甜菜碱在提高CELI家族酶活性中的应用的制作方法

本发明具体涉及甜菜碱在提高CELI家族酶活性中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

CELI酶是一种单链、双链都特异识别的特异性核酸酶，等电点为6.0-6.5，分子量大小为43kDa(Yang et al,1999)；CEL II酶被认为是CEL I的降解产物，其分子量大小为39kDa，CEL I酶和CEL II酶均属于CELI家族酶(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches)分别为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Till et al,2006)。该酶可以特异性切割错配碱基(Bing Yang et al,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是通过硫酸铵沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白A-琼脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脱，但是得率较低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

传统的理论认为CELI酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺，有没有可能存在其他离子可提高CELI酶的活性。到目前为止，Kulinski等人(Kulinski et al,2000)发现Li⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺对CELI酶的活性皆没有提高。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供甜菜碱在促进CELI家族酶活性中的应用；或甜菜碱在制备CELI家族酶酶切缓冲液或CELI家族酶酶切缓冲体系中的应用。

上述应用中，所述CELI家族酶活性为切割错配位点。

本发明的另一个目的是提供含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液。

本发明提供的含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述甜菜碱在所述CELI家族酶酶切缓冲液中的浓度为0.01-20mM。

上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述甜菜碱在所述CELI家族酶酶切缓冲液中的浓度为0.1-10mM、2-20mM或0.01-4mM。

上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述CELI家族酶酶切缓冲液为 CELI酶切缓冲液，其中，所述甜菜碱在所述CELI酶切缓冲液中的浓度为0.1-10mM；

或CELI家族酶酶切缓冲液为CELII酶切缓冲液，其中，所述甜菜碱在所述CELII酶切缓冲液中的浓度为0.01-20mM；更具体为2-20mM或0.01-4mM。

上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液由甜菜碱、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES缓冲液组成；

或所述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液由Mutation Detection Kit-S100试剂盒中的缓冲液和甜菜碱组成。

上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述Mutation Detection Kit-S100试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为706025。

上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液中，所述HEPES缓冲液为浓度为0.1M、pH值为7.5的HEPES缓冲液。

本发明还有一个目的是提供一种酶切反应体系。

本发明提供的酶切反应体系包括上述含有甜菜碱的CELI家族酶酶切缓冲液和CELI家族酶。

本发明还有一个目的是提供含有上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系的试剂盒。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在促进CELI家族酶切割含有错配位点DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在检测待测DNA分子是否含有错配位点中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种用CELI家族酶酶切含有错配位点DNA的方法。

本发明提供的用CELI家族酶酶切含有错配位点DNA的方法包括如下步骤：将含有错配位点DNA在上述酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切。

上述方法中，所述错配位点的错配形式为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述方法中，所述酶切反应温度为45℃；所述酶切反应时间为30min。

上述应用或上述的酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒或上述方法中，所述CELI家族酶为CEL I酶或CEL II酶。

本发明发现了新的催化活性物质甜菜碱，通过实验证明：甜菜碱可以进一步提高CELI酶活，特别是对低丰度突变的检测，由于CEL II属于CELI家族酶，为了进一步验证甜菜碱可以同时提高CELI家族酶的酶切活性，本发明还设计了CEL II酶切活性检测实验，实验结果同样表明甜菜碱也可以提高CEL II酶活。与传统的酶切方法相比，本发明的方法更为灵敏：甜菜碱的终浓度在0.01-20mM范围内都可以提高CELI酶和 CELII酶的检测灵敏度。对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是TILLING技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了PCR纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。

附图说明

图1为甜菜碱对CELI酶切效果。

图2为甜菜碱对CELII酶切效果。

图3为甜菜碱对CELII酶切效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Mutation Detection Kit-S100试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为706025。

Binding Buffer是美国Zymo Research公司的产品；DNA Clean&Concentrator^TM-25。

HEPES缓冲液(0.1M、pH值为7.5)是Sigma公司的产品，产品目录号为H3375-25G。

实施例1、甜菜碱在提高CELI家族酶活性中的应用

一、待酶切DNA样品的制备

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA(浓度为1ng/ul)。

序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

2、PCR扩增

以步骤1获得的待PCR扩增的DNA为模板，采用F和R引物对所述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，得到PCR扩增产物，即待酶切DNA样品。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下：

F：5’-ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG-3’；

R：5’-TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA-3’。

对PCR扩增产物进行测序。测序结果表明PCR扩增产物含有序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列1的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA 分子。

PCR扩增体系(10ul)：10倍PCR缓冲液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂06.78ul；

