本发明涉及一种磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因、载体、工程菌，及其在制备抗鸡球虫的药物中的应用。(二)
背景技术：
：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的种类很多，在细菌、原生动物、酵母、霉菌、植物、昆虫和哺乳动物中均存在。在各个领域均有应用：医药领域，主要作为疫苗用于预防各种病原菌的感染；食品领域，多用于面包烘培、奶制品加工、保健食品等；工业领域，主要用于油脂精炼、磷脂改性、动物饲料添加剂等。鸡球虫病发病率高(50～70％)，致死率高(50～80％)，严重危害养殖业，每年因球虫病造成的损失高达数十亿美元。现有鸡球虫病防治，主要依靠化学药物，但存在耐药性、药物残留等不足，若采用接种疫苗方式进行防治，又存在风险较大、且研发困难的不足，而采用抗生素或中草药，也存在耐药性的问题，且效果一般。因此，亟需寻找一种新的抗球虫药物替代化学药物来有效控制鸡球虫病。细菌PI-PLC可裂解细胞膜表面糖基锚定蛋白，从而影响细胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的释放，而球虫等大多数致病性寄生虫细胞膜表面抗原都是通过糖基锚定在细胞上的，PI-PLC能切断锚定蛋白中肌醇磷脂与细胞膜的连接，使寄生虫丧失入侵宿主细胞和在宿主细胞内增殖的能力，因此PI-PLC显示出显著的抗球虫感染特性。PI-PLC的抗球虫机理为新型抗球虫药的开发提供了理论基础。PI-PLC降低了球虫因耐药性加剧而爆发的风险，避免养殖业因球虫病复发而造成的重大损失。PI-PLC广泛分布于动植物以及微生物的体内，本身就参与机体细胞的代谢和信息交流，不存在产生耐药性及药物残留等问题。具有安全、无毒害作用。通过微生物异源表达，可以大量生产PI-PLC，降低抗球虫药的使用成本。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种可通过微生物异源表达的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因、载体、工程菌，及其在制备抗鸡球虫的药物中的应用。本发明采用的技术方案是：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因，其序列如SEQIDNo.1所示。该序列为从NCBI数据库中得到的一段蜡状芽胞杆菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的前提下，优化设计并合成的PI-PLC目的基因，易于在大肠杆菌中稳定表达、且表达量较高。SEQIDNo.1序列如下：5’-ATGTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAATTATTTATCTGCTCCACAATCTTTATTACATTTGTCTTTGCTCTGCATGACAAACGGGTGGTTGCAGCGTCAAGCGTGAACGAACTGGAAAATTGGAGCAAATGGATGCAACCGATTCCTGATTCAATCCCGCTTGCGCGTATTAGCATCCCTGGCACGCATGACTCTGGAACATTTAAATTGCAAAACCCGATCAAACAGGTTTGGGGCATGACACAAGAATACGATTTTCGTTATCAGATGGACCATGGTGCTCGGATTTTTGATATCAGAGGCCGCTTAACGGATGACAATACAATCGTTTTGCATCATGGACCGTTGTACTTGTACGTGACGTTGCATGAATTTATCAACGAAGCGAAACAGTTTTTGAAAGATAACCCTTCAGAAACAATCATCATGAGCTTGAAAAAAGAATACGAAGATATGAAAGGCGCTGAAGACTCTTTTTCTTCCACGTTTGAGAAAAAATACTTTGTCGATCCTATCTTTCTGAAAACAGAAGGAAACATCAAACTTGGAGACGCCAGAGGTAAAATTGTACTGCTTAAACGCTATTCTGGTTCCAACGAACCGGGCGGATACAACAACTTTTACTGGCCTGATAACGAAACGTTTACAACGACAGTGAATCAAAACGCAAATGTTACAGTGCAGGATAAATACAAAGTCTCCTACGACGAAAAAGTAAAAAGCATCAAAGATACGATGGACGAAACAATGAATAACTCTGAAGATCTGAACCATCTTTACATCAACTTTACGTCACTTTCAAGCGGTGGCACAGCTTGGAATTCTCCGTATTACTATGCCTCCTACATCAACCCTGAAATCGCAAACTACATCAAACAGAAAAATCCGGCACGCGTCGGATGGGTAATCCAGGATTATATTAATGAAAAATGGAGCCCGTTACTGTATCAAGAAGTCATCAGAGCAAATAAATCCTTAATCAAAGAATAA-3’。本发明还涉及含有所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因的重组载体。