使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病的制作方法

使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病的制作方法
【专利说明】使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病 本申请是申请日为2006年12月28日，申请号为200680053495. 8 (国际申请号为PCT/US2006/062667)，发明名称为"使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病"的发明专利申请的分 案申请。 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求2005年12月28日提交的美国临时专利申请第60/754, 366号的权利， 该临时专利申请的内容通过引用整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及针对外周血管疾病患者特别是外周缺血患者的基于细胞的疗法或再 生疗法的领域。具体的说，本发明提供具有以下能力的衍自产后组织的细胞：刺激和支持血 管发生，改善血流，再生、修复和改善受外周缺血事件损害的骨骼肌，和保护骨骼肌免受缺 血损害。 发明背景
[0003] 本说明书通篇引用到各种出版物，包括专利、公布的申请、技术文章和学术文章。 这些被引用的出版物每一个都通过引用整体结合到本文中。
[0004] 外周血管疾病（PVD)可因血管特别是肢体和在心脏的远端的区域的血管的动脉 硬化闭塞症而引起，导致血流减少和闭塞（occlusion)处周围和下游的组织的氧灌注不 足。PVD常出现在髂血管、股血管和腿弯部血管及锁骨下血管，它的影响可被血栓症、栓子或 创伤加剧。据估计，在美国大约有800万到1200万人受到PVD的折磨，特别是老年人口和 糖尿病患者。
[0005] PVD的常见症状包括上下肢和末端（extremities)的痉挛、麻痹、虚弱、肌肉疲劳、 四肢和末端的疼痛、四肢和末端的低温、末端的变色、皮肤干燥或剥落及高血压。最常见的 症状是跛行或者闭塞的血管下游的肌肉的疼痛感、抽紧感和疲劳感，这些感觉在一些形式 的锻炼如步行过程中出现，但休息一段时间后自行消除。
[0006] 在病理生理学上，闭塞的血管会引起梗阻（obstruction)部位和梗阻部位的远端 的组织的局部缺血。这种局部缺血通常称为外周缺血，意思是它发生在心脏的远端的部位。 局部缺血的严重性因梗阻的大小和数量、梗阻是否接近肌肉或器官及是否有足够的多余血 管系统而异。在较为严重的情况中，局部缺血会导致受影响组织的死亡，可导致受影响肢体 的截肢乃至患者的死亡。
[0007] PVD的更为严重病情目前的治疗方法包括化疗方案、血管成形术、固定模插入 (insertionofstents)、重建外科手术（reconstructivesurgery)、旁路移植、受影响组 织的切除术或者截肢术。可惜的是，对于许多患者来说，这些介入方法成功率有限，且许多 患者会经历到病症或症状的恶化。
[0008] 目前，人们有兴趣使用能分裂和分化的干细胞或者来自其他来源的肌肉细胞（包 括平滑肌细胞和骨骼肌细胞）来帮助组织损害的修复或逆转。干细胞的移植可用作临床 工具来重构靶组织，从而恢复生理和解剖机能。干细胞技术的应用是广泛的，包括组织工 程、基因疗法递送和细胞疗法，后者也就是通过外源供应能产生或含有生物治疗剂的活细 胞或细胞成分将这些生物治疗剂递送到靶部位（有关综述参见Tresco，P.A.etal，（2000) AdvancedDrugDeliveryReviews42:2-37)。干细胞的鉴定已刺激了旨在选择性产生供 再生医学用的特异性细胞类型的研究。
[0009] 干细胞技术治疗潜力的实现的一个阻碍一直是获得足够数量的干细胞有困难。胚 胎组织或胎儿组织是干细胞的一个来源。已从多种哺乳动物物种（包括人类）分离了胚胎 干细胞和祖细胞，有几种这种细胞类型已被证实能够自我更新和扩展以及分化成多种不同 的细胞谱系。但从胚胎或胎儿来源衍生干细胞已引起了许多伦理和道德问题，这些问题需 要通过鉴定其它来源的多能（multipotent)或多潜能（pluripotent)细胞来进行避免。
[0010] 产后组织如脐带和胎盘作为干细胞的另选来源已引起人们兴趣。例如，已描述了 通过胎盘的灌注或从脐带血或组织进行的收集来回收干细胞的方法。从这些方法获取干细 胞的限制因素一直是所获得的脐带血体积或细胞数量不足，还有从这些来源获得的细胞群 体存在异质性或缺乏表征。
