一种重组赖氨酸特异性酶的制备方法与流程

文档序号:11936704阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组赖氨酸特异性酶,其特征在于,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的重组赖氨酸特异性酶,其特征在于,其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种重组载体,其特征在于,所述载体为含有序列SEQ ID NO:1的pPIC9k-PIV。

4.一种高效表达重组赖氨酸特异性酶的基因工程菌,其特征在于,所述工程菌为含序列SEQ ID NO:1的毕赤酵母菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌,其特征在于,所述的基因工程菌为GS115/pPIC9k-PIV。

6.一种高效表达重组赖氨酸特异性酶工程菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)获得优化的DNA序列SEQ ID NO:1,在其C端添加6×His标签,并在基因序列5’端和3’端分别添加合适酶切位点与Kex2位点,最终进行全基因合成,获得PIV;

2)将连接有前导肽α因子的PIV插入质粒pPIC9k中,得重组质粒pPIC9k-PIV;

3)将上述所得质粒pPIC9k-PIV进行Sac线性化,并电转至毕赤酵母GS115菌株中,经培养与酶活检测,筛选得高产菌株GS115/pPIC9k-PIV。

7.一种生产权利要求1所述重组赖氨酸特异性酶的方法,其特征在于,培养如权利要求4~5中任一项所述的基因工程菌,获得重组表达的所述重组赖氨酸特异性酶。

8.一种生产权利要求1所述重组赖氨酸特异性酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:

a)赖氨酸特异性酶高产菌株的筛选:将菌株接种至一级培养基中,在28-30℃培养至OD600为15-20时,转接至二级培养基中,在28-30℃下震荡培养,每8-12h补加甲醇进行诱导表达,发酵12-120h后停止,离心培养液并取上清;

b)发酵生产:将复筛后的菌株接种至发酵培养基中,在28-30℃下培养至溶氧量达70-80%时,以2-4ml/min加入甘油9~12小时,加入含1%~1.2%PTM1的甲醇溶液进行诱导,60-72h后每隔4-12h取发酵液进行酶活检测;

c)将上述培养液经分离、纯化后得到赖氨酸特异性酶蛋白的蛋白冻干粉。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤b)发酵培养基中菌株的接种量为1-5%。

10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤a)中甲醇诱导时的pH值为4.0-8.0;步骤b)中甲醇诱导时培养基的pH值为5.5-6.0。

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