本发明还涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。本发明还涉及所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在制备抗鸡球虫的药物中的应用。具体的，所述的应用为：构建含有所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的上清液。通过对重组大肠杆菌摇瓶条件下培养条件的初步优化，以4％的转接量，37℃，200r/min条件下，培养重组大肠杆菌OD600＝0.4时，添加诱导物IPTG，工作浓度为1mM，进行诱导表达，于37℃，200r/min继续培养6h后，测得培养基破碎上清液中PI-PLC的浓度可达到10mg/L以上。本发明的有益效果主要体现在：本发明优化设计并合成PI-PLC目的基因，成功实现了PI-PLC基因在大肠杆菌中的异源高表达，且重组蛋白显示磷脂酶活性较高，表达的PI-PLC用于抗鸡球虫动物实验，抗球虫效果良好。(四)附图说明图1为目的基因扩增结果；M：DNAMaker；1：PCR扩增产物1；2：PCR扩增产物2；图2为质粒pET28a(+)结构图谱；图3为重组质粒pET28a(+)-PIPLC的构建过程；图4为重组大肠杆菌中的单菌落；图5为重组大肠杆菌的菌落PCR结果图；图6为重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定结果；M：标准蛋白Maker；1：pET28a(+)/BL21对照菌破碎上清；2：诱导后的pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清；图7为PI-PLC酶活性验证结果(PI显色平板)；1：重组菌pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清；2：重组菌pET28a(+)/BL21破碎上清(CK)；图8为酶联反应分析测定酶含量结果图；图9为不同实验组小鸡体重变化比较；图10为每克粪便虫球虫数(22天OPG计数)比较；图11为不同实验组抗球虫指数ACI对比。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：1、目的基因的优化与合成从NCBI数据库中得到的一段蜡状芽胞杆菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的前提下，优化设计并合成的PI-PLC目的基因(SEQIDNo.1)，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。2、目的基因片段的获得与鉴定具体步骤：根据合成的已知序列，进行引物设计。正向引物P1：5’-CCCGGTCTCCCATGGGCTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAA-3’，反向引物P2：5’-CCCGGTCTCGAATTCTTATTCTTTGATTAAGGATT-3’，下划线代表含有BsaI酶切位点。以合成基因PI-PLC为模板，以p1/p2为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，2×superHIFI-MIXⅡ25μL，灭菌的双蒸水20μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。经过内切酶BsaI酶切后产生NcoI酶切位点和EcoRI酶切位点的粘性末端，对PCR产物进行回收，获得目的基因。目的基因扩增结果参见图1，质粒pET28a(+)结构图谱参见图2。3、重组质粒pET28a(+)-PIPLC的构建具体步骤：经PCR回收含有目的基因用BsaI酶切，与EcoRI和NcoII酶切的pET28a进行连接转化到克隆宿主菌，随后再选PIPLC引物进行扩增，挑出阳性克隆进行测序，正确的重组质粒命名为pET28a(+)-PIPLC，将获得的重组大肠杆菌命名为Trans1-T1-PIPLC/Trans1-T1，并进行甘油管保藏。重组质粒pET28a(+)-PIPLC的构建过程参见图3。4、重组质粒pET28a(+)-PIPLC在大肠杆菌中的克隆具体步骤：提取正确的重组质粒pET28a(+)-PIPLC，通过化学普转的方法转到表达宿主菌BL21(DE3)，挑取转化子用P1、P2引物进行菌落PCR，挑取扩增出目的大小片段的转化子接种于LB(含有卡那霉素50μg/mL)液体培养基扩大培养，37℃培养过夜。将获得的重组菌命名为pET28a-PIPLC/BL21(DE3)，并将其进行甘油管保藏。重组大肠杆菌中的单菌落图参见图4，重组大肠杆菌的菌落PCR结果图参见图5。5、SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白具体步骤：挑取阳性重组菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)单菌落接种于5mlLB(含有卡那霉素1μg/mL)液体培养基，37℃过夜培养20h后，按1:50的比例进行扩大培养至OD值＝0.3-0.6加入终浓度0.75mM的诱导剂IPTG进行4个小时诱导。