[0011] 具有分化成一批（anarrayof)骨骼肌谱系、周细胞谱系或血管谱系的能力的基 本上均质的这种细胞群体，如能得到可靠的、良好表征的和充裕的供应，在以下各种诊断性 和治疗性应用中将会是有利的：骨骼肌修复、再生和改善，血管发生的刺激和/或支持，和 外周缺血事件后血流的改善，特别是在PVD患者中。 发明概述
[0012] 本发明的一个方面涉及用于治疗患有外周血管疾病的患者的方法，所述方法包括 将产后衍生细胞以能有效治疗外周血管疾病的量给予该患者，其中所述产后衍生细胞衍自 基本上没有血液的人胎盘或脐带组织；其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩展，和具 有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮表型的细胞的潜力；其中所述细胞需 要L-缬氨酸用于生长并能在至少约5%氧中生长；其中所述细胞还包含以下特征中的至少 一个：a)在培养中倍增至少约40次的潜力；b)在包被或未包被的组织培养容器上的贴壁 和扩展，其中包被组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋 白的包被层；c)组织因子、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白中的至少一个的产生；d)⑶10、 CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a、PD-L2 和HLA-A，B，C中的至少一个的产生；e)CD31、CD34、 CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ中的至少一个的 产生的缺乏，这通过流式细胞术来检测；f)相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓 细胞这些人细胞而言，至少一个编码以下物质的基因的基因表达提高：白细胞介素8 ;网硬 蛋白（reticulonU;趋化因子（C-X-C模体）配体1(黑素瘤生长刺激活性，a);趋化因子 (C-X-C模体）配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子（C-X-C模体）配体3 ;肿瘤坏死因子， a诱导蛋白3 ;C型凝集素超家族成员2 ;Wilms肿瘤1 ;醛脱氢酶1家族成员A2 ;肾素；氧 化低密度脂蛋白受体1 ;人类（Homosapiens)克隆IMAGE:4179671 ;蛋白激酶CG;假拟蛋 白DKFZp564F013 ;在卵巢癌1中下调；和来自克隆DKFZp547klll3的人类基因；g)相对于成 纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，至少一个编码以下物质的基因 的基因表达减少：矮身材同源框2 ;热激27kDa蛋白2 ;趋化因子（C-X-C模体）配体12 (基 质细胞衍生因子1);弹性蛋白（主动脉瓣上狭窄、Williams-Beure综合征）；人类mRNA; cDNADKFZp586M2022 (来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源框2 (生长停滞特异性同源 框）；sineoculis同源框同源物1 (果蝇）；晶状体蛋白，aB;形态发生2的凌乱缔合激活 剂；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin1 ;四连蛋白（纤溶酶原结合蛋白）；src同源性 3 (SH3)和半胱氨酸富集域；胆固醇25-羟化酶；矮子相关转录因子-3 ;白细胞介素11受体， a;前胶原C肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果蝇）；假拟基因BC008967;胶原，VIII型， a1 ;生腱蛋白C(结合腕蛋白（hexabrachion));易洛魁族人同源框蛋白5;hephaestin;整 联蛋白，0 8 ;突触小泡糖蛋白2 ;成神经细胞瘤，致瘤性1的抑制；胰岛素样生长因子结合 蛋白2,36kDa;人类cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744;细胞因子受体样因子1 ;钾中 等/小电导率钙激活通道，亚家族N，成员4 ;整联蛋白，0 7 ;带PDZ结合模体的转录共激活 剂（TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蝇）；KIAA1034蛋白；小泡相关膜蛋白5(肌短 蛋白）；含EGF纤蛋白样胞外基质蛋白1 ;早期生长应答3 ;distal-less同源框5 ;假拟蛋白 