磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐盐性中的应用的制作方法

本发明属于植物分子育种和生物技术领域，具体涉及磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐盐性和盐胁迫下作物产量增长中的应用。

背景技术：

随着气候和环境的变化、人口的不断增加，全球的粮食安全问题令人担忧。近年来，干旱的频繁发生、干旱和盐渍化耕地面积的不断扩大，使作物生产的环境胁迫问题日趋严重。土地的盐渍化则是农业生产面临的主要问题之一。全球有1/5的耕地属于盐渍化(Yamaguc hi等，Developing salt-tolerant crop plants:challenges and opportunities.Trends Plant Sci.2005,10:615-620.)，我国有1/3的农田盐分过高导致农作物减产，且干旱的发生、化肥的过度施用导致盐渍化土地面积不断蔓延扩大；气候变暖、海平面上升使更多的沿海耕地被淹没和盐碱化。因此，干旱和盐胁迫成了限制农业生产的主要因素之一。我国人口众多，如何高效合理利用有限的土地和水资源、促进农业可持续发展乃是当务之急。针对当前问题，主要采取两条措施：一是通过工程措施灌溉和土壤改良；二是通过生物技术培育抗旱、耐盐作物新品种。前者耗资大、难以大规模进行，后者是一种经济有效的措施。然而，要解决这一问题，单靠常规育种已遇到了瓶颈，潜力相当有限，我们必须探索植物抗旱耐盐机理，挖掘关键基因，通过基因工程打破常规杂交无法超越的障碍，培育耐盐、抗旱作物新品种。

植物在生长发育过程中，经常遇到干旱、盐害胁迫，并在长期的进化过程中自身逐步建立了一整套包括信号感受、传导、生理生化以及形态发育的机制适应环境，最大限度减少伤害(Vinocur等，Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress achieveme nts and limitation.Curr Opin Biotechnol.2005,16:123-132)。目前，人类对植物盐和干旱胁迫机理进行了大量的研究，发掘了一批耐盐胁迫、抗旱的基因并应用于基因工程改良作物。根据其作用的机理，这些基因归类起来可分为两类：一类是编码效应分子，主要包括：1)渗透保护剂如脯氨酸、甜菜碱等(Yoshiba等，Regulation of levels of proline as an osmol yte in plants under water stress.Plant Cell Physiol.1997,38:1095-10102)；2)维护细胞内离子平衡的蛋白质如Na⁺/H⁺反向转运蛋白(Apse等，Salt tolerance conferred by overexpress ion of a vacuolar Na⁺/H⁺antiport in Arabidopsis.Science.1999,285:1256-1258)；3)抗氧化酶如POD、SOD、CAT(Miller等，Reactive oxygen signaling and abiotic stress.Physiol Plant.2008,133(3):481-9)；4)保护细胞的功能蛋白如LEA蛋白、水通道蛋白等(Chakrabortee等，Hydrophilic protein associated with desiccation tolerance exhibits broad protein stabili zation function.Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104:18073-18078)。另一类是调控因子包括：1)转录因子DREB、CBF、NAC、SKIP等(Liu等，Two transcription factors,DREB1and DREB2,with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively,in Arabidopsis.Plant Cell.1998,10:1391-1406；Denby等，Engineering drought and salinity tolerance in plants:lessons from genome-wide expression profiling in Arabidopsis.Trends Biotechnol.2005,23:547-552；Hou等，A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance.Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106:6410-6415)；2)感受和传导逆境信号的SOS、钙神经元及蛋白激酶等(Kiegerl等，SIMKK,a mitogen-activated protein kinase(MAPK)kinase,is a specific activator of the salt stress-induced MAPK,SIMK.Plant Cell.2000,12:2247-2258；Zhu,Salt and drought stress signal transduction in plants.Annu Rev Plant Biol.2002,53:247-273)。上述基因的发现和鉴定令人鼓舞。然而，盐胁迫和干旱是受多基因控制的数量性状(Denby等，Eng ineering drought and salinity tolerance in plants:lessons from genome-wide expression pro filing in Arabidopsis.Trends Biotechnol.2005,23:547-552；Sahi等，Salt stress response in rice:genetics,molecular biology,and comparative genomics.Funct Integr Genomics.2006,6:263-284)，受多条信号或代谢途径调控，且各条通路存在互作关系，其分子机理相当复杂，抗旱和耐盐育种更具挑战性。因此，我们需分析植物应对逆境胁迫所涉及的信号网络和关键节点，从中找出具有耐盐、抗旱、高产的多效因子。