PCR扩增热循环：95℃2min；94℃10s，60℃30s，72℃1-3min；72℃5min，12℃hold。

异源错配双链形成：99℃10min；70℃20s，-0.3℃per cycle，70cycles；12℃10min。

3、PCR产物纯化

(1)用在1倍体积的PCR扩增产物中加入2倍体积的Binding Buffer，翻转充分混匀(对小于200bp的PCR扩增产物，加入5倍体积的Binding Buffer)得到混合液。

(2)将所述混合液加入DNA纯化柱内(如果溶液体积>700μl，分次转移溶液)；室温放置1-2min或更长时间。

(3)13,000g离心1min，弃废液(目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心)。

(4)在DNA纯化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。

(5)重复步骤(4)。

(6)13,000g离心3min，以去除柱中残余乙醇。

(7)将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃预热的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室温放置1-2min或更长时间。

二、CELI酶的制备

1、取10kg芹菜，放入榨汁机中，缓慢榨汁后，避免温度过热，在汁液中加入预冷匀浆缓冲液(含100mM Tris-HCl(pH均为7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、将所述混合液4℃下14000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵(每100ml上清液加25g硫酸铵)，分10次加入(每100ml体积加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速搅拌30min；14000rpm离心45min，弃沉淀，取上清液。

3、向上清液中缓慢加入硫酸铵至(每100ml上清液加80g硫酸铵)，分十次加入(每100ml体积加入39.0g固体硫酸铵)。低速搅拌30min后，14000rpm离心3min。弃上清，收集沉淀。

4、用1/10体积的缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)溶解步骤3中得到的沉淀，1000rpm离心20min，弃沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成适当长度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸 5min。用超纯水清洗透析袋。将透析袋放入10倍蛋白质溶液以上体积的缓冲液(0.1MTris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)中，透析过夜，透析4-5次至透析液无颜色为止。

6、取40ml透析过的酶液经ConA-Sapharose-4B柱，用缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)冲洗，经alpha-甘露糖苷洗脱后，经缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)透析过夜，得到纯化后的CELI酶，经过SDS-PAGE检测，其大小为43kDa，得到目的产物，分装-80度保存。

三、酶切反应及其效果

1、酶切缓冲液的配制

酶切缓冲液配制分成如下4组：

组1：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

组2：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同浓度的甜菜碱(0.01mM、0.1mM、1mM、4mM、10mM和20mM)；

组3：向Mutation Detection Kit-S100试剂盒(含有Mg²⁺)中的缓冲液加入不同量的甜菜碱，得到酶切缓冲液，使甜菜碱的浓度分别为0mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM。

组4：10倍digestion buffer(不含Mg²⁺缓冲液配制)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同浓度的甜菜碱(0.01mM、0.1mM、1mM、4mM、10mM、20mM)。

2、酶切反应

取2ul的待酶切DNA样品作为酶切反应底物，用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，得到酶切产物。

CELI酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR扩增产物2.0ul、纯水3.2ul。

CELII酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、CELII酶(来源于Mutation Detection Kit-S100试剂盒)0.3mg/ml)0.2ul、PCR扩增产物2.0ul、纯水3.2ul。

酶切反应条件：45℃温育30min。

若酶切产物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，则待酶切DNA样品含有错配位点(AC)；若酶切产物仅含有791bp的酶切片段，则待酶切DNA样品不含有错配位点(AC)。

3、毛细管电泳

酶切反应结束后立即加入2ul的0.225M的EDTA终止反应(15ul体系应加入3ul EDTA)，再补入91ul超纯水稀释样品，可直接上机(FS 96，美国AATI公司)进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表1所示。

表1、毛细管电泳条件

4、甜菜碱对CELI酶和CELII酶酶切效果的影响

(1)甜菜碱对CELI酶切效果的影响

酶切产物经用毛细管分离的结果如图1所示(其中CK的酶切缓冲液为组1；其余泳道为含有不同浓度甜菜碱的组2；CELI酶切反应体系)。从图1可以看出：酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，与待酶切DNA样品中错配位点(AC)一致，并且浓度范围在0.1-10mM的甜菜碱的酶切效果好于镁离子的酶切结果，说明浓度范围在0.1-10mM的甜菜碱均可提高CELI酶切活性。

(2)甜菜碱对CELII酶切效果的影响

酶切产物经用毛细管分离的结果如图2和图3所示(其中图2不同泳道为含有不同浓度甜菜碱的组3；图3不同泳道为含有不同浓度甜菜碱的组4；图2和图3均为CELII酶切反应体系)。从图2和图3可以看出：酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，与待酶切DNA样品中错配位点(AC)一致，图2中浓度范围在2-20mM的甜菜碱的酶切效果好于没有甜菜碱的酶切效果，图3中浓度范围在0.01-10mM，尤其0.01-4mM的甜菜碱均可提高CELII酶切活性。说明浓度范围在0.01-20mM的甜菜碱均可提高CELII酶切活性。