收集菌体，加入1/20体积的细胞缓冲液NTA-0Buffer(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol)取50ul的菌液加入加样缓冲液混合后煮沸10min，冷却后，取20μL进行SDS-PAGE(12％分离胶，5％浓缩胶)电泳分析，以蛋白质标准分子量为参考，并以同样方法处理不加诱导物的pET28a-PIPLC/BL21(DE3)菌作为对照。电泳结果参见图6，由图可见，在诱导后的重组菌pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清中出现了大小约为35kDa的片段，与PI-PLC大小一致。6、PI-PLC酶活性验证具体步骤：取10μL培养12小时的重组菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)的菌液于PI-李斯特氏菌显色平板，并以同样方法处理pET28a/BL21(DE3)空白菌作为对照，37℃温育12h。结果：重组菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)点板处出现透明圈，而对照没有透明圈。结果如图参见图7，显示重组菌pET28a(+)-PIPLC/BL21具有磷脂酶活性。7、酶联反应定量测定菌液中PI-PLC的含量具体步骤：①待测样品的处理：将诱导表达后的重组大肠杆菌菌液，置于冰上超声波破碎至澄清8000r/min离心10min，收集上清；②标准品的稀释：试剂盒提供原倍PI-PLC标准品一支，按照下列图表在1.5mL离心管中进行稀释。③加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。④温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。⑤配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。⑥洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。⑦加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。⑧温育：操作同3。⑨洗涤：操作同5。⑩显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。结果参见图8，显示按上述方法诱导大肠杆菌表达PI-PLC，最终测得诱导后培养液(上清液)中PI-PLC的浓度为10mg/L。实施例2：为了研究细菌PI-PLC对雏鸡抗球虫及促进增重效果的影响，选择致病性最强的柔嫩艾美耳球虫对正常雏鸡进行感染，并对分组雏鸡进行不同的给药处理，通过观察记录雏鸡临床病理学变化、存活率，体重变化、盲肠病变情况、卵囊值，从而计算出PI-PLC的抗球虫指数。一、实验分组检测指标：(1)小鸡体重(2)盲肠病变计分(3)卵囊值(4)抗球虫指数(ACI)二、实验结果1、病理学观察正常小鸡感染球虫4天后，精神萎靡、食欲下降、羽毛蓬松，部分小鸡离群呆立或卧伏不动，出现血便(参见图9)；正常小鸡感染球虫第5天，严重者死亡，解剖，盲肠充血肿大，属典型球虫致死。2、体重变化各实验组体重变化数据参见图9。由图可见：阴性对照组生长最慢，且有一只雏鸡死亡，说明球虫病严重影响鸡的正常生长发育，严重者可导致死亡；地克珠利组体重最高，22日平均体重比不攻击球虫的空白对照组还高，相对增重率达到102.32％，这也很好的解释了目前地克珠利作为抗球虫药被广泛的用在养殖业中的原因；PI-PLC实验组对小鸡的相对增重率高于阴性对照组和PI-PLC对照组，说明PI-PLC对感染了球虫的雏鸡的增重有一定的效果。3、盲肠病变计分各实验组盲肠病变计分数据见下表：分组盲肠病变计分病变值空白对照组0.00阴性对照组3.2532.5地克珠利组1.515PI-PLC实验组1.7517.5PI-PLC对照组2.8528.5注：盲肠病变计分分0,1,2,3,4五个等级，分数越高，盲肠病变越严重。由表可知：地克珠利组和PI-PLC实验组雏鸡的盲肠病变计分明显低于阴性对照组和PI-PLC对照组，说明这两组对抗球虫有显著效果。4、每克粪便虫球虫数(OPG计数)各实验组每克粪便虫球虫数结果参见图10，由图可知：PI-PLC组卵囊比数虽然比地克珠利组高出很多，但是依然明显的低于两个对照组，说明PI-PLC和地克珠利一样对球虫生长繁殖有明显的抑制作用。5、抗球虫(ACI)指数各实验组抗球虫(ACI)指数数据结果参见图11。抗球虫指数ACI＝(小鸡成活率+相对增重率)×100－(卵囊值+病变值)。ACI指数显示：地克珠利组的抗球虫指数最高，达到180以上，可以有效的促进雏鸡增重，且抑制雏鸡盲肠中球虫的生长，抗球虫效果属于优秀水平；PI-PLC组ACI指数虽低于地克珠利组，但是明显高于阴性对照组和PI-PLC对照组，ACI指数接近160，说明PI-PLC有抗球虫效果，且抗球虫效果接近良好。三、结论实验结果表明，细菌PI-PLC抗球虫指数ACI接近160，说明PI-PLC有抗球虫效果，且抗球虫效果接近良好。当前第1页1 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