MP-1)、促血管生成素2 (ANG2)、血小板生成素（TP0)、角质形成细胞生长因子 (KGF)、肝细胞生长因子（HGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)和血管内皮生长因子（VEGF)的 可测量数量的组织抑制剂。 表2-2.从产后衍生细胞释放的潜在生血管因子
产后衍生细胞在5%氧中在含2%FBS的培养基中培养24小时。移取培养基，通过SEARCHLIGHTmultiplexELISA测定（Pierce)进行测定。结果是两次重复分析的平均值。 数值为培养基中的浓度，以皮克/毫升培养基记录。Plac:胎盘衍生细胞；Umbcord:脐带 衍生细胞。 总结
[0157] 结果表明产后衍生细胞在体外MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA) 测定中能刺激人脐带静脉和冠状动脉内皮细胞形成网络。这个作用类似于已知的生血管因 子在这个测定系统中所见到的作用。这些结果提示产后衍生细胞可用于在体内刺激血管发 生。 实施例3 hUTCs对内皮细朐的体外增葙和讦務的作用
[0158] 进行了研究，以确定人脐带组织衍生的细胞（hUTCs)对内皮细胞体外增殖和迀 移的作用。这些作用是通过将hUTCs与内皮细胞共培养和通过将人脐带静脉内皮细胞 (HUVECs)的培养物与hUTC裂解物进行温育来进行研究的。这里给出的结果显示，hUTCs能 诱导内皮细胞的增殖和迀移的增加。此外，数据还提示这些作用部分上是由成纤维细胞生 长因子（FGF)和肝细胞生长因子（HGF)介导的。 材料和方法细胞培养
[0159] 将批号为120304的冷藏人脐带组织衍生细胞（hUTCs)在传代8-9之间解冻，接种 到包被明胶的瓶子，在Hayflick生长培养基（DMEM-低葡萄糖[Gibco,目录号11885-084]、 15%v/v胎牛血清[FBS，Hyclone，目录号 SH30070. 03]、0? 001 %v/v0 -疏基乙醇[Sigma， 目录号M7154]及50U/ml青霉素和50微克/ml链霉素[Gibco,目录号3810-74-0])中进 行培养。对于这里所详述的研究，所用的细胞是在第10或11次传代。人脐带静脉内皮细 胞（HUVECs，目录号C2517A)、人冠状动脉内皮细胞（HCAECs，目录号CC2585)和人髂动脉内 皮细胞（HIAECs，目录号CC2545)获自Cambrex，在内皮生长培养基（EGM-2MV，目录号3202) 中按照生产商的推荐进行培养。人间充质干细胞（MSCs，目录号PT-2501)也购自Cambrex， 在间充质干细胞生长培养基（MSCGM，目录号PT-3001)中按照生产商的推荐进行保持。人真 皮成纤维细胞（CXD9)获自ATCC，在含有10% FBS和lU/ml青霉素-链霉素的DMEM/F12培 养基中进行保持。
[0160] 对于常规传代，将细胞用磷酸缓冲盐水（PBS，Invitrogen，目录号14190)洗涤一 次，并通过胰蛋白酶消化（〇? 25%trypsin-EDTA，Invitrogen，目录号25200-056)进行脱附 (detach)。将细胞用GUAVAM义器(GuavaTechnologies，Hayward，CA)进行计数，并以 5000个细胞/cm2的密度接种。细胞常规地每3-4天传代一次。 生长因子和抗体
[0161] 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，目录号100-18B)和重组人肝细胞生长因 子（HGF，目录号100-39)获自P印rotech，重组人血管内皮生长因子（VEGF，目录号293-VE) 获自R&DSystems。抗bFGF抗体（目录号abll937)、抗HGF抗体（目录号abl0678)和抗 VEGF抗体（目录号ab957〇)购自Abeam(Cambridge，MA) 〇 细胞裂解物的制备
[0162] 细胞裂解物是从得自之前的生长物（grow-ups)的冷冻hUTC批次120304细胞沉 淀制备。简单的说，将hUTC批次120304培养4天，通过胰蛋白酶消化进行收获，离心沉淀。 然后用PBS洗涤细胞3次，以lx107个细胞/ml重悬于PBS中。将lml悬浮液等分试样放 入1. 5ml无菌硅化微量离心管中，在300rcf下离心5分钟。抽吸出PBS，将细胞沉淀保藏 在-80 °C备用。
