以流感病毒M1为骨架的MERS‑CoV嵌合型VLPs疫苗的制作方法

背景技术：
中东呼吸系统综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coranavirus，MERS-CoV)是一种新型冠状病毒，该病毒最早于2012年6月，从一名患有急性呼吸窘迫综合征病人体内分离获得，随后在约旦、卡塔尔等中东地区一直有感染病例报道。据WHO报道，截止至2016年4月14日，全球26个国家实验室确诊MERS-CoV感染者累计1714例，其中死亡618例，病死率高达36.1％。研究表明蝙蝠可能为该病毒的动物储存宿主，而单峰驼可能为其中间宿主和重要传染源，但其传染途径尚不明确，目前亦无特异性药物对抗其感染，因此研制一种有效疫苗预防和控制MERS-CoV感染迫在眉睫。

MERS-CoV与其他冠状病毒相似，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。病毒表面的棘突蛋白(Spike，S)是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞发生交互作用时发挥着重要的作用，因此S抗原成为MERS-CoV疫苗研究的靶抗原。

病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLPs)是由一种或几种病毒结构蛋白自我组装的、不含病毒核酸的、不可复制增殖的空心颗粒。其结构和真病毒十分相似，且可重复高密度的展示外源抗原表位，因此可以诱导强大的细胞免疫和高效价的中和抗体反应。因其不含病毒基因组，不可在体内外复制和增殖，因此不会造成机体感染。这些特点使得VLPs作为一种安全、有效的疫苗，越来越受到人们的重视。到目前为止，多种病毒如HBV、HPV、HEV以及流感病毒的VLPs疫苗已用于临床。除此之外，RSV、EV71、HIV及诺如病毒等VLPs疫苗已进入临床实验阶段，且显示了很好的应用前景。最近，肆虐非洲的埃博拉病毒的VLPs疫苗亦研制成功，这些均表明了VLPs作为疫苗预防病毒性疾病的可行性。

SARS-CoV病毒样颗粒疫苗的研究中，将分别表达S、M和E蛋白的重组杆状病毒共感染昆虫细胞，可在该系统里成功包装出SARS-CoV的VLPs。除此之外，在该杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)内共表达SARS-CoV的S蛋白和流感病毒基质蛋白M1，可成功获得SARS-CoV的嵌合型VLPs，并且这种VLPs产量很高，免疫含0.8μgS蛋白的VLPs即可保护小鼠免受致死量SARS-CoV的攻击。另有研究，将呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)的F或G蛋白与流感病毒M1蛋白嵌合，同样获得了RSV的嵌合型VLPs，该VLPs在小鼠体内亦获得较好的免疫保护效果。

故本专利将流感病毒M1基因以及MERS-CoV的S基因分别插入到pFastBacDual载体中，构建了重组质粒pFastBacDual-M1-S，将该质粒转化大肠杆菌DH10Bac，在其体内获得了重组杆粒Bacmis-M1-S。将该杆粒转染昆虫细胞Sf-9后获得了重组杆状病毒M1-S。将该病毒感染昆虫细胞后，在其体内包装了MERS-CoV嵌合型VLPs。电镜下该VLPs与天然MERS-CoV形态相似。将该嵌合型VLPs免疫小鼠后，小鼠血清检测到高水平S蛋白特异性IgG抗体以及中和抗体，表明该嵌合型VLPs具有良好的免疫原性。该研究为进一步开发有效的疫苗预防和治疗MERS-CoV感染提供重要依据。

技术实现要素：
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应用杆状病毒昆虫细胞表达系统包装了MERS-CoV嵌合型VLPs，纯化后在小鼠体内证实该嵌合型VLPs具有良好的免疫原性，具有进一步开发为有效的疫苗预防和治疗MERS-CoV感染的前景。

附图说明

图1：质粒pFastBacDual-M1-S酶切鉴定结果。1道为质粒经NheI和KpnI双酶切鉴定目的片段M1，2道为质粒对照，3道为质粒经BamHI和XbaI双酶切鉴定目的片段S，M代表Marker。

图2：质粒pFastBacDual-M1-S转化DH10Bac感受态细胞后的结果。蓝色标记为可疑重组质粒。

图3：重组杆粒Bacmis-M1-S经PCR扩增鉴定结果。1道用M13通用引物和M1特异性引物组合鉴定M1基因的正确重组，2道用M13通用引物和S特异性引物组合鉴定S基因的正确重组，M代表Marker。

