本发明涉及一种病毒毒株及灭活疫苗，尤其涉及一种禽腺病毒毒株、灭活疫苗及制备方法，属生物工程技术领域。
背景技术：
鸡包涵体肝炎-心包积水综合征(Inclusion Body Heptatis-Hydroperioadium Syndrome，IBH-HPS)是新近流行的、急性、高度接触性的一种鸡传染病，其病原为禽腺病毒(Fowl adenovirus,FADV)，在病毒分类上为腺病毒科，禽腺病毒属中的Ⅰ亚群禽腺病毒。病毒主要感染1-3周龄的肉鸡、817杂交肉鸡、麻鸡，也多见于肉种鸡和蛋鸡，其中以3-7周龄的肉鸡发病较多。
在国内该病已呈全国性流行，主要在山东、河南、安徽、辽宁、吉林、河北、江苏等地发生。该病主要垂直传播，也可水平传播，鸡感染后可成为终身携带者，并可间歇性排毒。此病死亡率达20％～80％，给养殖业带来了巨大的经济损失。
在诊断方面，目前主要通过临床症状、组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法进行确诊；在疫病防控方面，目前虽然已有应用鸡胚、禽源细胞培养禽腺病毒的研究报道，但已有报道的大部分毒株血清型与目前市场流行毒株不相符，因此，目前市场亟需开发一种血清型与目前市场流行毒株相符、效价高、免疫原性良好的禽腺病毒疫苗。
技术实现要素：
本发明目的之一是提供一种禽腺病毒毒株，以便为研制禽腺病毒灭活疫苗奠定基础。
本发明目的之二是提供一种禽腺病毒灭活疫苗。
本发明目的之三是提供所述禽腺病毒灭活疫苗的制备方法。
在一个实施方案中，禽腺病毒毒株命名为禽腺病毒TJ株，保藏号为CCTCC NO:V201632。所述病毒为禽腺病毒Ⅰ亚群中的C种，血清型为4型，病毒核酸为双股DNA，无囊膜；病毒颗粒直径为70～90nm，呈20面体对称结构。在氯化铯中浮密度为1.32～1.37g/ml；病毒对脂溶剂如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2％酚、50％乙醇等具有抵抗力，同时耐受pH 3～9，但在1：1000的甲醛中可被灭活。病毒的增殖也可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制；病毒对热具有较强的抵抗力，在60℃30min仍具有活力；病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡及大鼠红细胞；该病毒可经9～10日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊途径培养，也可在鸡胚肾细胞(CEK细胞)、鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)、鸡胚肝细胞(CEL细胞)上增殖，对鸡胚肾细胞不致病变。
在本发明所述的禽腺病毒灭活疫苗中，所述灭活疫苗优选由禽腺病毒经接种细胞、收获毒液、灭活和乳化制备而得，所述禽腺病毒毒株优选为禽腺病毒TJ株，保藏号为CCTCC NO:V201632。
本发明所述的制备禽腺病毒灭活疫苗的方法，优选包括以下步骤：将禽腺病毒接种于CEK细胞，收获毒液，灭活和乳化制备而得，具体步骤如下：
a.制备CEK细胞：取17～20日龄SPF鸡胚，在无菌环境下取出肾脏，置于适量胰酶液中，37℃消化。消化完全后，取上清液加入适量血清终止消化，1500rpm离心10min，弃上清，用细胞生长液重悬细胞沉淀并稀释至细胞数终浓度为1×106～1.2×106细胞/ml，37℃培养48～72h至长成良好单层细胞；
b.病毒接种：将禽腺病毒按103.0～104.0ELD50/0.1ml接种于CEK细胞，加入细胞维持液，37℃继续培养；
c.收获毒液：病毒接种细胞培养72h时，首次收获病毒液，再加入等量细胞维持液继续培养，每48～60h收获一次，连续收获3次，第三次连同细胞一起收获；每次收获量为培养液总体积的90％～100％；按照中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版、三部)中半数感染量测定方法，测定收获毒液病毒含量，收获毒液效价≥106.5ELD50/0.1ml；
d.灭活：向收获毒液中加入质量浓度(g/g)为37％的甲醛溶液并使其最终含量(V/V)达0.1％～0.2％，摇匀，37℃灭活16～20h；
e.乳化：
水相制备：将上述灭活后的禽腺病毒毒液按体积比(V/V)4％～6％加入吐温-80，搅拌均匀，即为水相；
油相制备：在白油中按质量体积比(W/V)0.8％～2.0％加入硬脂酸铝，按体积比(V/V)5～6％加入司本-80，灭菌后即为油相；