FLJ20373;醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-a羟基类固醇脱氢酶，II型）；双糖链蛋白聚 糖；带PDZ结合模体的转录共激活剂（TAZ);纤连蛋白1 ;脑啡肽原；整联蛋白，0样1 (带 EGF样重复结构域）；人类mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422 ;EphA3 ;KIAA0367 蛋白；钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C(心房钠尿肽受体C);假拟蛋白FLJ14054 ;人类mRNA; cDNADKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222) ;BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白 3 样；AE结合蛋白1 ;细胞色素c氧化酶亚单位Vila多肽1(肌肉）；类似于neuralin1 ;B细 胞易位基因 1 ;假拟蛋白FLJ23191 和DKFZp586L151 ;h)MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、 FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES和HMP1 中的至少一个的分泌；i)TGF-0 2、ANG2、 TOGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一个的分泌的缺乏，这通过ELISA来检测。
[0013] 在一个具体的实施方案中，外周血管疾病是外周缺血。在某些实施方案中，所述细 胞在体外被诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系细胞后再进行给予。在 另一个实施方案中，对所述细胞进行遗传工程改造以产生能促进外周血管疾病的治疗的基 因产物。
[0014] 在所述方法的一些实施方案中，将所述细胞与至少一种其他细胞类型一起给 予，该其他细胞类型可包括骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖 细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞或者其他多潜能（multipotent)或多能 (pluripotent)干细胞。该其他细胞类型可以在给予产后衍生细胞的同时或之前或之后给 予。
[0015] 在其他实施方案中，将所述细胞与至少一种其他药物一起给予，该其他药物可以 是例如抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促生血管剂或抗细胞凋亡剂。该其 他药物可以在给予产后衍生细胞的同时或之前或之后给予。
[0016] 所述细胞优选在外周缺血的部位或在该部位的近端给予，但也可在外周缺血的远 端的部位给予。它们可通过注射、输注、植入患者体内的装置来给予，或者通过含有它们的 基质（matrix)或支架（scaffold)的植入来给予。所述细胞可对患者的骨豁肌、血管平滑 肌或血管内皮施加营养作用如增殖。所述细胞可诱导骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内 皮细胞、骨骼肌祖细胞、周细胞、血管平滑肌祖细胞或血管内皮祖细胞迀移到外周血管疾病 如外周缺血的（一个或多个）部位。
[0017] 本发明的另一个方面涉及用以治疗外周血管疾病患者的药物组合物和药盒，所述 药物组合物和药盒包含药物可接受的载体和上述产后衍生细胞或从这种产后衍生细胞制 备的制品（preparation)。在一些优选的实施方案中，所述制品包含FGF和HGF。所述药物 组合物和药盒被设计和/或配制用来实施上述本发明方法。
[0018] 根据本发明的另一个方面，上述方法可用从所述产后衍生细胞制备的制品来实 施，其中所述制品包含所述产后衍生细胞的细胞裂解物、所述产后衍生细胞的胞外基质或 生长所述产后衍生细胞的条件培养基。优选的是这种制品包含FGF和HGF。
[0019] 本发明的其他方面涉及含有包含所述产后衍生细胞的细胞裂解物、胞外基质或条 件培养基的制品的药物组合物和药盒。
[0020] 参阅下文的发明详述和实施例，将会理解本发明的其他特征和优点。 附图简述