生物膜富含信号分子，是感知和传导外界信号的起始点，也是细胞与外界进行物质和能量交换的位点及防疫外界侵染和逆境伤害的屏障。磷脂酶PLD催化膜磷脂产生信号分子磷脂酸。本发明涉及植物中一种独特的磷脂酶PLDζ1在植物耐盐性中的正调控作用，其基因超表达可明显提高作物如水稻的耐盐性，为作物耐盐性育种提供了新基因和育种新种质材料。

技术实现要素：

本发明目的在于提供了磷脂酶PLDζ1基因在增强作物耐盐性和盐胁迫条件下生物产量中的应用。通过克隆水稻PLDζ1全长CDS以及在水稻中超表达PLDζ1可明显提高植株的耐盐性，PLDζ1超表达植株在盐胁迫下叶片组织受阻程度明显低于对照野生型，植株细胞活力强于野生型。所述的磷脂酶PLDζ1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。此外，水稻PLDζ1的缺失表达导致植株耐盐性明显低于对照野生型，盐胁迫条件下pldζ1缺失突变体植株生长、存活率、株高和生物产量等方面明显低于对照野生型，进一步表明PLDζ1在植物耐盐性中的正调控作用。

本发明还发现PLDζ1编码一种具有活性的磷脂酶D，催化磷脂酰胆碱产生磷脂酸PA，且PLDζ1活性对植株脂质代谢具有显著影响，其缺失突变导致植株体内磷脂酸含量显著降低，其它脂质含量也发生改变。表明通过分子遗传操作改变PLDζ1的表达量可有效调控膜脂代谢及信号，进而影响植物响应盐胁迫信号。PLDζ1可调控钠离子转运相关基因的表达，调控植株体内钠离子转运及钠/钾离子的稳态平衡，进而增强植株的耐盐性和植株生长。

此外，本发明创建了含不同表达量的PLDζ1植物材料，包括PLDζ1超表达和缺失突变体。特别是超表达植物材料可用于作物遗传改良，是培养耐盐作物的新种质材料，获得的转基因水稻适用于盐碱土壤种植。PLDζ1正调控植株的耐盐性，使其在改良作物耐盐性的应用方面更加切实可行。

本发明的积极效果

1.水稻PLDζ1的缺失导致植株耐盐性明显低于对照野生型，包括植株生长、存活率、株高和生物产量等方面明显低于野生型。

2.超表达PLDζ1可明显提高植株的生长、种子结实率，特别是在盐胁迫下，超表达PLDζ1植株的存活率明显高于对照野生型，盐胁迫下超表达叶片丙二醛含量及质膜透性显著低于对照野生型，其存活率和株高明显高于对照野生型。

3.在盐胁迫条件下，PLDζ1在调控钠离子转运中具有重要作用，PLDζ1的缺失导致植株体内钠离子含量明显高于野生型，表明PLDζ1通过调控钠、钾离子平衡而增强植株的耐盐性。

4.PLDζ1编码有活性的磷脂酶D,可催化磷脂酰胆碱PC产生信号分子磷脂酸PA,其活性不依赖于钙离子，但需要PIP₂作为激活因子，且在pH 7条件下活性最高，其生化特性与动物PLD类似。PLDζ1缺失导致植株体内磷脂酸PA含量明显低于野生型，表明PLDζ1对植株体内脂质代谢具有调控作用。

5.本研究发现PLDζ1的缺失突变导致钠离子转运相关基因如NHX 1、SOS1和SOS3的下调表达，从而使体内钠离子外排受阻，植株体内累积更多的钠离子，并且PLDζ1缺失却导致钠离子内排相关基因HKT1的显著上调表达，从而增强植株从环境中吸收和转运钠离子。这些结果表明PLDζ1与钠离子吸收和转运的调控有关。

