11)在2004年6月15日保藏，分配检索号 PTA-6075 ;(3)品系标号PLA071003(P16)在2004年6月16日保藏，分配检索号PTA-6079。 衍自脐带组织的PPDCs的实例在2004年6月10日保藏在美国模式培养物保藏所，分配 ATCC检索号如下：（1)品系标号UMB022803(P7)分配检索号PTA-6067;(2)品系标号UMB 022803 (P17)分配检索号PTA-6068。
[0064] 在各个实施方案中，PH)CS具有以下生长特征中的一个或多个：（1)它们需要L-缬 氨酸用于在培养中生长；(2)它们能够在含有约5%到至少约20%的氧的气氛中生长；（3) 它们具有在达到衰老之前在培养中倍增至少约40次的潜力；和（4)它们能在包被或未包被 的组织培养容器上贴壁和扩展，其中包被的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚 鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被层。
[0065] 在某些实施方案中，procs具有正常的核型，该核型随着细胞的传代得到保持。核 型分析对于鉴定和区别衍自胎盘的新生儿细胞和母体细胞特别有用。核型分析的方法是本 领域技术人员可获得和公知的。
[0066] 在其他实施方案中，PH)Cs可由某些蛋白质的产生来表征，包括：（1)组织因子、 波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白中的至少一个的产生；（2)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、 H)GFr-a、TO-L2和HLA-A，B，C细胞表面标志中的至少一个的产生（通过流式细胞术检 测）。在其他实施方案中，PPDCs可由CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、 B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ细胞表面标志中的至少一个的产生的缺乏（（通过流式细胞 术检测）来表征。特别优选的是能产生组织因子、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白中的至 少两个的细胞。更优选的是蛋白质组织因子、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白这三个都能 产生的细胞。
[0067] 在其他实施方案中，procs可通过基因表达来表征，即相对于成纤维细胞、间充质 干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码以下物质中的至少一个的基因的基因表达提 高：白细胞介素8 ;网硬蛋白1 ;趋化因子（C-X-C模体）配体1 (黑素瘤生长刺激活性，a); 趋化因子（C-X-C模体）配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子（C-X-C模体）配体3 ;肿瘤 坏死因子，a诱导蛋白3 ;C型凝集素超家族成员2 ;Wilms肿瘤1 ;醛脱氢酶1家族成员A2 ; 肾素；氧化低密度脂蛋白受体1 ;人类（Homosapiens)克隆IMAGE:4179671 ;蛋白激酶CG; 假拟蛋白DKFZp564F013 ;在卵巢癌1中下调；和来自克隆DKFZp547klll3的人类基因。
[0068] 在又另一个实施方案中，procs可通过基因表达来表征，即相对于成纤维细胞、间 充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码以下物质中的至少一个的基因的基因 表达减少：矮身材同源框2 ;热激27kDa蛋白2 ;趋化因子（C-X-C模体）配体12(基质细 胞衍生因子1);弹性蛋白（主动脉瓣上狭窄、Williams-Beure综合征）；人类mRNA;cDNA DKFZp586M2022 (来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源框2 (生长停滞特异性同源框）； sineoculis同源框同源物1(果蝇）；晶状体蛋白，aB;形态发生2的凌乱缔合激活剂 (disheveledassociatedactivator) ;DKFZP586B2420 蛋白；类似于neuralin1;四连蛋 白（纤溶酶原结合蛋白）；src同源性3 (SH3)和半胱氨酸富集域；胆固醇25-羟化酶；矮子 