[0021] 图1显示hUTC批次120304、MSCs和成纤维细胞对内皮细胞的增殖的作用。内皮 细胞以5000个细胞/cm2(10, 000个细胞/孔）的密度接种到24孔组织培养皿的底部上， hUTC批次120304、MSCs或成纤维细胞以5000个细胞/cm2 (1，650个细胞/嵌块（insert)) 的密度接种在转孔嵌块的内部，细胞是在共培养培养基（Hayflick80%+EGM-2MV20%或 Hayflick50%+EGM-2MV50%)中。共培养7天后，收获细胞，用GUAVA?仪器计数。还 将内皮细胞保持在EGM-2MV中作为阳性对照。A，HUVECs。B，HCAECs。C，HIAECs。
[0022] 图2显示hUTC批次120304和中和性抗体对内皮细胞的增殖的作用。HUVECs或 HCAECs以5000个细胞/cm2 (10, 000个细胞/孔）的密度接种到24孔组织培养皿的底部上， hUTC批次120304以5000个细胞/cm2 (1，650个细胞/嵌块）的密度接种在转孔嵌块的内部， 细胞是在共培养培养基（Hayflick50%+EGM-2MV50%)中。此时还加入抗FGF(7yg/ml)、 HGF(1yg/ml)或VEGF(1yg/ml)的中和性抗体。共培养7天后，收获细胞，用GUAVA? 仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为阳性对照。显示了用生长因子单独 处理和用生长因子加中和性抗体处理的细胞。A，HUVECs.。B，HCAECs。
[0023] 图3显示hUTC批次120304细胞裂解物和中和性抗体对HUVECs的增殖的作用。 HUVECs以在EGM-2MV培养基中5000个细胞/cm2 (10, 000个细胞/孔）的密度接种到24孔 组织培养皿的底部上，保持8小时。然后将细胞在0. 5ml含0. 5%FBS和不含生长因子的 EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥饿处理。之后，加入FBS、新制备的hUTC批次120304 细胞裂解物和抗FGF(7yg/ml)或HGF(1yg/ml)的中和性抗体。培养4天后，收获细胞，用 GUAVA?仪器计数。浅灰色柱条为培养基对照。中灰色柱条为与含62.5yg蛋白质的裂 解物温育的HUVECs。深灰色柱条为与含125yg蛋白质的裂解物温育的HUVECs。
[0024] 图4显示hUTCs和MSCs对内皮细胞的迀移的作用。HUVECs或HCAECs以5000个 细胞/cm2 (23, 000个细胞/嵌块）的密度接种在转孔嵌块的内部，hUTC批次120304或MSCs 以5000个细胞/cm2 (48, 000个细胞/孔）的密度接种到6孔组织培养皿的底部上，细胞是 在在共培养培养基（Hayflick50%+EGM-2MV50%)中。共培养7天后，收获在转孔嵌块 的底面上的细胞，用GUAVA?仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为对 照。A，HUVECs。B，HCAECs。
[0025] 图5显示hUTC批次120304和中和性抗体对内皮细胞的迀移的作用。HUVECs或 HCAECs以5000个细胞/cm2(23, 000个细胞/嵌块）的密度接种在转孔嵌块的内部，hUTC 批次120304以5000个细胞/cm2(48, 000个细胞/孔）的密度接种到6孔组织培养皿的 底部上，细胞是在在共培养培养基（Hayflick50%+EGM-2MV50%)中。此时还加入抗 FGF(7yg/ml)或HGF(lyg/ml)的中和性抗体。共培养7天后，收获在转孔嵌块的底面上 的细胞，用GUAVA?仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为对照。A， HUVECs〇B，HCAECs〇 发明详述
[0026] 在本说明书和权利要求书中使用到各种术语。这些术语采用其在本领域的普通含 义，除非另有规定。其他专门定义的术语要按与本文提供的定义相一致的方式来解释。
[0027] 干细胞是以单个细胞同时具有自我更新和分化产生后代细胞的能力为特征的未 分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非自我更新的祖细胞和末端分化细胞。干细胞还以其以 下能力为特征：从多个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）体外分化成各种细胞谱系的功能细 胞的能力，在移植后产生具多个胚层的组织的能力，和在注射到胚泡后实质上促成大多数 的组织（如果不是实质上促成所有的组织的话）的能力。