6.PLDζ1的活性对细胞膜脂组分产生明显效应，其缺失导致盐胁迫下的细胞膜脂代谢发生显著变化，并且超表达PLDζ1可显著增强植株的耐盐性，这种特性使PLDζ1基因的应用更加行之有效。

附图说明

图1.PLDζ1超表达增强植株耐盐性示意图。

A.PLDζ1超表达植株在盐胁迫下的表型；B-C.处于分蘖期的PLDζ1超表达植株和对照野生型经过0、75mM NaCl处理30天后叶片丙二醛(MDA)含量(B)和叶片质膜透性(C)。数值表示平均值±标准差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

图2.PLDζ1的缺失突变导致植株对盐胁迫敏感性增强的示意图。

处于分蘖期的pldζ1突变体及野生型经过0、50、150mM NaCl处理21天后的表型。

图3.PLDζ1的缺失导致植物在盐胁迫下株高及生物产量下降、细胞膜受损程度比对照野生型严重示意图。

A.处于分蘖期的pldζ1突变体及野生型经过0、50、150mM NaCl处理21天后的株高测定。数值表示平均值±标准差(n＝6)；B-D.处于分蘖期的pldζ1突变体及野生型经过0、200mM NaCl处理15天后地上部鲜重(B)、丙二醛MDA含量(C)和质膜透性(D)的测定结果。数值表示平均值±标准差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

图4.盐胁迫下PLDζ1对植株体内Na⁺和K⁺含量的影响示意图。

A、B.处于分蘖期的pldζ1突变体及野生型经过0、150mM NaCl处理14天后的钠离子测定结果；C、D.处于分蘖期的pldζ1突变体及野生型经过0、150mM NaCl处理14天后的钾离子的测定结果。数值表示平均值±标准差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

图5.PLDζ1催化磷脂酰胆碱PC产生磷脂酸PA示意图。

PIP₂可显著促进PLDζ1的催化活性，且在中性pH 7值条件下PLDζ1活性最高。

图6.突变体pldζ1及野生型叶片Na⁺转运相关基因在盐胁迫下的表达量差异示意图。

对分蘖期的pldζ1突变体及野生型用0、150mM NaCl处理6小时后，分析与Na⁺转运相关基因表达量的结果。数值表示平均值±标准差(n＝3),*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

本发明实施例所用的水稻磷脂酶PLDζ1基因在公共核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陆号为XM_015784967。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

PLDζ1基因克隆及其超表达增强植物耐盐性

1.PLDζ1基因全长cDNA的克隆和植物超表达载体构建：

从粳稻Dongjin叶片中提取总RNA,以mRNA为模板经过反转录RT-PCR合成第一链cDNA，然后以cDNA为模板，使用PLDζ1序列特异性引物PLDζ1FZ：5’-GGGGTACCATGCAAGAATATCTGAACC-3’和PLDζ1RZ：5’-CGGGATCCATGGAAAACTTGTGGAG-3’进行PCR扩增，扩增得到的目的片段包括SEQ ID NO.1所示序列。扩增的目标片段插入到植物超表达载体pU1301D1(经pCAMBIA1301改造，Hajdukiewicz等，The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol.Biol.1994,25：989-994)的酶切位点Kpn I和BamH I之间，获得pU1301D1:PLDζ1重组质粒经过酶切和测序验证PLDζ1序列正确后，将该质粒转化农杆菌EHA105菌株。

2.遗传转化和PLDζ1超表达水稻植株的创建：

采用农杆菌介导的遗传转化技术，将含pU1301D1:PLDζ1重组质粒的农杆菌侵染粳稻Dongjin愈伤组织，经共培养、筛选、芽分化诱导和促根培养，具体步骤如下：

1)水稻愈伤组织的诱导：

将水稻种子去壳，用75％乙醇灭菌1min，再用0.05％的氯化汞溶液灭菌处理20min，经双蒸水洗5次后播种于诱导培养基，置黑暗中26℃培养约4周获得愈伤组织。将愈伤组织转至继代培养基中进行继代培养，得到胚性愈伤组织。愈伤组织诱导培养基的配方包括N6培养基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L烟酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2.5mg/L 2,4-D、0.3g/L脯氨酸、0.6g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L琼脂糖,pH 5.9。而继代培养基中的2,4-D浓度为2mg/L、脯氨酸浓度为0.5g/L，其它组分与诱导培养基相同。