图4：光镜下观察不同处理组Sf细胞结果。左侧为转染Bacmis-M1-S杆粒5d后的Sf9细胞，右侧为对照培养5d的Sf9细胞。

图5：转染杆粒Bacmis-M1-S后的Sf9细胞经PCR扩增结果。1道鉴定S基因重组成功，2-3道为阴性对照，4道鉴定M1基因重组成功，2-3道为阴性对照。

图6：Western-blot鉴定外源蛋白的表达。A图用抗MERS-CoV S的单克隆抗体做一抗的结果，B图为用抗流感病毒M1的抗体做一抗的结果。黑色箭头指向目的蛋白。

图7：IFA鉴定外源蛋白的表达。左上为正常Sf9细胞光镜下的观察结果，左下为同视野的细胞荧光显微镜下的观察结果。右上为感染重组杆状病毒M1-S后的Sf9细胞光镜下的观察结果，右下为同视野的细胞荧光显微镜下的观察结果。

图8：Western-blot鉴定目的蛋白表达情况。A图鉴定S表达，1-3道为目的蛋白，M代表蛋白marker；B图鉴定M1表达，1-3道为目的蛋白，M代表蛋白marker。

图9：电镜负染及金标免疫电镜下观察的病毒样颗粒。上面一行显示负染结果，下面一行显示免疫电镜观察结果。

图10：VLPs疫苗免疫小鼠血清S蛋白特异性IgG抗体ELISA检测结果。第二次免疫后2w(A图)以及第三次免疫后2w(B图)小鼠血清S蛋白特异性IgG抗体滴度。

图11：假病毒检测末次免疫后2w小鼠血清中和抗体结果。P150代表假病毒抑制率为50％时抗体的滴度。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。

实施例1：构建重组穿梭质粒pFastBacDual-M1-S

载体pFastBacDual含有p10和pH两个启动子，可以同时表达两种外源的目的蛋白。先将流感病毒M1基因从携带该基因的重组质粒上扩增后，插入到p10启动子下方构建了重组质粒pFastBacDual-M1。将携带MERS-CoV的S基因扩增后，插入到重组质粒pFastBacDual-M1的pH启动子下方，构建重组质粒pFastBacDual-M1-S。如图1所示，构建后的质粒经NheI和KpnI双酶切后，可获得大小约为750bp(M1)目的条带、用BamHI和XbaI双酶切该质粒，获得了约4000bp(S)的目的条带。将酶切鉴定正确的质粒送上海英潍捷基生物技术有限公司测序，发现插入的片段和目的序列完全一致，证明成功构建了重组质粒pFastBacDual-M1-S。

实施例2：获得重组杆粒Bacmid-M1-S

将使用质粒大提试剂盒获取的重组质粒pFastBacDual-M1-S，在大肠杆菌DH10Bac^TM感受态细胞中进行重组，重组后mini-Tn7从供体质粒pFastBacDual-M1-S插入到DH10Bac感受态细胞中的母体质粒中，干扰LacZa的表达，使得重组质粒表现为蓝色背景下的白色菌落。如图2所示，含有三种抗生素的平板上出现白色的菌落，挑取独立的、个体较大的可疑重组菌落进行下一步鉴定。

可疑重组菌落经过震荡培养后，取菌液做模板，应用目的片段特异性引物和重组骨架上的M13特异性引物进行PCR鉴定，结果如图3。使用M1F和M13F配对引物进行扩增获得如下2550bp左右目的条带，证明外源基因M1重组成功。使用S2600F和M13R配对引物进行扩增获得如下4600bp左右目的条带，证明外源基因S重组成功。综上，质粒pFastBacDual-M1-S在大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中重组成功，获得了重组杆粒Bacmis-M1-S。

实施例3：获得重组杆状病毒M1-S

3.1光镜观察：将重组后的杆粒Bacmis-M1-S在6孔板中转染昆虫细胞Sf9，逐日观察细胞变化。转染3d后可见细胞停止生长，细胞体积变大；病变逐渐发展，至转染后5d对照组细胞生长均匀且致密，而转染后的细胞有部分脱落，悬浮于培养液中，贴壁生长细胞较疏松、个体较大、形态不一、部分出现细胞空泡，甚至多个细胞融合形成巨细胞，如图4黑色箭头所示。