[0163] 为制备细胞裂解物，将装着细胞沉淀的管子浸入液氮（LN2)中保持60秒钟，然后 立即浸入37°C水浴中保持60秒钟，或者直到解冻，但不超过3分钟。这个步骤重复3次。 在这个步骤后，将冷冻-解冻的样品在13000rcf下4°C离心10分钟，然后放在冰上。小心 移取上清液，转移到没用过的无菌硅化1. 5ml管中。重复离心步骤3次，将所得的上清液集 中。用QUICKSTART imBradford蛋白质测定试剂盒（Bio-rad，目录号500-0201)的微测定 方案测定蛋白质浓度。为研究细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用， 细胞增殖的测量
[0164] 收获细胞，以5000个细胞/cm2的浓度直接接种到指定的培养基配方中。对于共培 养实验，使用24孔转孔（Corning目录号3413)，其中内皮细胞接种在孔的底部上（10, 000 个细胞/孔），hUTCs、MSCs或成纤维细胞接种在转孔嵌块的内部（1650个细胞/转孔嵌块）。 在指定的时间段，移取含hUTCs、MSCs或成纤维细胞的嵌块并弃去。通过加入90y1胰蛋白 酶到每个孔中，收获内皮细胞。通过用移液管将细胞吸上吸下然后转移到清洁的96孔板， 使细胞得以释放。通过加入90y1培养基抑制胰蛋白酶。加入20y1染色溶液（18y1培 养基+1y1GUAVA观COUNT丨,Flex试剂+1y1DMS0)将细胞染色，并用GU/W#.仪器 (GuavaTechnologies，Hayward，CA)进行定量。
[0165] 对于有关hUTC批次120304细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用的研究，将HUVECs 以EGM-2MV培养基中10, 000个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养皿上，保持8小时。然 后将细胞在〇. 5ml含0. 5%FBS和不含生长因子的EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥 饿处理。之后，加入FBS、新制备的含62. 5yg和125yg蛋白的hUTC批次120304细胞裂解 物和抗FGF(7yg/ml)或HGF(lyg/ml)的中和抗体。培养4天后，收获细胞，用 仪器计数。
[0166] 对于关于hUTC介导的内皮细胞增殖增加的潜在机制的研究，将抗FGF(7yg/ml)、 HGF(1yg/ml)和VEGF(1yg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTCs的共培养 中。抗体在细胞开始接种时加到细胞培养基中。共培养7天后，收获细胞，用GUAVA思仪 器计数。 细胞迀移的评估
[0167] 为测量细胞迀移，使用6孔转孔（Corning目录号3428)装置（set-up)。将细胞以 5000个细胞/cm2的密度直接接种到指定的培养基配方中。内皮细胞接种在转孔嵌块内部 (23, 000个细胞/转孔嵌块），hUTC批次120304或MSCs接种到孔的底部（48, 000个细胞 /孔）。在共培养7天后通过计数转孔的底面上的细胞数量评估迀移情况。简单的说，将转 孔转移到清洁的孔中，用PBS洗涤一次。向孔底部加入胰蛋白酶，来收集孔底面的细胞。加 入完全生长培养基将胰蛋白酶抑制，离心收集细胞。然后将细胞重悬在25y1培养基中，其 中取20y1用GUAVA'X仪器获得细胞计数〇
[0168] 对于关于hUTC介导的内皮细胞迀移增加的潜在机制的研究，将抗FGF(7yg/ml) 和HGF(1yg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTC批次120304的共培养中。 抗体在细胞开始接种时加到细胞培养基中。共培养7天后，收获转孔嵌块底面上的细胞，用 GUAVA'X仪器计数。 结果 hUTCs对内皮细胞增殖的作用
[0169] 利用共培养系统研究hUTCs对内皮细胞增殖的作用。这是用转孔装置（set-up) 来进行，其中内皮细胞接种在24孔组织培养皿的底部上，hUTCs接种在转孔嵌块的内部。在 这些实验中，使用了两种不同的培养基配方（培养基组成在材料和方法中详述）：Hayfilck 80%+EGM-2MV20% (H80)或Hayflick50%+EGM-2MV50% (H50)。共培养 6 天或 7 天后， 移取转孔嵌块，通过胰蛋白酶消化收获内皮细胞，用GIMW仪器计数。
[0170] 图1比较了 hUTC批次120304对在H80上培养的和在H50上培养的内皮细胞的增 殖的作用。保持在H50中的HUVECs的增殖高于保持在H80中的HUVECs (图1A)，而HCAECs 和HIAECs在这些共培养培养基配方中显示相似的生长（图1B和图1C)。在两种培养基配 方中，内皮细胞与hUTC批次120304的共培养导致7天后细胞数量显著增加。所有后面的 对hUTCs和内皮细胞的共培养研究都在Hayflick 50%+EGM-2MV 50% (H50)培养基配方 中进行。