2)农杆菌侵染愈伤组织：

用含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB固体培养基培养农杆菌，在28℃下培养2天，挑取单菌落进行扩大培养，在28℃下摇荡(200rpm)培养至菌液OD₆₀₀等于0.8。将胚性愈伤组织置于菌液中，在28℃下孵育30min，吸干菌液，将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥，然后移至共培养基于20℃下共培养2天。共培养培养基的配方包括1/2N6培养基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L烟酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2,4-D 3mg/L、0.8g/L水解酪蛋白、20g/L蔗糖和7g/L琼脂糖,pH 5.6。

3)转化植株的获得：

将共培养的愈伤组织转出，经无菌水漂洗5次，再用含有400ppm羧苄青霉素的灭菌水浸泡愈伤30min。然后吸干放在滤纸上，将晾干的愈伤组织转入筛选培养基(含50mg/L潮霉素)，在28℃暗培养20d后，继代一次。将新长出的抗性愈伤组织转移到分化培养基，于28℃下光照培养2～3周后，每2周更新培养基，待愈伤组织长出小苗后转入MS培养基中进行生根培养，然后炼苗、移栽。筛选培养基配方包括N₆培养基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L烟酸、1mg/L VB6、1mg/L VB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2.5mg/L 2,4-D、0.6g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、7g/L琼脂糖、1mg/L潮霉素和200ppm羧苄青霉素，pH 6.0。芽分化培养基则为MS培养基、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA·2H₂O、1mg/L烟酸、1mg/L VB6、1mg/LVB1、2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、2mg/L 6-BA、2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.2mg/L IAA、1g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L琼脂糖,pH 6.0。

4)转化植株的PCR鉴定和Real-time PCR表达量分析：

提取再生植株叶片DNA，利用PLDζ1特异性序列引物PLDζ1FZ：5’-GGGGTACCATGCAAGAATATCTGAACC-3’和PLDζ1RZ：5’-CGGGATCCATGGAAAACTTGTGGAG-3’对叶片DNA进行PCR检测，以WT(野生型粳稻Dongjin)的DNA为负对照，检测再生植株是否导入PLDζ1基因。结果有9个独立株系可扩增出预期大小一致的目标片段，而对照野生型WT则没有扩增到目标片段，说明PLDζ1全长CDS序列已成功倒入水稻植株中。此外，提取转化植株叶片总RNA，反转录合成cDNA,通过实时定量Real-time PCR分析了上述获得的转化植株系。结果表明多数转化株系的表达量均显著高于对照野生型。获得PLDζ1超表达水稻转基因植株，用于以下实施例。

实施例2：

PLDζ1超表达增强植物的耐盐性

随机抽取实施例1创建的PLDζ1超表达水稻转化植株的两个PLDζ1-OE独立株系OE-14和OE-15进行详细分析，以同样经过组培过程的非转化再生植株(野生型，WT)作为对照，在分蘖期对其进行不同浓度的NaCl溶液(0、50、75mM)处理一个月。结果发现在正常条件下，PLDζ1超表达植株与对应野生型在株高、叶片质膜透性及丙二醛含量等方面均没有显著性差异，但在盐胁迫条件下，PLDζ1超表达植株存活率显著高于野生型，其叶片质膜透性与丙二醛含量显著低于非转化的野生型(图1)。在75mM NaCl处理一个月后，超表达OE14和OE15植株叶片丙二醛含量分别仅为对照野生型的39％和58％，叶片质膜透性分别仅为野生型38％和73％(图1)。表明在盐胁迫下超表达植株叶片受损程度显著低于对照野生型。并且在150mM NaCl胁迫下超表达植株可收获到成熟饱满的种子，而对照野生型植株则未能获得种子。说明水稻PLDζ1过量表达可增强植株的耐盐性且能提高其种子产量。PLDζ1在盐胁迫反应中具有正调控植株的耐盐性。

