一种米曲霉脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的拆分，特别涉及一种米曲霉脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用。

(二)

背景技术：

(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)是合成芳氧苯氧丙酸酯类除草剂(Aryloxy phenoxy propionate，简称APP)的关键手性中间体，APP类除草剂是一类能够有效防除禾本科杂草的除草剂，也是一类发展较迅速、不断开发出新品种的除草剂，迄今为止已有20个品种商品化，其中噁唑禾草灵、炔草酯、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵是近几年来同类除草剂市场全球销售额最高的几个农药产品，由于手性APP类除草剂具有安全，高效和低毒等特性，近几年来该类除草剂越来越受到大家的关注。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(Triacylglycerol acylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦Novo Nordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种立体选择性米曲霉脂肪酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分外消旋体EHPP中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种米曲霉脂肪酶，所述米曲霉脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还提供一种所述米曲霉脂肪酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

该脂肪酶基因由如下方法得到：从米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)中分离纯化得到该脂肪酶，N端测序结果经比对获得相似度最高的同源基因序列，设计引物1(5’-ATGCATCTTGCTATCAAGTCTC-3’)、引物2(5’-TTAGTTCGCAGCCGCAAC-3’)。利用PCR技术，以来源于米曲霉WZ007的基因组DNA为模板克隆脂肪酶基因片段。将该片段连接到pEASY-E1载体上获得克隆载体pEASY-E1-aol并将其转化于大肠杆菌Trans1-T1中。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为765bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述脂肪酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述脂肪酶基因源自米曲霉WZ007(Aspergillus oryzaeWZ007)。该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M 206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申请专利(中国专利CN 101186938)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。关于米曲霉WZ007野生菌细胞拆分制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯的技术，已在中国专利CN 102719512中披露。本发明在此专利基础上，进行目标脂肪酶和基因的挖掘，并在大肠杆菌宿主中高效表达。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及一种所述米曲霉脂肪酶编码基因构建的重组载体，重组载体转化获得的重组基因工程菌。

所述米曲霉脂肪酶编码基因在制备米曲霉脂肪酶中的应用，具体的，所述的应用为：构建含有所述米曲霉脂肪酶编码基因的重组载体pEASY-E1-aol，将所述重组载体转化至大肠杆菌TransB(DE3)中，获得重组大肠杆菌TransB(DE3)/pEASY-E1-aol。重组大肠杆菌经诱导培养，培养液经离心分离得到含有脂肪酶的菌体细胞。菌体细胞在超声波破碎后，离心去除细胞碎片，所得的上清液通过Ni-NTA金属螯合亲和层析分离纯化得到米曲霉脂肪酶。

本发明米曲霉脂肪酶活力测定方法为：1.5mL离心管中加入990μL Tris-HCl缓冲液(pH8.0，50mM)、10μL R,S-2-苯氧丙酸乙酯，混合后再加0.01g酶粉，30℃水浴摇床200rpm转速条件下反应30min，取200μL酶反应液，加入1mL乙酸乙酯萃取，用无水Na₂SO₄除水后，以手性气相色谱检测R,S-2-苯氧丙酸乙酯，并以此计算底物对映体过量值e.e._s、转化率c和酶活力。酶活定义：在50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，30℃条件下，每分钟将1μmol的(S)-2-苯氧丙酸乙酯水成(S)-2-苯氧丙酸所需的酶量。R,S-2-苯氧丙酸乙酯气相色谱检测方法：气相柱：BGB-174手性柱)；载气为N2(70kPa)；进样口温度：220℃；空气流量300mL/min；氢气流量30mL/min；分流比50:1；进样量1μL；柱箱升温程序：初始温度120℃保持2min，5℃/min升温至200℃，保持2min；FID检测其温度：250℃。

此外，本发明还提供一种所述米曲霉脂肪酶在拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯中的应用，具体所述应用为：将含米曲霉脂肪酶基因的重组工程菌发酵培养，获得湿菌体，将湿菌体冷冻干燥获得的冻干菌体为酶源，以外消旋2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯为底物，以pH7-8的缓冲液为反应介质，在25-35℃，100-200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。

进一步，所述酶源用量以冻干菌体重量计为5-20g/L缓冲液(优选10g/L缓冲液)，所述底物终浓度为0.2-0.6mol/L。

进一步，所述缓冲液为200mM、pH8PBS缓冲液。

进一步，所述酶源按如下方法制备：将含米曲霉脂肪酶基因的重组工程菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，在30℃下培养12h，获得种子液；再以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养8～10h，然后在4℃下10000rpm离心10min，收集湿菌体；将湿菌体加入少许Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 8.0)，在-60℃条件下真空冷冻干燥2天，获得冻干菌体。

进一步，所述分离纯化方法为：反应结束后，反应液经10000rpm离心10min除去菌体，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠除水，旋蒸后获得(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)的脂肪酶基因核苷酸序列；该脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组脂肪酶；利用重组大肠杆菌或重组脂肪酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，可以生成(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。结果表明，重组大肠杆菌能高效催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，且反应后产物的光学纯度能达到99％以上。通过脂肪酶基因工程菌的高效表达，大大降低了生物催化剂在(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯拆分反应的应用成本。

(四)附图说明

图1为米曲霉WZ007重组脂肪酶对映选择性水解(R,S)-EHPP及其类似物反应示意图；

图2为PCR扩增脂肪酶基因的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为PCR扩增脂肪酶基因，M为蛋白分子量标准；

图3为米曲霉脂肪酶编码基因重组载体质粒pEASY-E1-aol的构建示意图；

图4为大肠杆菌表达米曲霉WZ007重组脂肪酶的SDS-PAGE图；M为蛋白分子量标准；泳道1为经过IPTG诱导后的重组大肠杆菌；泳道2为未经过IPTG诱导后的重组大肠杆菌；