[0171] 还将MSCs和成纤维细胞与内皮细胞共培养进行测试，以确定其他细胞类型是否 具有影响内皮细胞的增殖的能力。如图1A所示，共培养培养基（H50或H80)中的HUVECs和 与MSCs或与成纤维细胞共培养的HUVECs在增殖上没有差异。HCAECs(图1B)和HIAECs(图 1C)也同样，其中与hUTC批次120304的共培养导致细胞增殖增加，而在共培养培养基（H50 或H80)中的细胞和与MSCs共培养的细胞之间没能观察到差异。
[0172] 为研究hUTC介导的内皮细胞增殖增加的潜在机制，将抗FGF(7yg/ml)、 HGF(1yg/ml)和VEGF(1yg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTCs的共培养 中。图2A和2B的结果显示，在HUVECs和HCAECs中，抗FGF和HGF的中和性抗体的加入减 少了hUTC批次120304诱导的细胞数量的增加。在用于这些研究的浓度下，这些中和性抗 体阻断了生长因子诱导的HUVECs的增殖（图2A)。值得指出的是，抗VEGF的中和性抗体对 HUVECs(图2A)和HCAECs(图2B)与hUTC批次120304的共培养所诱导的细胞增殖没有显 著的作用。在另外的研究中，hUTC批次120304的增殖不因抗FGF和VEGF的中和性抗体加 入到培养基中而受到影响（数据未显示）。 hUTC批次120304细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用 [0173] 还进行了研究，以确定细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用。将HUVECs以5000个 细胞/cm2的密度接种到24孔板上的EGM-2MV培养基中，保持8小时。然后将细胞在0. 5ml含0. 5%胎牛血清（FBS)和不含生长因子的EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥饿处 理。温育后，加入不同浓度的新鲜制备hUTC批次120304细胞裂解物。在一些情况中，FGF、 HGF和中和性抗体也加入。培养4天后，收获HUVECs，用GU/WA'y_仪器计数。[0174]图3 显示，细胞裂解物的加入导致HUVECs细胞数量与保持在低血清（0.5%FBS)中的细胞相比 有增加，且细胞数量的增加与所加入的细胞裂解物的量成比例。较低浓度的所用细胞裂解 物（62. 5yg/ml)其导致的细胞数量可与在最佳培养基条件（10%FBS)下温育的细胞相比。 此外，抗FGF或HGF的中和性抗体的加入缓和了由该两种不同浓度的细胞裂解物诱导的细 胞数量的增加。这些结果和在HUVECs与hUTC批次120304的共培养中获得的结果相一致。 hUTCs对内皮细胞迀移的作用
[0175] 内皮细胞的迀移是通过测定已移动穿过转孔膜（孔径=8微米）的细胞的数量进 行评估。将应答细胞即内皮细胞接种到6孔转孔嵌块上，hUTCs接种在孔的底部上。一段 时间的共培养后，将转孔底面上的细胞收集并计数。图4A显示与hUTCs和MSCs共培养的 HUVECs的迀移。hUTC批次120304诱导了HUVECs向转孔的底面的移动，而MSCs却没有（图 4A)。在HCAECs上观察到相同的结果，其中与hUTC批次120304的共培养导致相对于培养 基对照有更多的细胞迀移穿过转孔（图4B)。
[0176] 采用抗FGF和HGF的中和性抗体，进一步测试hUTC批次120304对HUVECs和 HCAECs的迀移行为的作用。如图5A所示，这些抗体减少了hUTC批次120304诱导的HUVECs 迀移。在HCAECs与hUTC批次120304的共培养中，抗HGF的中和性抗体阻断了hUTC批次 120304介导的细胞迀移增加，而抗FGF的中和性抗体却没有阻断（图5B)。 总结
[0177] 这里概述的结果说明了hUTCs对内皮细胞体外增殖和迀移行为的作用。研究是用 hUTC批次120304和内皮细胞的共培养或者内皮细胞与从hUTC批次120304制备的细胞裂 解物的直接温育进行的。