实施例3：

PLDζ1缺失突变体分离、鉴定及其基因功能鉴定

1.突变体pldζ1的分离鉴定与表型观察：

为进一步验证分析PLDζ1基因功能，本发明分离获得了T-DNA插入PLDζ1不同位点的两个独立突变体株系，分别命名为pldζ1-1和pldζ1-2，其中pldζ1-1的T-DNA插入位于PLDζ1的3’-UTR区域中，而pldζ1-2的T-DNA插入位于PLDζ1第三个内含子中。通过半定量RT-PCR分析了T-DNA的插入对PLDζ1表达的影响，结果显示pldζ1-1纯合突变体中PLDζ1有少量表达，但明显低于野生型，而pldζ1-2纯合突变体中未能检测到PLDζ1mRNA,属于完全缺失突变体。

分析表明PLDζ1受到盐胁迫所诱导，预示PLDζ1可能参与盐胁迫反应过程。本研究利用获得的突变体pldζ1-1和pldζ1-2材料进行盐胁迫处理分析。将同时期收获的突变体及对应的野生型种子播种于土壤(有机土：蛭石＝1:1)中，然后将长势一致的3-4叶期幼苗移植到盆栽土壤(稻田土:有机土＝1:1)。待植株长到分蘖初期时开始盐胁迫处理，经过施加不同浓度的NaCl溶液(0、50、150mM)处理三周后观察表型。结果发现在正常条件下，突变体pldζ1-1和pldζ1-2与野生型的长势没有明显差别，而在盐胁迫处理下，pldζ1-1和pldζ1-2突变体植株生长明显弱于其对应的野生型，其株高显著低于野生型，且随着盐浓度的增加，突变体长得越差，与野生型的株高差异越大(图2，图3中A)。为分析PLDζ1的缺失突变对植株耐盐性的影响，对处于分蘖期的植株用200mM NaCl处理15天，然后测定植株地上部分鲜重、叶片质膜透性与丙二醛含量。结果发现，正常条件下的pldζ1-1和pldζ1-2突变体与野生型在植株鲜重、质膜透性及丙二醛含量方面均没有显著性差异。但在盐胁迫条件下，突变体的株高和地上部鲜重均显著低于野生型，并且突变体的质膜透性与丙二醛含量显著高于野生型，为野生型的两倍(图3)。

2.水稻PLDζ1对盐胁迫下植物体内Na⁺和K⁺含量的影响：

为了检测水稻PLDζ1是否影响了盐胁迫下植株对Na⁺和K⁺的吸收，本研究测定了盐胁迫下pldζ1突变体与对应野生型体内的Na⁺和K⁺含量。在分蘖期施用150mM NaCl溶液两周，取pldζ1突变体与野生型植株根部、叶鞘、叶片组织，分别通过原子吸收分光光度计测定样品Na⁺和K⁺含量。结果发现在正常生长条件下，pldζ1突变体和野生型根部及叶片组织的Na⁺含量没有明显的差别(图4A，B)。在盐胁迫下，两个pldζ1突变体的根部、叶鞘和叶片组织的Na⁺含量均显著高于相应的野生型(图4A，B)。突变体叶鞘钾离子K⁺含量则显著低于对应的野生型(图4C,D)。说明PLDζ1缺失导致植株体内钠离子积累的增强，影响了叶组织的Na⁺/K⁺离子平衡，水稻PLDζ1的缺失突变导致植物对盐敏感。