图5为纯化后重组脂肪酶的SDS-PAGE分析图；M为蛋白分子量标准；泳道1为纯化后重组脂肪酶。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

从原始菌株米曲霉WZ007细胞出发，通过系列大量的分离纯化工作后，获得米曲霉WZ007脂肪酶纯酶，蛋白质质谱分析获得其部分氨基酸序列，在氨基酸序列信息基础上设计PCR引物1和引物2。用核酸提取试剂盒(购自Takara公司)提取米曲霉(Aspergillus oryzaeWZ007)WZ007的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(5’-ATGCATCTTGCTATCAAGTCTC-3’)、引物2(5’-TTAGTTCGCAGCCGCAAC-3’)的作用下进行PCR扩增。

PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL):

10×DNA Polymerase Buffer 10μL，dNTP mixture 1μL，浓度为50μM的引物1和引物2各0.5μL，基因组DNA 1μL，TransTaq DNA聚合酶2μL，无核酸水85μL。

PCR反应条件为：预变性94℃，3min，然后进入温度循环94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。

取6μL PCR反应液用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明为单一条带，扩增片段大小约为750b，如图2所示。用DNA液体快速回收试剂盒(购自Takara公司)纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。将该片段同T载体(pEASY-E1，该载体购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接，得到重组质粒pEASY-E1-aol，构建示意图如图3所示。将该重组质粒化学法转化至大肠杆菌T1感受态中，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图4。由图3可知，在750b左右的位置具有单一条带，表明所挑选的菌株均为阳性重组子。获得的阳性重组子经培养后，提取质粒，送样测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为765bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)。

实施例2:

根据实施例1获得的重组质粒用化学法转化至大肠杆菌Trans B(DE3)(该感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司)中，获得含有胞内表达重组质粒pEASY-E1-aol的重组大肠杆菌Trans B(DE3)/pEASY-E1-aol。该重组大肠杆菌用含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基30℃下培养12h，再以2％接种量(v/v)接种到新鲜的含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.4～0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养8～10h，然后在4℃下10000rpm离心10min，收集含有重组脂肪酶的菌体细胞。加入少许Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 8.0)，在-60℃条件下真空冷冻干燥2天，获得冻干菌体。脂肪酶基因工程菌的冻干菌体的脂肪酶活力(按上述酶活测定方法，R,S-2-苯氧丙酸乙酯水解活性)经过测定为363.1U/g，是野生菌米曲霉WZ007菌体细胞(24.2U/g)的15倍。

本发明米曲霉脂肪酶活力测定方法为：1.5mL离心管中加入990μL Tris-HCl缓冲液(pH8.0，50mM)、10μL R,S-2-苯氧丙酸乙酯，混合后再加0.01g酶粉，30℃水浴摇床200rpm转速条件下反应30min，取200μL酶反应液，加入1mL乙酸乙酯萃取，用无水Na₂SO₄除水后，以手性气相色谱检测R,S-2-苯氧丙酸乙酯，并以此计算底物对映体过量值e.e._s、转化率c和酶活力。酶活定义：在50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，30℃条件下，每分钟将1μmol的(S)-2-苯氧丙酸乙酯水成(S)-2-苯氧丙酸所需的酶量。R,S-2-苯氧丙酸乙酯气相色谱检测方法：气相柱：BGB-174手性柱)；载气为N2(70kPa)；进样口温度：220℃；空气流量300mL/min；氢气流量30mL/min；分流比50:1；进样量1μL；柱箱升温程序：初始温度120℃保持2min，5℃/min升温至200℃，保持2min；FID检测其温度：250℃。

所得的重组基因工程菌经超声波破碎(超声4s，间隔4s，有效超声时间60min)后，离心去除细胞碎片，所得的上清液即为粗酶液。重组蛋白的N端带有6×His-tag纯化标签，利用Ni-NTA柱(HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column)纯化粗酶液。先用10个柱体积平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，接着以1mL/min的速率上样粗酶液，然后用平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，再用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 8.0)洗脱(2mL/min)，收集目标蛋白。酶液在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)中透析过夜，并进行SDS-PAGE分析，结果见图5。

该纯化后的酶液，冻干后获得酶粉的酶活力(按上述酶活测定方法，R,S-2-苯氧丙酸乙酯水解活性)为1560U/g，表明该脂肪酶基因在大肠杆菌Trans B(DE3)中成功实现过量表达。

实施例3：

以实施例2中获得含有重组脂肪酶的大肠杆菌Trans B(DE3)/pEASY-E1-aol冻干菌体为生物催化剂，催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯，从而制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。在5mL反应体系中，取50mg冻干的重组菌体(10g/L)，加入5mL pH8.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，制成菌悬液，加入底物外消旋EHPP(见表1)，在水浴摇床中30℃、250rpm条件下进行水解反应2h。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入5mL乙酸乙酯萃取，有机层取20μL，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析。CHIRALPAK AD-H手性柱(46cm×25cm,Diacel chemical,Japan)。分析条件包括：流动相：色谱级正己烷/异丙醇＝73/7，流速：0.8ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl；检测波长为274nm。结果见表1。

表1结果表明，重组大肠杆菌能高效拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯。在冻干菌体量都为10g/L添加量，反应时间都为2h的情况下，最高0.5mol/L的(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯能反应掉，转化率和e.e.S分别为50.1％和99.2％。而0.6mol/L的(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯在反应2h后转化率降为36.7％。并且整个反应过程中产物光学纯度都在99％以上。

表1：重组酶冻干菌体催化拆分(R,S)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