将水相和油相按1:1.67～1:3比例混合乳化，即成禽腺病毒灭活疫苗。
上述制备禽腺病毒灭活疫苗的方法，所述步骤a中细胞生长液的配方以体积百分含量计由以下成分组成：90～92％的M199液，8～10％的新生牛血清，调整pH值为7.2～7.4；步骤b中细胞维持液的配方以体积百分含量计由97～98％的M199液、2～3％的新生牛血清、2.0～2.4mmol/L的精氨酸，调整pH值为7.2～7.4。
本发明所述的制备禽腺病毒灭活疫苗的方法优选包括：将禽腺病毒接种于鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)，收获毒液、灭活和乳化制备而得，具体步骤如下：
a.细胞培养：
将DF1种子细胞从液氮中取出37℃水浴融化，并用细胞生长液(DMEM/F12培养基)复苏培养，培养3天后细胞数量为4.0～5.0×107.0cell/ml，并按照1:3～1:4传代，37℃培养2天；
b.病毒接种：将禽腺病毒按102.0～103.0ELD50/0.1ml接种于DF1细胞，加入细胞维持液(DMEM/F12培养基)，37℃继续培养；
c.收获毒液：病毒接种细胞培养72h～96h时，将细胞连同培养液冻融收获；按照中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版、三部)中半数感染量测定方法，测定收获毒液病毒含量，收获毒液效价≥105.5ELD50/0.1ml；
d.灭活：向收获毒液中加入质量浓度(g/g)为37％的甲醛溶液并使其最终含量(V/V)达0.1％～0.2％，摇匀，37℃灭活16～20h；
e.乳化：
水相制备：将上述灭活后的禽腺病毒毒液按体积比(V/V)4％～6％加入吐温-80，搅拌均匀，即为水相；
油相制备：在白油中按质量体积比(W/V)0.8％～2.0％加入硬脂酸铝，按体积比(V/V)5～6％加入司本-80，灭菌后即为油相；
将水相和油相按1:1.67～1:3比例混合乳化，即成禽腺病毒灭活疫苗。
上述制备禽腺病毒灭活疫苗的方法，所述步骤a中细胞生长液的配方以体积百分含量计由以下成分组成：90～92％的DMEM/F12培养液，8～10％的新生牛血清，调整pH值为7.2～7.4；步骤b中细胞维持液配方以体积百分含量计由下述成分组成97～98％的DMEM/F12培养液、2～3％新生牛血清、2.0～2.4mmol/L精氨酸，调整pH值为7.2～7.4。
本发明所述疫苗具有以下特点：
(1)禽腺病毒TJ株为目前鸡包涵体肝炎-心包积水综合征的流行毒株，免疫原性好，增殖能力强，适合作为疫苗毒株；
(2)优选细胞培养液配方，提高病毒在CEK细胞和DF1细胞的适应性和培养滴度，满足制备高效价疫苗需求；
(3)连续多次收获CEK细胞培养病毒液，提高了疫苗产量；
(4)本发明制备的禽腺病毒灭活疫苗安全性高，稳定性好，免疫应答产生迅速，攻毒保护率高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式做进一步的说明，这些实例仅用于说明，而不用于限制本专利的保护范围。
本发明所述病毒毒株命名为禽腺病毒TJ株，于2016年05月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:V201632；所述病毒为禽腺病毒Ⅰ亚群中的C种，血清型为4型，病毒核酸为双股DNA，占整个病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分为蛋白质，无囊膜；病毒颗粒直径为70～90nm，呈20面体对称结构。在氯化铯中浮密度为1.32～1.37g/ml；病毒对脂溶剂如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2％酚、50％乙醇等具有抵抗力，同时耐受pH 3～9，但在1：1000的甲醛中可被灭活。病毒的增殖也可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制；病毒对热具有较强的抵抗力，在60℃30min仍具有活力；病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡及大鼠红细胞；该病毒可经9～10日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊途径培养，也可在鸡胚肾细胞(CEK细胞)、鸡胚肝细胞(CEL细胞)和鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)上增殖。禽腺病毒TJ株分离自禽包涵体肝炎-心包积水综合征病鸡肝脏组织，采用接种鸡胚肾细胞分离增殖获得，对鸡胚肾细胞不致病变，毒株增殖能力强，免疫原性好，适合做疫苗毒株。
SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)购自中国兽医药品监察所；M199培养基、DMEM/F12培养基、新生牛血清均购自GIBCO公司。
实施例1应用鸡胚肾细胞(CEK细胞)制备禽腺病毒灭活疫苗
细胞生长液的配方为：体积百分含量为90％的M199液，10％新生牛血清，调整pH值至7.2；
细胞维持液配方为：体积百分含量为98％的M199液，2％新生牛血清，2.4mmol/L精氨酸，调整pH值至7.4；
a.制备CEK细胞：取17日龄SPF鸡胚，在无菌环境下取出肾脏，置于适量胰酶液中，37℃消化。消化完全后，取上清液加入适量血清终止消化，1500rpm离心10min，弃上清，用细胞生长液重悬细胞沉淀并稀释至细胞数终浓度为1×106细胞/ml，37℃培养72h，细胞长成良好单层；
b.病毒接种：将禽腺病毒按104.0ELD50/0.1ml接种于CEK细胞，加入细胞维持液，37℃继续培养；
c.收获毒液：病毒接种细胞培养72h时，首次收获病毒液，再加入等量细胞维持液继续培养，以后每48h收获一次，连续收获3次；前两次收获量为培养液总体积的90％；第三次收获量为培养液总体积的100％，将培养液连同细胞冻融一次收获。按照中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版、三部)中半数感染量测定方法，测定收获毒液病毒含量，收获毒液效价为106.7ELD50/0.1ml；
d.灭活：向收获毒液中加入质量浓度(g/g)为37％的甲醛溶液并使其最终含量(V/V)为0.2％，摇匀，37℃灭活16h；
e.乳化：
水相制备：将上述灭活后的禽腺病毒毒液按体积比(V/V)4％加入吐温-80，搅拌均匀，即为水相；
油相制备：在白油中按质量体积比(W/V)1.2％加入硬脂酸铝，按体积比(V/V)5％加入司本-80，灭菌后即为油相；
将水相和油相按1:1.67比例混合乳化，即成禽腺病毒灭活疫苗。
性状检验：该疫苗为油包水类型，粘度小，稳定性良好；在37℃保存3个月，在4℃保存12个月不出现分层、变色等异常；
安全检验：采用2倍使用剂量免疫鸡，观察2周，精神状态、采食量等均未见任何异常；
效力检验：试验鸡接种本疫苗后10天产生免疫力，2周时产生较强免疫力，免疫期为5个月，免疫期内的攻毒保护率为100％。
实施例2应用鸡胚成纤维细胞系(DF1细胞)制备禽腺病毒灭活疫苗
细胞用生长液配方为：体积百分含量为92％的DMEM/F12液，8％新生牛血清，调整pH值至7.2；
细胞维持液配方为：体积百分含量为97％的DMEM/F12液，3％新生牛血清，2.2mmol/L精氨酸，调整pH值至7.3；
a.细胞培养：
将DF1种子细胞从液氮中取出37℃水浴融化，并用细胞生长液(DMEM/F12培养基)复苏培养，培养3天后细胞数量为4.0×107.0细胞/ml，并按照1:3传代，37℃培养2天；
b.病毒接种：将禽腺病毒按103.0ELD50/0.1ml接种于DF1细胞，加入细胞维持液(DMEM/F12培养基)，37℃继续培养；
c.收获毒液：病毒接种细胞培养72h时，将细胞连同培养液冻融收获。按照中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版、三部)中半数感染量测定方法，测定收获毒液病毒含量，收获毒液效价为105.9ELD50/0.1ml；
d.灭活：向收获毒液中加入质量浓度(g/g)为37％的甲醛溶液并使其最终含量(V/V)达0.2％，摇匀，37℃灭活18h；
e乳化：
水相制备：将上述灭活后的禽腺病毒毒液按体积比(V/V)6％加入吐温-80，搅拌均匀，即为水相；
油相制备：在白油中按质量体积比(W/V)1.2％加入硬脂酸铝，按体积比(V/V)6％加入司本-80，灭菌后即为油相；
将水相和油相按1:2比例混合乳化，即成禽腺病毒灭活疫苗。
性状检验：该疫苗为油包水类型，粘度小，稳定性良好；在37℃保存3个月，在4℃保存12个月不出现分层、变色等异常；
安全检验：采用2倍使用剂量免疫鸡，观察2周，精神状态、采食量等均未见任何异常；
效力检验：试验鸡接种本疫苗后14天产生免疫力，3周时产生较强免疫力，免疫期为5个月，免疫期内的攻毒保护率为90％。