相关转录因子-3;白细胞介素11受体，a;前胶原C肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果 蝇）；假拟基因BC008967 ;胶原，VIII型，a1 ;生腱蛋白C(结合腕蛋白）；易洛魁族人同 源框蛋白5;hephaestin;整联蛋白，0 8 ;突触小泡糖蛋白2 ;成神经细胞瘤，致瘤性1的抑 制；胰岛素样生长因子结合蛋白2,36kDa;人类cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744; 细胞因子受体样因子1 ;钾中等/小电导率钙激活通道，亚家族N，成员4 ;整联蛋白，07 ; 带PDZ结合模体的转录共激活剂（TAZ);sineoculis同源框同源物2(果蝇）；KIAA1034 蛋白；小泡相关膜蛋白5(肌短蛋白）；含EGF纤蛋白样胞外基质蛋白1 ;早期生长应答3 ; distal-less同源框5;假拟蛋白FLJ20373;醛-酮还原酶家族1，成员C3(3_a羟基类 固醇脱氢酶，II型）；双糖链蛋白聚糖；带PDZ结合模体的转录共激活剂（TAZ);纤连蛋白 1;脑啡肽原；整联蛋白，0样1(带EGF样重复结构域）；人类mRNA全长插入cDNA克隆 EUROIMAGE1968422 ;EphA3 ;KIAA0367蛋白；钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C(心房钠尿肽 受体C);假拟蛋白FLJ14054 ;人类mRNA;cDNADKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222); BCL2/腺病毒EIB19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1 ;细胞色素c氧化酶亚单位Vila 多肽1(肌肉）。
[0069] 在其他实施方案中，PPDCs可由MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、 BDNF、TPO、MIPla、RANTES、andHMP1中的至少一个的分泌来表征。在一些实施方案中， PPDCs可由TGF-0 2、ANG2、PDGFbb、MIPlb、1309、MDC和VEGF中的至少一个的分泌的缺乏 (通过ELISA检测）来表征。
[0070] 在一些优选的实施方案中，PH)Cs衍自基本上没有血液的脐带组织，能够在培养 中自我更新和扩展，需要L-缬氨酸用于生长，能在至少约5%氧中生长，且包含至少以下 特征之一：在培养中倍增至少约40次的潜力；在包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻 连蛋白或纤连蛋白的包被层的包被或未包被的组织培养容器上的贴壁和扩展；波形蛋白和 a-平滑肌肌动蛋白的产生；⑶10、⑶13、⑶44、⑶73和⑶90的产生；和基因表达，即相对于 成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码白细胞介素8和网硬蛋 白1的基因的基因表达提高。在一些实施方案中，这种PPDCs不产生⑶45和⑶117。本段 落中描述的PPDCs可在用来治疗患有外周血管疾病的患者的方法中使用，可在用来治疗外 周血管疾病的药物组合物中使用，例如其中这种组合物包含具有这些特征的细胞和药物可 接受载体，和可在用来制备、使用和实施本文所述的和例证的这种方法和药物组合物的药 盒中使用。另外，本段落中描述的PPDCs可用来产生条件细胞培养基，或者用来制备诸如细 胞提取物和亚细胞级份的制品，该制品可用来制备、使用和实施本文所述的和例证的这种 方法和药物组合物。
[0071] 在优选的实施方案中，细胞包含以上所列的生长、蛋白质/表面标志产生、基因表 达或物质分泌特性中的两个或多个。更优选的是包含三个、四个、五个或更多个特性的细 胞。还更优选的是包含六个、七个、八个或更多个特性的PPDCs。目前还更优选的是包含所 有上述特征的细胞。
[0072] 在目前优选在本发明的几个方面中使用的细胞当中，有具有上述特征的产后细 胞，更具体的说是这些特征：其中细胞具有正常的核型和能随传代保持正常核型，此外其中 细胞能表达标志CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-a和HLA-A，B，C中的每一个，其中 细胞能产生对应于所列标志的免疫学上可检测的蛋白质。还更优选的是这样的细胞，它们 除了前述情况外，不会产生对应于标志⑶31、⑶34、⑶45、⑶117、⑶141或HLA-DR，DP，DQ中 的任何一个的蛋白质（通过流式细胞术检测）。