3.2PCR扩增鉴定：提取病变后Sf9细胞的DNA，用其做模板，进行PCR扩增，结果见图5。使用使用M1F和M13F配对引物进行扩增获得如下2550bp左右目的条带，证明外源基因M1转染至Sf9细胞中。使用S2600F和M13R配对引物进行扩增获得如下4600bp左右目的条带，外源基因S转染至Sf9细胞中。综上，重组杆粒Bacmis-M1-S转染Sf9细胞成功。

3.3Western-blot鉴定：转染杆粒Bacmis-M1-S后的Sf9细胞经PCR扩增证实含有外源基因M1和S后，经Western-blot外源蛋白M1和S的表达，结果如图6所示。应用抗MERS-CoVS的单克隆抗体做一抗，可见左图外源蛋白S在P1、P2和P3代重组病毒中均可表达(图6A)。应用抗流感病毒M1的抗体做一抗，可见右图外源蛋白M1在P1、P2和P3代重组病毒中亦可表达(图6B)。

3.4IFA鉴定：12孔板内用重组杆状病毒M1-S感染后的Sf-9细胞用IFA鉴定外源蛋白S的表达，同时用不感染病毒的Sf细胞做阴性对照，结果见图7。左上和左下为不感染病毒的Sf细胞鉴定结果，可见细胞无荧光闪现。图右上和右下为感染病毒M1-S的结果，可见绝大多数细胞发出绿色荧光，且细胞膜荧光较深。即外源蛋白S在昆虫细胞Sf9中表达。

实施例4：获得嵌合型MERS-CoV VLPs

接种重组杆状病毒M1-S至悬浮培养的High Five细胞，进行扩大培养。72h后收集培养的病毒液，经20％蔗糖垫层超速离心后，Western-blot鉴定目的蛋白S和M1的表达，结果如图8所示，即170KDa左右有目的蛋白S的表达(图8A)，同时25KDa处有目的蛋白M1的表达(图8B)。

将20％蔗糖垫层获得的重组蛋白，经过蔗糖梯度离心。在40％以及60％蔗糖层均可见一层白色蛋白沉积带，吸取白色蛋白沉积带再次经20％蔗糖垫层离心以去除蔗糖。将蔗糖梯度离心获得的蛋白样品，送电子显微镜下负染观察。结果如图9所示，可见镜下多个圆形、直径约80-100左右、有包膜、包膜上带棘突的病毒样颗粒。使用抗MERS-CoV S蛋白的单克隆抗体做一抗，经金标免疫电镜检测，可在镜下看到病毒样颗粒棘图蛋白表面有黑色金颗粒附着。

实施例5：VLPs疫苗在小鼠体内诱导有效体液免疫应答

将大量制备并纯化后的VLPs疫苗免疫小鼠，每次免疫后2w，分离小鼠血清，ELISA检测小鼠血清S蛋白特异性IgG抗体。结果表明，初次免疫后2w部分VLPs疫苗免疫小鼠血清抗体阳转。而Al(OH)₃和CpG佐剂对照组小鼠血清均未出现阳转。第二次免疫后2w，各组小鼠血清IgG抗体滴度如图10A所示。由图可见，VLPs疫苗在小鼠体内诱导了有效的S蛋白特异性IgG抗体，抗体滴度达1∶80,000。同时佐剂对照组仅有低水平的抗体背景值。第三次免疫后2w，各组小鼠血清IgG抗体滴度如图10B所示。由图可见，VLPs疫苗在小鼠体内诱导的S蛋白特异性IgG抗体滴度较第二次免疫后有所升高，同样佐剂对照组仅有低水平的抗体背景值。

末次免疫后2w，处死小鼠，分离血清，灭活后用假病毒中和实验检测免疫小鼠血清中和抗体滴度，结果见图11。由图可见，VLPs疫苗在小鼠体内诱导了MERS-CoV中和抗体，而佐剂对照组仅有低水平的抗体背景值。即该嵌合型VLPs疫苗在小鼠体内诱导了S蛋白特异性IgG抗体和中和抗体，显示了良好的免疫原性，可进一步开发为疫苗预防和治疗MERS-CoV引起的感染。