本发明涉及动物医药生物工程领域，一种适应Vero细胞的禽传染性支气管炎病毒H120反向疫苗株R-H120-Beaudette P65(S)。
背景技术：
禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的禽传染性支气管炎(IB)，是危害养禽业的重大传染病之一，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降30-50％、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。在我国该病发病率100％，死亡率10-30％，国内每年造成的经济损失超过十亿元。禽传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗代表性毒株(H120)只能通过鸡胚培养，存在生产成本高，生产质量不稳定，容易受外源病毒污染等问题。研究IBV疫苗毒株的细胞适应性，解决IBV疫苗株不能在传代细胞中培养的问题是目前研究的主方向。1937年，Beaudette首次报道了禽传染性支气管炎病毒在鸡胚中培养的报道，发现IBV Beaudette毒株不仅能够在鸡胚细胞上面生长，而且能够在火鸡的肾脏细胞上生长，Fang等将Beaudette毒株在Vero细胞中传代到第7代，能够表现出很好的适应性，当传至65代，能够获得高滴度发现能够很好的适应传代细胞。Yount等也证明Beaudette能够适应Vero，BHK21细胞。但是，IBV H120等病毒毒株只能够通过鸡胚或者原代细胞进行培养而不适应传代细胞从而制约着疫苗工厂化生产。为解决此问题，1999年Joanna等将强毒株MHV-4和温和株MHV-59的S基因进行替换，验证S基因是MHV神经毒力的一个决定性的因素。2000年Lili Kuo等将MHV的S蛋白用FIPV的S蛋白进行替换，构建了一种嵌合病毒，从而使MHV的细胞嗜性由鼠细胞变成了猫细胞。2001年Sonia Navas等通过比较几种MHV S蛋白在肝脏中的复制以及所引起的肝炎严重程度不同，证明了S蛋白在其中起主要作用。1999年Carlos等对TEGV的S基因进行置换研究发现，S基因是TGEV的一个毒力和组织嗜性的一个决定性因素。2003年Bert等将MHV的S基因与FIPV的S基因重组，发现S基因是FIPV的宿主嗜性的一个决定性因素。对于IBV，2001年Casais R等用痘苗病毒载体成功建立了IBV反向遗传操作技术，通过IBV反向遗传技术，用IBV强毒株M41的S基因替换弱毒株Beaudette的S基因，构建出重组病毒BeauR-M41，其表现出与S基因的供体M41株相同的组织嗜性，与BeauR的组织嗜性不同，表明S蛋白是IBV组织嗜性的决定因素。2003年Casais等发现S蛋白的变异主要发生在S1上，其中某些氨基酸的变化将改变某些结构域的构象，产生新的变异IBV毒株。此外，2011年Armesto用不同血清型IBV毒株S基因替换 Beau毒株的S基因，发现构建的BeauR-4/91(S)与BeauR-M41(S)一样，BeauR-4/91(S)不具有致病性。且所获得的拯救病毒BeauR-4/91(S)对4/91具有同源保护作用。重组毒株BeauR-M41、BeauR-4/91(S)不能在Vero细胞上生长，重组株BeauR-M41(S1)and BeauR-M41(S2)能够表现很好的生长，其中BeauR-M41(S1)在Vero中滴度较高。研究表明，禽传染性支气管炎病毒S蛋白决定病毒组织嗜性。本研究拟通过对不适应细胞生长的H120毒株反向遗传系统，将适应细胞生长的Beaudette毒株的S基因替换H120毒株的S基因，获得具有适应细胞生长的R-H120-Beaudette P65(S)。
技术实现要素：
发明根据本实验室对禽传染性支气管炎病毒H120(GenBank Accession Number：FJ888351)反向遗传系统，根据No See’M技术，用PCR扩增Vero细胞适应毒株Beaudette P65株S基因，替换H120毒株S基因，获得R-H120-Beaudette P65(S)拯救毒株。
附图说明
【图号】图1：Vero细胞适应重组R-H120-BeaudetteP65(S)毒株构建策略图
具体实施方式
1、本发明所用禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统为为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室所构建。细胞适应性毒株Beaudette P65毒株S质粒由新加坡南洋理工大学教授赠送，使用的传代细胞BHK21为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存。抗IBV血清购自中国兽医药品监察所。限制性内切酶BsaI，BsmB I，NciI为购自NEB公司，PCR高保真酶，pMD19-T，T4连接酶购自大连宝生物有限责任公司，胶回收试剂盒购自TIANGEN有限责任公司，引物设计和序列测定为上海生工有限责任公司。