[0073] 某些具有沿着谱系分化而导致产生各种表现型的潜力的细胞是不稳定的，因此会 自发分化。目前优选用于本发明的是不会例如沿着成肌细胞、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞、 成血管细胞系、生血管细胞系（angiogeniclines)、生血管细胞系（vasculogeniclines) 或血管内皮细胞系自发分化的细胞。优选的细胞当在生长培养基中生长时，就其表面上产 生的细胞标志而言和就各种基因的表达模式而言基本上是稳定的，这些例如是使用以商标 GENECHIP(Affymetrix，Inc.，SantaClara，CA)出售的医疗诊断试验进行测定的。经过多 次群体倍增，细胞例如在传代过程中其表面标志特性方面仍保持基本恒定。
[0074] 本发明的另一个方面描述了上述的PPDCs群体的用途。在一些实施方案中，细胞 群体是异质的（heterogeneous)。本发明的异质细胞群体可包含至少约5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的本发明PPDCs。本发明的异质细胞群体还 可包含干细胞或其他祖细胞，如成肌细胞或其他肌肉祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞， 或者它还可包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞。在一些实施 方案中，群体基本上是同质的（homogeneous)，也就是说基本上只包含PPDCs(优选至少约 96 %、97 %、98 %、99 %或更多的PPDCs)。本发明的同质细胞群体可包含脐带或胎盘衍生的 细胞。脐带衍生细胞的同质群体优选没有母体谱系的细胞。胎盘衍生细胞的同质群体可为 新生儿谱系或母体谱系。细胞群体的同质性可通过任何本领域公知的方法实现，例如通过 细胞分选（例如流式细胞术）或者通过按已知方法进行克隆扩展实现。因此，优选的同质 PPDC群体可包含产后衍生细胞的克隆细胞系。当分离到具有高度适需的功能性的细胞克隆 时，这种群体特别有用。
[0075] 本发明还提供在一种或多种因子存在下或者在能刺激干细胞沿着血管平滑肌、血 管内皮、周细胞或骨骼肌途径分化的条件下温育的细胞群体的用途。这种因子是本领域公 知的，且技术人员会认识到，分化的合适条件的确定可用常规实验来完成。这种条件的优 化可通过统计学实验设计和分析来完成，例如响应表面方法能允许对例如生物培养物中 的多个变量同时进行优化。目前优选的因子包括但不限于生长因子或营养因子、趋化因 子、细胞因子、细胞产物、脱甲基化剂和现在知道或以后确定能刺激例如干细胞沿着生血管 (angiogenic)、成血管（hemangiogenic)、生血管（vasculogenic)、骨豁肌、血管平滑肌、周 细胞或血管内皮途径或谱系的分化的其他刺激剂。
[0076] PH)Cs还可进行遗传修饰，以产生治疗上有用的基因产物，产生能促进或支持另 外的血管形成或生长的生血管剂，或者产生能将内皮祖细胞募集到局部缺血损害区域的因 子。内皮祖细胞能促进血管生成（vasculogenesis)和血液流动，特别是在局部缺血事件之 后（UrbichCandDimmelerS(2004)Circ.Res. 95:343-53)。在内皮细胞募集中起到作用 的因子包括但不限于VEGF、基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)、促红细胞生成素（EP0)、G-CSF、 抑制素、strogen、PPARy、CXCR4、FGF和HGF。遗传修饰可使用多种载体中的任何一种来实 现，所述载体包括但不限于整合病毒载体，例如反转录病毒载体或腺伴随病毒载体；非整合 复制性载体，例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或者复制缺陷病毒载体。其 他将DNA引入到细胞中的方法包括使用脂质体、电穿孔、颗粒枪或通过直接DNA注射。
