本发明涉及外周血PBMC分离技术领域，尤其涉及一种快速获取外周血PBMC的方法
背景技术：
自体免疫T细胞技术，是从患者的外周血中分离出T细胞，通过体外培养、扩增、制剂，回输患者体内，诱导人体自身产生免疫应答。目前T细胞的获得主要来源于人外周血PBMC中。主要的分离方法是将人外周血直接与PBS等量混合，然后加入淋巴分离液中进行梯度分离，最后获得PBMC。这种方法对血量少的样本来说尚可操作，但是在分离大量的血量时(>100ML)，操作步骤繁琐，耗时长，不利于PBMC的分离和细胞的活率；另外比较大量的采血(>100ml)使用的是一次性塑料血袋，使用过程中需要先剪短塑料血袋的血管，将血样转入离心管中再进行后续的PBMC操作，操作步骤繁琐。
技术实现要素：
本发明提出了一种快速获取外周血PBMC的方法，使用过程中不需要剪短塑料血袋的血管，将血样放入离心管中再进行相关的操作。该方法对于大量人外周血PBMC分离不仅可减少操作步骤，缩短了操作时间，保证了细胞活率，且节约了实验耗材及试剂用量，有利于PBMC的成本控制。
本发明提出的一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将装有血液样本的塑料血袋放入离心管适配器中，配平后离心；
S2、除去上层血浆后，将中间的灰黄层取出，向取出的灰黄层中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
优选地，在S1中，离心速度为1200-1800rpm，离心时间为10-20min。
优选地，在S1中，将装有血液样本的塑料血袋放入适配250ml离心管的适配器中。
优选地，在S2中，吸取灰黄层至离心管中，加入生理盐水稀释至离心管总体积的70-80％。
优选地，在S3中，吸取20-30ml S2得到的产物，加入到含有15-30ml淋巴细胞分离液的离心管中。
优选地，在S3中，吸取25ml S2得到的产物，加入到含有20ml淋巴细胞分离液的离心管中。
优选地，在S4中，离心速度为1500-1800rpm，离心时间为10-30min。
本发明可快速获取大量血PBMC后的T细胞，方法简便，易于操作，本发明直接将采血后的血袋放入适配离心管的离心机中直接离心，人工挤出血浆后，轻轻挤出中间的灰黄层到离心管中进行后续的操作，从而节约了时间、试剂、耗材。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将装有血液样本的塑料血袋放入离心管适配器中，配平后离心；
S2、除去上层血浆后，将中间的灰黄层取出，向取出的灰黄层中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
实施例2
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将30ml装有血液样本的塑料血袋放入离心管适配器中，配平后离心，离心速度为1800rpm，离心时间为10min；
S2、除去上层血浆后，将中间的灰黄层取出，向取出的灰黄层中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
实施例3
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将150ml装有血液样本的塑料血袋放入适配250ml离心管的适配器中，配平后离心，离心速度为1200rpm，离心时间为20min；
S2、除去上层血浆后，将中间的灰黄层取出，向取出的灰黄层中加入生理盐水稀释；
S3、将S2得到的产物送入含有淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
实施例4
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将40ml装有血液样本的塑料血袋送入适配50ml离心管适配器中，配平后离心，离心速度为1500rpm，离心时间为16min；
S2、挤出上层血浆后，挤出10ml灰黄层至1个50ml离心管中，加入生理盐水稀释至离心管体积的70％，剩余灰黄层按上述步骤稀释处理；
S3、将30ml S2得到的产物送入含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1500rpm，离心时间为30min，剩余S2得到的产物按上述步骤离心处理；吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
实施例5
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将40ml装有血液样本的塑料血袋送入适配50ml离心管适配器中，配平后离心，离心速度为1600rpm，离心时间为14min；
S2、挤出上层血浆后，吸取17.5ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至离心管体积的80％，剩余灰黄层按上述步骤稀释处理；
S3、将20ml S2得到的产物送入含有30ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1800rpm，离心时间为10min，剩余S2得到的产物按上述步骤离心处理；吸取中间白膜层，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
实施例6
一种快速获取外周血PBMC的方法，包括如下步骤：
S1、将120ml装有血液样本的塑料血袋送入适配250ml离心管的适配器中，配平后离心，离心速度为1500rpm，离心时间为15min；
S2、挤出上层血浆后，吸取15ml灰黄层至50ml离心管中，加入生理盐水稀释至离心管总体积的75％，剩余灰黄层按上述步骤稀释处理；
S3、将25ml S2得到的产物送入含有20ml淋巴细胞分离液的离心管中，其中S2得到的产物位于淋巴细胞分离液上层；
S4、离心分离，离心速度为1600rpm，离心时间为20min，剩余S2得到的产物按上述步骤离心处理；吸取中间白膜层至50ml离心管中，洗涤，离心弃上清，得到外周血PBMC。
将采用实施例6的方法与传统方法对比，其中传统方法为将人外周血和PBS等量混合，然后加入淋巴分离液进行梯度分离，最后获得PBMC。
将两者使用的淋巴分离液的使用量、移液管数量、离心管数量、操作时间进行对比，测试结果如下表1所示：
表1本发明方法与传统方法测试结果对比表
本发明可节约大量的淋巴分离液，用本方法只需要60ml的淋巴分离液，而传统的方法却需要近280mL淋巴分离液；大约只需要传统方法1/10的耗材，如离心管、移液管等；相比传统的方法节约大量的时间。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。