实施例4：

PLDζ1原核蛋白表达、酶生化特性

水稻PLDζ1是否编码磷脂酶D尚未清楚，其生化特性也有待进一步分析。为此，本发明构建了PLDζ1的原核表达载体pET28a(Novagen公司)，其酶切位点为BamH I和SacI，使用引物为PLDζ1FQ(5’-GGATCCATGCAAGAATATCTGAACC-3’)和PLDζ1RQ(5’-GAGCTCATGGAAAACTTGTGGAGAC-3’)。利用表达的PLDζ1重组蛋白进行酶活性分析，以含pET28a空载体菌株诱导出的蛋白做负对照。以磷脂酰胆碱PC(普通PC:荧光PC＝8:2)作为底物，结果表明水稻PLDζ1可催化磷脂酰胆碱产生磷酸酯酸PA，而含空载体的蛋白则在相同条件下未能检测到明显的PA信号。本发明还进一步分析了磷脂酰肌醇衍生物PIP₂对PLDζ1活性的影响，结果发现水稻PLDζ1的催化活性依赖于PIP₂，并且在pH 7的条件下，PLDζ1活性最高(图5)。这些结果表明水稻PLDζ1基因编码了磷脂酶D,主要催化PC产生PA。

实施例5：

PLDζ1对水稻脂质代谢及其钠离子转运相关基因表达量的影响

1.PLDζ1对水稻脂质代谢的影响：

为分析PLDζ1对脂质代谢的影响，本发明利用种植于有机土壤(营养土:蛭石＝1:1)处于分蘖期的pldζ1突变体和对应野生型材料，提取正常生长及盐胁迫(50mM NaCl)处理四天的叶片脂质，通过高通量质谱技术测定植株体内的脂质含量。结果显示正常条件下的pldζ1突变体内的磷脂酸(PA)、双半乳糖二脂酰甘油(DGDG)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰甘油(PG)含量均显著低于野生型，而单半乳糖脂二脂酰甘油(MGDG)和磷脂酰丝氨酸(PS)含量都显著高于野生型。在盐胁迫条件下，突变体pldζ1内的单半乳糖脂二脂酰甘油(MGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的含量及摩尔百分比含量、磷脂酰丝氨酸(PS)和双半乳糖二酰基甘油(DGDG)的含量都显著高于野生型，而磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰胆碱(PC)含量均显著低于对应野生型。这说明PLDζ1参与正常及盐胁迫条件下脂质代谢的调控。

2.PLDζ1对钠离子转运相关基因表达的影响：

本研究通过实时定量Real-time PCR分析钠离子转运相关基因的表达量。对生长于水培液、处于分蘖期的pldζ1-1突变体和野生型进行150mM NaCl胁迫处理，然后提取处理0、6h的水稻叶片总RNA，进行相关基因表达的定量分析。在正常条件下，向细胞内转运Na⁺离子的HKT1基因、向液泡内转运Na⁺离子的NHX1基因、SOS信号转导途径中相关的SOS3基因表达水平在突变体和野生型之间均没有明显差异，而在盐胁迫下HKT1表达量受到抑制，且pldζ1-1突变体中的表达量显著高于野生型(图6)，这说明PLDζ1及其产物PA可抑制HKT1的表达，从而阻止胞外Na⁺的进入；而NHX1表达水平在盐胁迫下的结果则与HKT1基因相反，显著受盐胁迫所诱导，且突变体中的NHX1表达量显著低于野生型，表明PLDζ1可促进NHX1表达，增强Na⁺进入液泡中；而SOS1、SOS3基因在盐处理条件下，野生型中的表达量显著高于突变体，所以PLDζ1可促进其表达，从而增强Na⁺排除到体外。这些结果表明PLDζ1可参与调控钠离子转运相关基因表达的调控，进而调控植株免受过高浓度钠离子的伤害。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐盐性中的应用

<130> 磷脂酶PLDζ1基因在提高植物耐盐性中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

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<211> 2805

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

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tgcaaatttt tggaggtatc atgtttgtca tttttaccgg aatatgggcc taagctaaag 120

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aagccaggat tcttagcttt actcaaagat ccttttgatc caaagctttt agatgtcctt 300