[0077] 宿主细胞优选用这样的DNA转化或转染，该DNA受控于或有效缔合着一种或多种 适当的表达控制元件如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等以及可选择 标志。任何启动子都可用来驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV 启动子/增强子、SV40、乳头瘤病毒、Epstein-Barr病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些 实施方案中，用来控制目的基因的表达的控制元件能使基因得以进行受调节表达，使得产 物只有当在体内需要时才被合成。如果需要瞬时表达，优选将组成型启动子用于非整合和/ 或复制缺陷载体中。或者，可使用可诱导型启动子来在需要时驱动插入的基因的表达。可 诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热激蛋白有关的启动子。
[0078] 在引入了外来DNA后，可让工程改造过的细胞在富集培养基中生长，然后转到选 择性培养基。外来DNA中的选择性标志赋予对选择的抗性，能让细胞将例如在质粒上的外 来DNA稳定整合到它们的染色体中并生长形成灶（foci)，而后者可进行克隆和扩展成细胞 系。这个方法可有利地用来对能表达基因产物的细胞系进行工程改造。
[0079] 本发明的细胞可进行遗传工程改造以"敲除（knockout) "或"敲减（knockdown) " 能促进在植入部位的炎症或排斥的因子的表达。以下论述用以降低靶基因表达水平或靶基 因产物活性水平的负调节技术。本文所用的"负调节"是指相对于在调节处理不存在下的靶 基因产物的水平和/或活性而言，靶基因产物的水平和/或活性的下降。骨骼肌细胞、血管 平滑肌细胞、周细胞、血管内皮细胞或它们的祖细胞固有的基因的表达，可用多种技术进行 降低或敲除，包括例如通过用同源重组技术使基因失活来抑制表达。通常，编码蛋白质的重 要区域的外显子（或该区域的上游的外显子）被阳性选择性标志例如neo所间断，从而防 止正常mRNA从靶基因的产生，导致该基因的失活。基因还可通过在基因的一部分中产生缺 失或者通过缺失整个基因来失活。通过使用具有与靶基因有同源性的、在基因组中离得很 远的两个区域的构建物，可使间插该两个区域的序列缺失（Mombaertsetal.，1991，Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A. 88 :3084-3087)。反义序列、DNA酶、核酶、小干扰RNA(siRNA)和其他 这种能抑制靶基因的表达的分子也可用来降低靶基因活性的水平。例如，已证实能抑制主 要组织相容性基因复合物（HLA)的表达的反义RNA分子在免疫应答方面是最为通用的。还 另外，可利用三螺旋分子来降低靶基因活性的水平。这些技术由L.G.Davisetal. (eds)， 1994，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY，2nded.，Appleton&Lange，Norwalk，CN详细 描述。
[0080] 在其他方面，本发明利用到从PPDCs制备的细胞裂解物和细胞可溶性级份，或者 包含PPDCs的异质或同质细胞群体，以及已进行遗传修饰或已进行刺激以沿着骨骼肌、血 管平滑肌、周细胞或血管内皮途径分化的PPDCs或其群体。这种裂解物及其级份具有许多 用途。PPDC裂解物可溶性级份（即基本上没有膜）在体内的使用，例如能让有益的胞内环 境以同种异基因方式（allogeneically)在患者中得到使用，而不会引入明显数量的很可 能会引发排斥或其他不利免疫应答的细胞表面蛋白。裂解细胞的方法是本领域公知的，包 括各种方式的机械破坏、酶破坏或化学破坏或它们的组合。这种细胞裂解物可从直接在其 生长培养基中的细胞制备，因此含有分泌的生长因子等，或者可从在例如PBS或其他溶液 中洗涤而没有了培养基的细胞制备。洗涤过的细胞可以大于原始群体密度的浓度进行再悬 浮，如果这优选的话。
[0081] 在一个实施方案中，例如通过破坏细胞而又不随后将细胞级份分离来制备完全细 胞裂解物。在另一个实施方案中，通过本领域公知的常规方法例如离心、过滤或类似的方 法，使细胞膜级份与细胞的可溶性级份相分离。
[0082] 从产后衍生细胞的群体制备的细胞裂解物或细胞可溶性级份，可以原样使用，可 通过例如超滤或冻干进行进一步浓缩，乃至可进行干燥，可进行部分纯化，可与本领域公知 的药物可接受载体或稀释剂进行组合，或者与其他化合物如生物制剂例如药物上有用的蛋 白质组合物进行组合。细胞裂解物或其级份可在体外或体内使用，可单独使用或例如与自 体同源或同基因的活细胞一起使用。裂解物如果是在体内引入，可在治疗部位局部引入或 者在远端引入，以给患者提供例如所需的细胞生长因子。