[0028] 干细胞根据它们的发育潜力分为以下几类：（1)全能细胞（totipotent) ; (2)多能 细胞（pluripotent) ;(3)多潜能细胞（multipotent) ;(4)寡能细胞（oligopotent)和（5) 单能细胞（unipotent)。全能细胞能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够 产生所有的胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系的子集（subset)，但都在特 定的组织、器官或生理系统当中的那些细胞。例如，造血干细胞（HSC)能产生包括以下的后 代：HSC(自我更新）、局限于血细胞的寡能祖细胞及所有为血液的正常组分的细胞类型和 成分（例如血小板）。寡能细胞能比多潜能干细胞产生更局限的细胞谱系子集。单能细胞 能够产生单一细胞谱系（例如精子发生干细胞）。
[0029] 干细胞还根据它们的获取来源来分类。成人干细胞通常是见于包含多个分化细胞 类型的组织中的多潜能未分化细胞。成人干细胞能自我更新。在正常的情况下，它还能分化 产生其来源组织的特化细胞类型，或许还产生其他组织类型的特化细胞类型。胚胎干细胞 是来自胚泡阶段的胚胎的内细胞团（innercellmass)的多能细胞。胎儿干细胞是来源于 胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上来源于分娩后可得到的胚胎外组织即胎盘和 脐带的多潜能细胞或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞所特有的特征，包括快速 增殖和有分化成许多细胞谱系的潜力。产后干细胞可以是衍自血液（例如从脐带血获得）， 或者是非衍自血液（例如从脐带的非血液组织和胎盘获得）。
[0030] 胚胎组织通常定义为来源于胚胎（在人类中是指从授精到发育约六个星期的时 期）的组织。胎儿组织是指来源于胎儿的组织，胎儿在人类中是指从发育约六个星期到分 娩的时期。胚胎外组织是与胚胎或胎儿有关、但不来源于胚胎或胎儿的组织。胚胎外组织 包括胚胎外膜（绒毛膜、羊膜、卵黄囊和尿囊）、脐带和胎盘（它本身从绒毛膜和母体基蜕膜 形成）。
[0031] 分化是非特化的（"非定向的"）细胞或特化程度较低的细胞获得特化细胞（例如 神经细胞或肌细胞）的特征的过程。分化细胞是在细胞的谱系当中占有了较为特化的（"定 向的"）状态的细胞。术语定向当应用到分化的过程时是指在分化途径中进行到这样的程 度的细胞，在该程度下，它在正常情况下会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且 在正常情况下不能分化成别的细胞类型或者回复到分化程度较低的细胞类型。去分化是指 细胞回复到细胞的谱系当中特化（或定向）程度较低的状态的过程。本文所用的细胞的谱 系定义某细胞的遗传，也就是说它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。某细胞的谱系将确 定细胞在发育和分化的遗传体系（hereditaryscheme)当中的位置。
[0032] 在广义上，祖细胞是具有产生比它本身更为分化的后代的能力、但仍保持补充祖 细胞库的能力的细胞。按这个定义，干细胞本身也是祖细胞，末端分化细胞的更为直接的前 体同样是祖细胞。当提到本发明的细胞时，可使用祖细胞的这个广泛定义，这在下文中有更 详细的描述。在狭义上，祖细胞往往定义为在分化途径中处于中间地位的细胞，也就是说它 从干细胞产生，在成熟细胞类型和细胞类型子集的产生中处于中间地位。这种类型的祖细 胞通常不能够自我更新。因此，如果在本文中提到这种类型的细胞，它会被称为非更新祖细 胞或者称为中间祖细胞或前体细胞。
[0033] 本文所用的词语分化成中胚层谱系、外胚层谱系或内胚层谱系是指分别变得定向 于特定的中胚层谱系、外胚层谱系或内胚层谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中 胚层细胞的细胞的实例包括但不限于生脂细胞、生软骨细胞、生心脏细胞、生真皮细胞、造 血细胞、成血管细胞、生肌细胞、生肾细胞、生泌尿生殖道细胞、生骨细胞、生心包细胞或基 质细胞。分化成外胚层谱系的细胞的实例包括但不限于表皮细胞、生神经细胞和生神经胶 质细胞。分化成内胚层谱系的细胞的实例包括但不限于生胸膜细胞、生肝细胞、产生肠内膜 的细胞和产生胰腺和内脏的细胞。
[0034] 本发明所用的细胞通常称为产后细胞或产后衍生细胞（procs)。它们有时候还可 更具体地称为脐带衍生细胞（UDCs)或胎盘衍生细胞（PDCs)。另外，细胞还可被描述为干细 胞或祖细胞，后一术语以广义使用。术语衍生用来表示细胞已从它们的生物来源获得并进 行了生长或以别的方式进行了体外操纵（例如在生长培养基中培养以扩展群体和/或产生 细胞系）。脐带干细胞的体外操纵和本发明的脐带衍生细胞的独特特征在下文中作详细描 述。