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ggtttcgtag acaatataag ttcccttgag tcatcatcta ttaggcattt tgattcttcc 1620

aaagaagaaa agtatcacat ggataagaac tggtgggaga tgcaagaaag aggagatcaa 1680

gttgcttcag tacttgatat agggcaagtt ggtccaaggg caacttgtca ttgtcaggta 1740

attagaagtg ttggtcaatg gtcagctgga accactcaaa tcgaaggaag catccacaat 1800

gcctattttt ctcttattga aaaggcagaa cattttgtat atatcgagaa tcaatttttc 1860

atatcaggcc tttcaggaga tgaaacgata aaaaatcgtg tattggaagc attatacagg 1920

cgcatacttc gggcagagag agaaaaaaag cgcttcaaag ccatcataat aatacctctg 1980

ttacctggtt ttcagggagg cattgatgat ggcggagctg catctgtgag agcaattatg 2040

cattggcaat accggactat ctgtagaggc cctaattcta tacttcagaa tctatatgat 2100

gttattggtc caaaagcaca tgattatatc tcattttatg gtcttagagc acatggtaga 2160

ctatgcgaag gaggtccctt ggtcactaat cagatttatg tccacagtaa gttgatgata 2220

attgatgacc gcatcacatt gattggatca gctaacataa atgatagaag cttgcttgga 2280

tcaagagatt ctgagattgc cgtggtcatt gaagataaag aagttgttag ttccaaaatg 2340

aatggaaaac cttgggaagc tgggaagttt tctctaagcc tacgtctctc tctctgggca 2400

gagcaccttg gccttcatcg aggagaggtc agccatatta tggaccctat cgatgactca 2460

actttcaaaa atatctggat ggccactgct aagacaaata ccatgattta ccaagatgtc 2520

ttctcatgtg tacctaatga tcttatccat tcaagggccc aatttcggca gagctttgct 2580

cactgcaggg ataaaatcgg tcacaataca atcgatttgg gggttgccca agagaagctg 2640

gaaacctacc aggacggcga tctcaagggt acggacccta tagaaagatt gcagatgatc 2700

aaaggtcacc ttgtttcttt cccgttggat ttcatgtccc aagaggactt gagaccatat 2760

ttcagtgaaa gtgaatatta tacgtctcca caagttttcc attag 2805

<210> 2

<211> 934

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 2

Met Gln Glu Tyr Leu Asn His Phe Leu Gly Asn Leu Asp Ile Val Asn

1 5 10 15

Ser Pro Glu Val Cys Lys Phe Leu Glu Val Ser Cys Leu Ser Phe Leu

20 25 30

Pro Glu Tyr Gly Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Val Ser Val Gly His

35 40 45

Leu Pro Lys Ile Gln Lys Asp His Lys Glu Asn Cys Cys Ser Cys Gly

50 55 60

Leu Phe Ser Cys Cys Lys Ser Ser Trp Gln Lys Val Trp Val Val Leu

65 70 75 80

Lys Pro Gly Phe Leu Ala Leu Leu Lys Asp Pro Phe Asp Pro Lys Leu

85 90 95

Leu Asp Val Leu Ile Phe Asp Ala Leu Pro His Met Asp Ile Ser Gly

100 105 110

Glu Gly Gln Ile Ser Leu Ala Lys Glu Ile Lys Glu Arg Asn Pro Leu

115 120 125

His Phe Gly Leu Gln Val Ser Ser Gly Gly Gln Thr Leu Lys Leu Arg

130 135 140

Thr Arg Ser Ser Ser Lys Val Lys Asp Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala

145 150 155 160

Ala Arg Gln Thr Pro Glu Gly Trp Cys Tyr Pro His Arg Phe Gly Ser

165 170 175

Phe Ala Pro Pro Arg Gly Leu Met Pro Asp Gly Ser Met Val Gln Trp

180 185 190

Phe Ile Asp Gly Glu Ala Ala Phe Gln Ala Ile Ala Ser Ser Ile Glu

195 200 205

Gln Ala Lys Ser Glu Ile Phe Ile Thr Gly Trp Trp Leu Cys Pro Glu

210 215 220

Leu Phe Leu Arg Arg Pro Phe Gln His His Gly Ser Ser Arg Leu Asp

225 230 235 240

Ala Leu Leu Glu Ala Arg Ala Lys Gln Gly Val Gln Ile Tyr Ile Leu

245 250 255

Leu Tyr Lys Glu Val Ala Leu Ala Leu Lys Ile Asn Ser Leu Tyr Ser

260 265 270

Lys Gln Lys Leu Leu Asn Ile His Glu Asn Val Lys Val Leu Arg Tyr

275 280 285

Pro Asp His Phe Ser Ser Gly Val Tyr Leu Trp Ser His His Glu Lys

290 295 300

Ile Val Ile Val Asp Asn Gln Val Cys Tyr Leu Gly Gly Leu Asp Leu

305 310 315 320

Cys Phe Gly Arg Tyr Asp Asn Ser Ala His Lys Leu Ser Asp Val Pro

325 330 335

Pro Val Ile Trp Pro Gly Lys Asp Tyr Tyr Asn Pro Arg Glu Ser Glu

340 345 350

Pro Asn Ser Trp Glu Asp Thr Met Lys Asp Glu Leu Asp Arg Thr Lys

355 360 365

Tyr Pro Arg Met Pro Trp His Asp Val Gln Cys Ala Leu Tyr Gly Pro

370 375 380

Pro Cys Arg Asp Val Ala Arg His Phe Val Gln Arg Trp Asn Tyr Ala

385 390 395 400

Lys Arg Asn Lys Ala Pro Asn Glu Gln Gly Ile Pro Leu Leu Met Pro

405 410 415

His His His Met Val Ile Pro His Tyr Lys Gly Ile Gly Gln Glu Ile

420 425 430

Asn Ser Glu Ala Asp Gly Lys Gln Asn His Asp Lys Asp Cys Asp Val

435 440 445

Lys Lys Pro Val Ser Val Asp Ser Arg Glu Ser Cys Gln Asp Ile Pro

450 455 460

Leu Leu Leu Pro Gln Glu Leu Glu Pro Pro Ala Leu Pro Asn Gly Asp

465 470 475 480

Leu Arg Val Asn Asp Leu Asp Ala Asn His Ser Asp His Leu His Lys

485 490 495

Thr Ser Phe Asn Gln Pro Leu Leu Asn Arg Lys Ala Lys Leu Asp Ser

500 505 510

Ser Arg Gln Asp Leu Pro Met Arg Gly Phe Val Asp Asn Ile Ser Ser

515 520 525

Leu Glu Ser Ser Ser Ile Arg His Phe Asp Ser Ser Lys Glu Glu Lys

530 535 540

Tyr His Met Asp Lys Asn Trp Trp Glu Met Gln Glu Arg Gly Asp Gln

545 550 555 560

Val Ala Ser Val Leu Asp Ile Gly Gln Val Gly Pro Arg Ala Thr Cys

565 570 575

His Cys Gln Val Ile Arg Ser Val Gly Gln Trp Ser Ala Gly Thr Thr

580 585 590

Gln Ile Glu Gly Ser Ile His Asn Ala Tyr Phe Ser Leu Ile Glu Lys

595 600 605

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610 615 620

Ser Gly Asp Glu Thr Ile Lys Asn Arg Val Leu Glu Ala Leu Tyr Arg

625 630 635 640

Arg Ile Leu Arg Ala Glu Arg Glu Lys Lys Arg Phe Lys Ala Ile Ile

645 650 655

Ile Ile Pro Leu Leu Pro Gly Phe Gln Gly Gly Ile Asp Asp Gly Gly

660 665 670

Ala Ala Ser Val Arg Ala Ile Met His Trp Gln Tyr Arg Thr Ile Cys

675 680 685

Arg Gly Pro Asn Ser Ile Leu Gln Asn Leu Tyr Asp Val Ile Gly Pro

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Lys Ala His Asp Tyr Ile Ser Phe Tyr Gly Leu Arg Ala His Gly Arg

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Leu Cys Glu Gly Gly Pro Leu Val Thr Asn Gln Ile Tyr Val His Ser

725 730 735

Lys Leu Met Ile Ile Asp Asp Arg Ile Thr Leu Ile Gly Ser Ala Asn

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Lys Ile Gly His Asn Thr Ile Asp Leu Gly Val Ala Gln Glu Lys Leu

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Glu Thr Tyr Gln Asp Gly Asp Leu Lys Gly Thr Asp Pro Ile Glu Arg

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Leu Gln Met Ile Lys Gly His Leu Val Ser Phe Pro Leu Asp Phe Met

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Ser Pro Gln Val Phe His

930