[0083] 在又一个实施方案中，可在体外培养PPDCs以高产率生产生物产物。能天然产生 特定的目的生物产物（例如营养因子）或已进行过遗传工程改造以产生生物产物的PPDCs， 可用本文所述的培养技术进行克隆扩展。或者，可将细胞在能诱导分化成骨骼肌、血管平滑 肌、周细胞或血管内皮谱系的培养基中扩展。在每种情况中，由细胞产生和分泌到培养基中 的生物产物都可容易地用标准的分离技术从条件培养基分离，所述分离技术例如示差蛋白 沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳和HPLC，此为几个例子。可使用"生物反应器"来 利用流动方法供养例如体外三维培养物。基本上来说，随着新鲜培养基被通过三维培养物， 生物产物被洗出培养物，然后可如上所述从流出物分离。
[0084] 或者，目的生物产物可保留在细胞当中，因此它的收集可能如上所述需要将细胞 裂解。生物产物然后可用任何一种或多种以上所列的技术进行纯化。
[0085] 在其他实施方案中，本发明利用到得自培养的PPDCs的条件培养基进行下文所述 的体外或体内使用。PPDC条件培养基的使用，能让PPDCs分泌的有益营养因子以同种异基 因方式（allogeneically)在患者中得到使用，而不会引入可能会引发排斥或其他不利免 疫应答的完整细胞。条件培养基是通过在培养基中培养细胞后从培养基除去细胞来制备 的。
[0086] 从产后衍生细胞的群体制备的条件培养基，可以原样使用，可通过例如超滤或冻 干进行进一步浓缩，乃至可进行干燥，可进行部分纯化，可与本领域公知的药物可接受载体 或稀释剂进行组合，或者与其他化合物如生物制剂例如药物上有用的蛋白质组合物进行组 合。条件培养基可在体外或体内使用，可单独使用或例如与自体同源或同基因的活细胞一 起使用。条件培养基如果是在体内引入，可在治疗部位局部引入或者在远端引入，以给患者 提供例如所需的细胞生长因子。
[0087] 在另一个实施方案中，将通过在液体、固体或半固体基材上培养PPDCs产生的胞 外基质（ECM)进行制备、收集，并作为对将活细胞植入到需要组织修复或置换的受试者中 的替代进行使用。将PPDCs在本文别处描述的三维骨架（framework)上在能使得所需量的 ECM被分泌到骨架上的条件下进行体外培养。将构成新组织的细胞除去，ECM加工成例如可 注射制品供往后使用。为实现这一点，将骨架上的细胞杀死，从支架除去任何细胞碎片。这 个方法可按多种不同方式进行。例如，可将活组织在没有冷冻保护剂下在液氮中快速冷冻， 或者可将组织浸入无菌蒸馏水中，使得因渗透压破裂。
[0088] -旦细胞已被杀死，可将细胞膜破坏，通过用温和的去污剂清洗处理（如EDTA、 CHAPS或两性离子去污剂）除去细胞碎片。或者，可将组织进行酶促消化和/或用能分解细 胞膜和让细胞内容物得以除去的试剂进行提取。这种酶的实例包括但不限于透明质酸酶、 分散酶、蛋白酶和核酸酶。去污剂的实例包括非离子型去污剂如烷基芳基聚醚醇（TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（RohmandHaas，Philadelphia，PA)、BRIJ-35、聚乙氧基 乙醇月桂醚（AtlasChemicalCo.，SanDiego，CA)、聚山梨醇酯20(TWEEN20)、聚乙氧基乙 醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯（RohmandHaas，Philadelphia，PA)、聚乙稀月桂醚（Rohmand Haas，Philadelphia，PA);和离子型去污剂如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂肪醇、磺酸化 烷烃和在支链或非支链中含有7-22个碳原子的磺酸化烷基芳烃。
[0089]ECM的收集可按多种方式来完成，这至少部分上取决于新组织是否已在生物可降 解或非生物可降解（在金属的情况中）的三维骨架上形成。例如，如果骨架是非生物可降 解的，可通过使骨架经历超声处理、高压水射流、机械刮擦或用去污剂或酶进行的温和处理 或者以上方法的任何组合，来移取ECM。
[0090] 如果骨架是生物可降解的，ECM可例如通过让支架在溶液中降解或溶解来收集。或 者，如果生物可降解的骨架是由自身能随ECM-起进行注射的材料所组成，则骨架和ECM可 进行整体加工以供随后注射用。或者，可通过上述的用以从非生物可降解骨架收集ECM的 方法中的任何一种，从生物可降解骨架移取ECM。所有的收集方法都优选设计成不会使ECM 变性。
[0091]ECM收集后可进行进一步的加工。例如，ECM可用本领域公知的技术如超声处理均 化成微细颗粒，使得它能通过手术针。ECM的各成分如有需要还可通过Y辐射进行交