2、按照No See’M技术，设计1对引物扩增Vero细胞适应毒株Beaudette P65株S基因.引物序列：Beaud SF：5’-CGTCTCATGTTGGTAACACCTTTTACT-3’Beaud SX:5’-CGTCTCGGATCATCAAACAGT-3’。
3、P65-S基因克隆：使用高保真酶对P65-S基因进行扩增，按照高保真酶说明书94℃2min，98摄氏度10s，65℃45s，68℃4min，68℃10min程序30个循环扩增P65S基因，琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，通过使用天根胶回收试剂盒进行纯化回收，获得纯化的Beaudette p65毒株S基因，将获得Beaudette P65S基因PCR产物与pMD19-T连接反应，PCR产物4.5μL；pMD19-T载体0.5μL；solutionⅠ5μL，混匀，16℃过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养16h后，在 含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，接种5ml液体培养基中，37℃，进行培养，然后挑阳性菌液2-3个送上海生工进行测序，若比对结果与GenBank中一致，表明克隆成功。
4、使用碱裂解法抽提质粒DNA，将所鉴定阳性克隆子大量培养，碱裂解法提取质粒。
5、质粒酶切：目的cDNA片段的酶切回收：分别对载有Beaudette P65S基因片段的质粒进行酶切：Beaudette p65S片段：BsmB I酶切(酶切体系如下)：
BsmB I 2μL，NEB buffer 4 5μL，BSA(10mg/ML)0.5μL，质粒20μL，ddH2O 22.5μL，总体系50μL，55℃温育8h。
6、改造后全长cDNA的体外构建
Beaudette P65S基因替换H120反向遗传系统H120第203107-23802位点，获得应用已构建的H120毒株反向遗传系统，重新连接全长cDNA，获得改造后的IBV H120毒株全长cDNA，构建策略如图1。
7、细胞适应性H120毒株cDNA的体外转录及恢复病毒的获得
体外转录试剂盒进行转录，取约200ng经纯化连接产物作为模板，使用mMESSAGE mMACHINE T7Ultra Kit进行体外转录，反应体系如下：
(1)全长cDNA体外转录体系：10×T7Reaction Buffer 2μL，T7 2×NTP/ARCA 10μL，GTP 3μL，Template DNA 5μL，T7Enzyme Mix 2μL，20μL体系
(2)N-3’cDNA体外转录体系：10×T7Reaction Buffer 2μL，T7 2×NTP/ARCA 10μL，GTP 3μL，Template DNA 5μL，T7Enzyme Mix 2μL，20μL体系
37℃温育2h后，加入1μL TURBO DNase，温育15min。-80℃保存。
8、电击转染
(1)将BHK细胞培养至单层时，用0.25％胰酶消化，加入8mLDMEM完全培养基，悬浮细胞。(2)4℃400g离心3min。(3)弃上清，加入10mL不含FBS、青链霉素的DMEM重悬细胞，离心。(4)重复步骤3一次。(5)重悬细胞于不含FBS、青链霉素的DMEM，使细胞浓度约为1×107/mL。(6)将细胞置冰浴中10min，取0.8mL转入0.4mL电击杯中，将1μg转录体与细胞小心混匀。(7)进行电穿孔，使用Gene Pulser Xcell系统，电击参数为：电压400v、脉冲时长25ms、脉冲次数3、脉冲间隔0.5s。(8)电击结束后，将电击杯置冰浴中5min，将细胞稀释后转入培养瓶中，补加培养液稀释20倍，37℃培养并观察。
9、反向遗传拯救株R-H120-Beaudette P65(S)的鉴定
(1)引起的鸡胚病变及EID50的测定
SPF鸡胚孵化至10日龄；将IBV依次作10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.2mL，作5个重复，同时设正常鸡胚对照。置37℃培养，弃去24h内死亡胚，再孵化7天后观察。按Reed-Muench法计算EID50，拯救毒株EID50为7log2。
(2)反向遗传拯救株R-H120-Beaudette P65(S)的RT-PCR鉴定
分别对转染后48h的细胞液、和将细胞液接入鸡胚中获得的鸡胚尿囊液RT-PCR鉴定，引物扩增区域覆盖引入的沉默突变位点，目标片段长度为584bp，引物序列为IBV-H-R-F：5’-AATATAAGACAGAGCACAAG-3’，IBV-H-R-R：5’-CTGTCATACAAAGCAGCACTACA-3’
