诱导表达。用2mM IPTG在24℃下培养5h诱导表达植酸酶。粗酶液经Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)柱和DEAE(二乙基氨基乙基)柱进行纯化，并用10％SDS-PAGE电泳和酶活检测。总蛋白浓度采用Bio-Rad蛋白检测试剂盒分析。

野生植酸酶或突变植酸酶编码441个氨基酸，N端含有23个氨基酸的信号肽序列，其编码区序列在大肠杆菌中表达，经纯化后的野生酶和突变酶在SDS-PAGE电泳时均表现为一条约46kDa的特异性蛋白条带(数据未显示)。

实施例3突变植酸酶与野生酶的蛋白酶抗性比较

突变植酸酶与野生酶经不同浓度的胃蛋白酶和胰蛋白酶分别在pH 2和pH 7下处理2h后，通过酶活性变化研究蛋白酶对植酸酶活性的影响。蛋白酶和植酸酶比例在1/1000到1/20之间。植酸酶活性测定使用硫酸亚铁钼蓝法。5％体积的酶液加入到1.5mmol/L植酸钠底物中，在37℃下反应30min，用1mL 10％TCA终止反应，再用2mL显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32％硫酸亚铁)进行显色。对照是在加酶液之前先加入TCA混匀使酶变性，其它相同。根据显色后的700nm光吸收计算酶活。

突变酶YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V在1/1000至1/20的胰蛋白酶下处理2h后，分别与野生酶YkAPPA和YeAPPA保持类似的酶活，当胰蛋白酶处理浓度从1/1000上升至1/20时，突变酶YkAPPA-L162V/L327V的酶活性基本不变，YkAPPA丧失约40％的酶活性(图1)。而突变酶YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V的胃蛋白酶抗性明显高于野生酶(图1)。在1/1000至1/20的胃蛋白浓度下，YeAPPA-L162V/L327V可保持31.1％以上的酶活性，而YeAPPA酶在1/1000的胃蛋白酶浓度时已完全失活。当胃蛋白浓度从1/1000升至1/20时，YKAPPA-L162V/L327V可保持61.1％的酶活，而YKAPPA仅保持1.1％的活性。

实施例4：突变植酸酶与野生酶的耐酸性比较

野生酶和突变酶在pH 1-4下37℃处理2h，研究酶的耐酸性。突变酶YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V在pH1-3.5下的稳定性明显高于野生酶(图2)。在pH1-3.5下处理2h，突变酶YkAPPA-L162V/L327V可保持81.2％以上的酶活性，而野生酶YkAPPA只保持58.4％的酶活性。在pH 1和pH 1.5下处理2h时，突变酶YeAPPA-L162V/L327V分别保持7.2％和31.6％的酶活性，而野生酶YeAPPA则完全失去活性。

实施例5：突变植酸酶与野生酶的酶学性质比较

野生酶与突变酶在pH1-12和30-80℃下反应30min，确定最适pH和最适温度。酶液在pH 1-9下37℃处理1h，研究酶的pH稳定性；在60℃下分别处理0，2，5，10，20，30，60min后测定热稳定性。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH 1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH 3-6；0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH 6-8；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 8-12。

对突变酶与野生酶的最适pH和pH稳定性进行了比较(表2)。突变酶YkAPPA-L162V/L327V与YeAPPA-L162V/L327V的最适pH分别为4和4.5，与野生型YkAPPA和YeAPPA相比各降低了0.5个pH单位。YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V分别在pH2-10和pH3-9下具有高的稳定性。在pH1下突变酶YkAPPA-L162V/L327V较野生酶有更好稳定性，可保持基本不变酶活，而YkAPPA却丧失36.3％的酶活。在pH 2下突变酶YeAPPA-L162V/L327V与野生酶相比具有较好的耐酸性，可保持91.7％的酶活性，而YkAPPA仅剩余18.4％的酶活。

对突变酶与野生酶的最适温度和温度稳定性进行了比较(表2)。突变酶YkAPPA-L162V/L327V与YeAPPA-L162V/L327V的最适温度与野生酶相似，分别为55℃和45℃。在60℃下处理30min，突变酶YkAPPA-L162V/L327V与YeAPPA-L162V/L327V比野生酶具有更好的热稳定性，分别保持38.8％和16.7％的酶活性，而YkAPPA和YeAPPA仅剩余16.1％和0.6％的酶活。

表2改造前后的植酸酶的酶学性质比较

在酶促反应体系中加入终浓度为1mmol/L的不同金属离子与化学试剂，研究各种物质对酶活的影响。各种金属离子和化学试剂对突变体YkAPPA-L162V/L327V与YeAPPA-L162V/L327V的酶活性有不同的影响(表3)。Cu²⁺强烈抑制野生酶YeAPPA-L162V/L327V的活性而对YkAPPA-L162V/L327V的酶活没有影响。Pd²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Hg²⁺和SDS强烈抑制突变酶YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V的酶活。其他化学物质对突变酶YkAPPA-L162V/L327V和YeAPPA-L162V/L327V的酶活性几乎没有影响。与野生酶相比，YkAPPA和YeAPPA的第162位且327位亮氨酸突变为缬氨酸降低了Hg²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺与Ag⁺对植酸酶活性的抑制作用。

表3化学试剂对改造前后的植酸酶的影响