[0178] 对于增殖的研究，测试了hUTC批次120304的作用，来自不同血管床的三种内皮细 胞类型周作应答细胞。与hUTCs的共培养导致内皮细胞增殖得到增强。与MSCs或成纤维细 胞的共培养所导致的细胞数量与培养基对照相当。HUVECs对hUTC批次120304的增殖应答 因抗FGF和HGF的抗体的加入而受到抑制，但不受抗VEGF的抗体的抑制。这暗示hUTC批次 120304对增殖的诱导是由FGF和HGF介导的。值得指出的是，HUVECs与hUTC批次120304 裂解物的温育反映了在共培养物上所观察到的作用。
[0179] 迀移是通过计数在转孔的底面上的细胞的数量进行定量的，HUVECs和HCAECs都 用作应答细胞。与增殖研究不同的是，这些细胞的迀移应答稍有不同。HUTC批次120304诱 导了HUVECs和HCAECs的迀移。MSCs不诱导HUVECs的迀移，这提示了这一对hUTCs的应答 的特异性。抗FGF和HGF抗体取消了hUTC批次120304对HUVECs的迀移的作用，而只有抗 HGF抗体影响了HCAECs的迀移，这提示了两种内皮细胞类型之间的差异。
[0180] 总之，这些数据表明hUTCs能诱导内皮细胞体外增殖和迀移。中和性抗体的使用 暗示FGF和HGF牵涉到这些观察到的作用。但是，其他因素也可能涉及到内皮细胞的增殖 和迀移行为。
[0181] 本发明并不限于以上描述和例示的实施方案。在所附权利要求的范围内能够作出 变化和修改。
【主权项】
1. 脐带组织衍生的细胞在制备用于治疗外周局部缺血的药物中的用途，其中所述脐带 组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具 有分化的潜力，产生⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和HLA-A，B，C，不产生⑶31、 CD34、CD45、CD117、CD141 或 HLA-DRPQ。2. 脐带组织衍生的细胞在制备用于外周局部缺血患者改善血流和减少组织坏死的药 物中的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在 培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-a和 HLA-A，B，C，不产生 CD31、CD34、CD45、CD117、CD141 或 HLA-DRPQ。3. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞在体外被诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周 细胞或血管内皮谱系细胞。4. 权利要求1至3中任一项的用途，其中所述细胞进行遗传工程改造以产生能促进外 周血管疾病的治疗的基因产物。5. 权利要求1至4中任一项的用途，其中所述用途还包括至少一种其他细胞类型，所述 其他细胞类型选自骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细 胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞。6. 权利要求5的用途，其中所述至少一种其他细胞类型在给予脐带组织衍生的细胞的 同时或之前或之后给予。7. 权利要求1至6中任一项的用途，其中所述用途还包括至少一种其他药物，所述药物 选自抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促生血管剂或抗细胞凋亡剂。8. 权利要求7的用途，其中所述药物在给予脐带组织衍生的细胞的同时或之前或之后 给予。9. 权利要求1或2的用途，其中所述用途包括在外周局部缺血的部位给予细胞。10. 权利要求1或2的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞通过注射、输注、植入患者体 内的装置或者通过植入含有所述细胞的基质或支架来给予。11. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的骨骼肌施加营养作用。12. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的血管平滑肌施加营养作用。13. 权利要求12的用途，其中所述营养作用是血管平滑肌细胞的增殖。14. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的血管内皮施加营养作用。15. 权利要求14的用途，其中所述营养作用是血管内皮细胞的增殖。16. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管内皮细胞迀移到外周局部缺血的部 位。17. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管内皮祖细胞迀移到外周局部缺血的 部位。18. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管平滑肌细胞迀移到外周局部缺血的 部位。19. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管平滑肌祖细胞迀移到外周局部缺血 的部位。20. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导周细胞迀移到外周血管疾病的部位。21. -种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗外周局部缺血，所述药物 组合物包含药物可接受的载体和由脐带组织衍生的细胞制成的制品，其中所述脐带组织衍 生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化 的潜力，产生 CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a 和 HLA-A，B，C，不产生 CD31、CD34、 ⑶45、⑶117、⑶141或HLA-DRPQ，其中所述制品包含脐带组织衍生的细胞的细胞裂解物、脐 带组织衍生的细胞的胞外基质或其中生长了脐带组织衍生的细胞的条件培养基。22. -种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于外周局部缺血患者改善血流 和减少组织坏死，所述药物组合物包含药物可接受的载体和由脐带组织衍生的细胞制成的 制品，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中 自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- a和HLA-A， B，C，不产生⑶31、⑶34、⑶45、⑶117、⑶141或HLA-DRPQ，其中所述制品包含脐带组织衍生 的细胞的细胞裂解物、脐带组织衍生的细胞的胞外基质或其中生长了脐带组织衍生的细胞 的条件培养基。23. 权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品对血管内皮 施加营养作用。24. 权利要求23的用途，其中所述营养作用是血管内皮细胞的增殖。25. 权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管内 皮细胞迀移到外周局部缺血的部位。26. 权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管内 皮祖细胞迀移到外周局部缺血的部位。27. 权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管平 滑肌细胞迀移到外周局部缺血的部位。28. 权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管平 滑肌祖细胞迀移到外周局部缺血的部位。29. 权利要求21至28的用途，其中所述组合物包含FGF和HGF。30. 脐带组织衍生的细胞在制备用于外周局部缺血患者减少组织坏死的药物中的用 途，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自 我更新和扩展，具有分化的潜力，产生⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- a和HLA-A，B， C，不产生 CD31、CD34、CD45、CD117、CD141 或 HLA-DRPQ。
【专利摘要】本发明涉及使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病。本发明公开了这样的组合物和方法，它们使用衍自产后组织如脐带和胎盘的细胞，以刺激和支持外周血管疾病患者的血管发生，改善其血流，再生、修复和改善其被外周局部缺血事件损害的骨骼肌，并保护其骨骼肌免受局部缺血损害。PTA-606720040610
【IPC分类】A61P9/10, A61K35/51, A61K9/00, A61K45/00
【公开号】CN105106239
【申请号】CN201510245864
【发明人】A.J.金
【申请人】伊西康公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2006年12月28日