(4)IFA检测反向拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)
1)Vero细胞培养至单层，PBS洗涤二遍，弃掉PBS，胰酶消化，加入2mL10％血清终止消化。2)将细胞用15mL离心管，2000r/min，离心3min，弃上清。用无血清DMEM重悬。3)重复第二步。4)吸取1μL第三步中重悬细胞液，使用血球计数板进行细胞计数。5)将一定数量量的Vero细胞接种到12孔板中，过夜培养12-15h。6)用已经灭菌的PBS(pH 7.2)洗涤2遍。7)将拯救毒株接种H120、R-H120-Beaudette P56(S)接种已经长满单层的80％，吸附1小时，其中H120，PBS作为对照，每15min中轻轻摇晃30S。8)加人2mL，含有2.0％胎牛血清(无双抗)的DMEM高糖培养基、培养15h。9)将培养15小时的12孔细胞培养板中培养液弃掉，PBS洗涤2遍，并吸干细胞孔中残留PBS。10)每孔加入1.5mL固定液，甲醇：丙酮1：1，负20摄氏度固定30min。11)弃掉固定液、自然风干。使用PBS洗涤3遍。12)加入1％，BSA，37摄氏度封闭30min。13)加入2ml抗IBV H120毒株血清(1:100)，37摄氏度孵育90min，PBS洗涤3遍，间隔10min。14)加入抗IBV血清二抗IgG-FITC二抗，37℃孵育60min，PBS洗涤3遍，间隔10min。15)荧光倒置显微镜下观察荧光，结果能够看见荧光。
10、反向遗传拯救株R-H120-Beaudette P65(S)的生物学特性
(1)将拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)，R-H120在鸡胚中生长，结果表明拯救毒株生长曲线与亲本毒株R-H120无显著性差异。
(2)拯救毒株传代稳定性：连续提取10代拯救毒株RNA，RT-PCR顺利扩增拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)，顺利扩增出490bp左右大小的特异性目的片段，并顺利扩增出R-H120-Beaudette P65(S)毒株S基因，表明拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)能够稳定遗 传。
(3)C型魏氏梭菌滤液处理的R-H120-Beaudette P65(S)尿囊液的鸡红细胞凝集试验1)无菌心脏采取3只成年健康公鸡的外周血共20mL，用10-15倍量的无菌生理盐水洗涤3次，用无菌生理盐水配制成0.75％(v/v)红细胞悬液，4℃保存备用。将兔源A型魏氏梭菌以无菌操作方法接种于厌氧肉肝汤培养基中，置37℃培养500L，经5000rpm室温离心30min后，收集上清液。H120尿囊液上清液100μL加入A型魏氏梭菌滤液100μL，作为阳性对照；2)SPF尿囊液上清液100μL加入A型魏氏梭菌滤液100μL，作为阴性对照-2；3)待检尿囊液上清液100μL加入等体积的PBS 100μL作为阴性对照-1；4)待检尿囊液上清液100μL加入A型魏氏梭菌滤液100μL，待检。所有样品37℃水浴作用3h，按常规微量法测定红细胞凝集价，以出现50％凝集的病毒最大稀释倍数作为该样品的红细胞凝集价，每个样品重复3次。结果表明，R-H120-Beaudette P65(S)使用胰酶或者魏氏梭菌处理后能够凝集鸡血细胞，滴度为211，未经处理的R-H120-Beaudette P65(S)不能凝集鸡红细胞。
(4)拯救毒株EID50测定结果
R-H120-Beaudette P65(S)拯救毒株接种SPF鸡胚表现出感染IBV的典型症状，发育迟缓、矮小、蜷缩。按Reed-Muench法计算，R-H120-Beaudette P65(S)EID50为10-6.9EID50/0.2ml，拯救毒株EID50与亲本毒株无显差异。
(5)拯救毒株在传代细胞Vero中病理变化(CPE)
将所获得拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)接种Vero细胞后，毒株能在Vero细胞中稳定传代，并通过观察发现，R-H120-Beaudette P65(S)能够使Vero细胞产生明显的细胞病变，细胞变圆，变亮，脱落、死亡。
(6)拯救毒株免疫原性与IBV标准攻毒株(M41)攻毒保护结果
拯救毒株R-H120-Beaudette P65(S)免疫SPF鸡群后，使用ELISA方法检测鸡群抗体滴度，结果表明鸡群能够产生IBV抗体，与亲本毒株R-H120抗体滴度无显著差异。能够对IBV标准攻毒株(M41)产生80％的免疫保护作用，保护率与亲本株无显著差异。因此，R-H120-Beaudette P65(S)具有作为细胞适应性IBV疫苗候选株的潜力。