一种鼠李糖苷酶及其在水解黄姜薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，涉及一种鼠李糖苷酶及其在水解黄姜薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用。

背景技术：

薯蓣皂素是黄姜中重要的活性物质，具有雌激素和降胆固醇的作用，可直接入药。研究表明，它有抗菌、消炎、止咳、祛痰、溶血、降血脂、脱敏、修复病变组织、刺激肝素细胞生长及促进胆汁分泌的作用。由于薯蓣皂苷元的骨架结构与甾体激素结构极为相似，结构式如图2所示，可作为合成甾体激素药物和甾体避孕药的主要中间体。因此，大量制备薯蓣皂素具有重要的意义。

黄姜中含有较多的薯蓣皂素，但都是以糖苷的形式存在。薯蓣皂苷的糖基部分由鼠李糖和葡萄糖组成，糖链结构为鼠李糖分别以α-1,4和α-1,2-糖苷键与葡萄糖相连，葡萄糖以β-1,4糖苷键与苷元链接，如图1所示。因此，要想制备薯蓣皂素，关键是开发出α-鼠李糖苷外切酶水解薯蓣皂苷。

制备薯蓣皂素，已有公开的酸水解法、微生物转化法、酶解法或复合酶解法等。传统的方法分解不彻底，转化率不高，产量低，且副产物污染严重。

技术实现要素：

本发明为解决薯蓣皂苷的糖基部分难以水解的技术难题，提供了一种鼠李糖苷酶及其在水解黄姜薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

一种鼠李糖苷酶，所述鼠李糖苷酶为α-L-鼠李糖酶，基因序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述α-L-鼠李糖酶的制备步骤如下：

（1）构建带有α-L-鼠李糖苷酶基因的重组载体；

（2）重组载体的转化及α-L-鼠李糖苷酶的表达；

（3）α-L-鼠李糖苷酶的纯化。

所述步骤（1）中构建的重组载体，采用的引物对如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

所述步骤（3）中α-L-鼠李糖苷酶的纯化采用镍柱纯化。

一种鼠李糖苷酶在水解黄姜薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用，所述α-L-鼠李糖苷酶作为糖苷水解酶催化剂Ⅰ，以黄姜薯蓣皂苷为底物，制备葡萄糖基薯蓣皂苷，再用催化剂Ⅱ水解葡萄糖基薯蓣皂苷，制备薯蓣皂素。

所述催化剂Ⅰ的加入量为0.5-10 U，底物的量为50-200mM，催化剂Ⅱ为β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的加入量为0.5-10 U，反应温度在20-60℃，pH在4-8之间。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明在鼠李糖苷酶的作用下水解薯蓣皂苷糖基末端的鼠李糖，反应1小时，水解率达99%，在β-葡萄糖苷酶作用下水解剩余糖基部分，生成薯蓣皂素，转化率达98%；

（2）本发明开发出能够特异性水解薯蓣皂苷糖基鼠李糖苷的酶，制备出了薯蓣皂素，克服了现有技术所存在的对薯蓣皂苷水解率低，破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、反应时间断、转化率高的优点。

附图说明

图1为黄姜薯蓣皂苷的结构式。

图2为薯蓣皂素的结构式。

图3为TLC检测水解效果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

一、重组大肠杆菌的构建

1、α-L-鼠李糖苷酶基因的获取

活化Streptomyces griseus CICC11002菌种，收集细胞，细胞经液氮冷冻1分钟后再转移到沸水中温浴10分钟，将处理过的细胞裂解液作为PCR的模板。

构建表达载体所用的引物及其酶切位点，引物序列如下：

上游引物如SEQ ID NO：3所示，其中ATGG为Nco I酶切位点；下游引物如SEQ ID NO：4所示，其中GGATCC为BamHI酶切位点。

所有引物均有上海生工公司合成。

基因的PCR条件：94℃变性 5min，按如下参数循环 30 次：94℃变性 1min，60℃退火 50s，72℃延伸2min。最后 72℃延伸 10min。

2、重组质粒的构建及转化

用Nco I 及BamH I分别酶切 pET-28b(+)（pET-28b(+)购于 Novagen( 默克中国 )）及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体 pET-28b与目的基因用 T4 连接酶进行连接过夜，将 10μL 的连接产物 pET-28b-rha加入 100μL 的 Rosetta(DE3) 感受态细胞中，冰上放置 30min，42℃热激90sec。冰上放置 2min。加入预热的 0.45mL 培养基。220rpm37℃ 1h。将 200μL 菌液加入分别含有 100μg/mL 的卡那霉素和氯霉素的 LB 平板上，37℃过夜培养 12 - 16h。

二、重组酶的表达及其性质研究

1、α-L-鼠李糖苷酶的表达

挑取重组菌E.coli/pET-28b-rha至含抗生素的 LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按 2% 接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至 OD 600 约为 0.6时，加入 IPTG 至终浓度 0.5mmolL ^-1，20℃，220rpm，诱导表达 12h 后，离心 (4℃，10000rpm，10min)。

2、α-L-鼠李糖苷酶的纯化

将收集的菌泥用含 300mM NaCl 和 30% 甘油的磷酸缓冲 (50mM，pH7.5) 重悬，超声破碎细胞(功率 300W，超声 5s，间歇 5s，共 5min)，离心(4℃，12000rpm，15min) 取上清。

将收集到的上清酶液添加到 Ni-NTA 柱中，冰上保温 30 分钟。弃去穿透液后，用含60mM 咪唑，300mM NaCl 和 30% 甘油的磷酸缓冲 (50mM，pH7.5) 洗去杂蛋白。再用含 500mM咪唑，300mM NaCl 和 30% 甘油的磷酸缓冲 (50mM，pH7.5) 将目标蛋白Rha洗脱下来。用12% 的 SDS-PAGE 检测酶的纯度，得到电泳纯的Rha。将纯化后的Rha用 Tris-HCl 缓冲（pH7.5）透析（M.W.3000 的透析膜，透析 24 小时）。蛋白浓度采用 Brandford 法进行测定。

结果表明，所得酶液浓度为0.2 mg/L，总体积10 mL。

3、α-L-鼠李糖苷酶酶活测定

酶液100μL加入到pH6.6的0.2mol/LNa₂HPO₄和NaH₂PO₄缓冲液840μL中，混匀后于40℃预热5min，再加入已预热的20mmol/LoNPR溶液60μL，40℃反应10min后立即加入4mL 0.4mol/L Na₂CO₃溶液终止反应，室温放置5min，420nm处测消光值OD。以加热失活的酶液按照同样方法处理作空白对照。

酶活定义：在上述反应条件下，每小时产生1μmol的ONP所需的酶量为1个酶活力单位U。

结果显示，酶液的活力为1.6 mU/mL，比活为7.8 U/mg。

三、水解薯蓣皂苷

把2U的α-L-鼠李糖苷酶添加到100mM薯蓣皂苷溶液里，溶液pH为6.5，40℃,反应2小时，再添加2U的β-葡萄糖苷酶，反应1小时，用薄板层析检测反应情况，结果如图3所示，不同结构的薯蓣皂苷被两种糖苷酶水解，薯蓣皂素大量出现，总的转化率达98%。