专利名称：：丁内铵盐/巴豆甜菜碱－l－肉毒碱代谢基因及其在微生物法生产l－肉毒碱中的用途的制作方法本申请是申请号为94193701．1(国际申请号为PCT／EP94／03317)的申请的分案申请。本发明涉及丁内铵盐／巴豆甜菜碱-L-肉毒碱基因的重组遗传物质，含有该遗传物质的微生物和这类微生物在生物法生产L-肉毒碱中的用途。L-肉毒碱是一种在人体代谢过程中具有重要意义的天然、类维生素物质。在脂肪酸的利用中，L-肉毒碱可以作为线粒体膜的递质并由此作为代谢能的转运因子，因此是必需的。如果人体L-肉毒碱合成不足，就必须在饮食中进行添加以避免缺乏症。特别是在仍无法合成其自身的L-肉毒碱的婴儿的饮食中，L-肉毒碱是一种必需营养素。L-肉毒碱被用作药物的有效成分。在肉毒碱缺乏症和其它症状，特别是心脏病等疾病的治疗方法中需补充L-肉毒碱。高等生物中的L-肉毒碱的生物合成是已知的，它在代谢中的其它功能和重要性是更加深入的研究课题。除了对于已描述的微生物、特别是Pseudomonas属的代谢途径(羟基酶催化，Lindstedt等，Biochemistry16，2181-2188，1977)，L-肉毒碱在某些微生物如Agrobacterium(土壤杆菌)／Rhizobium(根瘤菌属)的代谢中被作为中间体合成。EP-A-O158194揭示了一种以例如γ-丁内铵盐为起始物的用微生物生产L-肉毒碱的方法，其中，利用常规微生物选择法得到-L-肉毒碱酰基(L-carnityl)脱氢酶阴性生产突变株，使用它已经可以在20至30小时的反应时间内得到较好的L-肉毒碱产率。但是，利用常规的微生物方法不可能进一步优化该方法的体积／时间比率。所以，本发明的目的是提供一种更为经济的生产L-肉毒碱的生物技术法，该方法可在大大缩短的反应时间内得到更好产率的L-肉毒碱。就γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱代谢的研究鉴定出5个基因，bcoA／B，bcoC，bcoD，bcoE和bcoT，它们编码γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱代谢途径中的酶并含于一个称为丁内铵盐-L-肉毒碱操纵子(bco)的操纵子中。本文中，缩写具有如下定义bcoA／Bγ-丁内铵盐-CoA(辅酶A)合成酶(bcoA)／巴豆甜菜碱-CoA合成酶(bcoB)基因，即，编码既具有γ-丁内铵盐-CoA合成酶活性又具有巴豆甜菜碱-CoA合成酶活性的一种酶产物的单个基因。bcoCγ-丁内铵盐-CoA脱氢酶基因bcoD巴豆甜菜碱-CoA水解酶基因bcoEL-肉毒碱酰基脱氢酶基因bcoT转运系统的潜在基因。已发现，bcoA／B，bcoC和bcoD基因的产物负责L-肉毒碱的生物合成，而bcoE编码将代谢中间体L-肉毒碱酰基CoA降解为甜菜碱的肉毒碱脱氢酶。bcoT可能是一个编码丁内铵盐代谢转运系统中的一种转运蛋白的基因。该基因对L-肉毒碱的生物合成来说不是必需的。本发明因而涉及DNA片段和载体，它们含有编码γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱代谢中用于L-肉毒碱合成的酶类的bcoC、bcoA／B和bcoD基因及可选的、另外的潜在转运基因bcoT中一个或多个。本发明还涉及含有这些DNA片段和／或载体的微生物。本发明还涉及使用本发明中的微生物生产L-肉毒碱的生物技术方法。如同所定义的，本文的说明书和权利要求中所用的表示法bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT既包括编码具有上述酶活性的γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱代谢的酶的野生型生物的基因，特别是丁内铵盐-L-肉毒碱操纵子基因，也包括它们的功能相当的遗传变异体和突变体，即由野生型生物的基因衍生而来的基因，且其基因产物的生物活性基本不变。所以，这些功能相当的遗传变异体和突变体包括，例如已知的遗传密码的简并化过程中的碱基置换，例如为了将基因序列改变成某种进行表达的微生物所利用的优选密码子可人工生成的那些。变异体和突变体还包括了碱基或密码子的删除、插入和替换，这些作用的程度使它们产生的经修饰过的基因的产物的生物功能基本不变。在此包括，例如与野生型序列高度同源，如同源性大于70％，并可在严紧杂交条件下，例如50至70℃的温度和0．5至1．5M的盐浓度，与野生型序列的互补序列杂交的基因序列。本文中的转录单位应被理解为指基因以单个转录方向排列并在一般转录调控下被转录成一连续转录产物的DNA序列，除基因外还含有基因表达所必需的遗传调控元素，如启动子和核糖体结合位点。以下附图更为具体地说明了本发明。图1显示了γ-丁内铵盐-或巴豆甜菜碱-L-肉毒碱代谢途径中的酶。图2显示了具有bco操纵子的取自Rhizobium／Agrobaterium的一段1．6kb的DNA片段的限制性酶切图。图3和图4显示了质粒pVK1011和pAZ101；箭头指示出bco基因和beu基因(甜菜碱利用基因；EP-A-O543344)的位置和方向。用黑体显示质粒的插入位置。图5显示了用于生产recA宿主株的可能起始物的质粒pCC49。图6显示了质粒pVK1011、pAZ101、pVKiooq和pAZ7的构建图。图7显示了一recA-宿主株的构建图。用于分离γ-丁内铵盐-／巴豆甜菜碱-L-肉毒碱代谢途径中的基因bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT的起始物可以是进行如图1所示的丁内铵盐和／或巴豆甜菜碱代谢的所有微生物。合适的菌株是Es-cherichia，Pseudomonas，Agrobacterium，Rhizobium和Agrobac-terium／Rhizobium属的微生物，优选的是后者。Agrobacterium／Rhizobium属微生物的一个优选实例是Agrobacterium／Rhizobiumsp．HK4(DSM2938)，EP-A-O158194中已对其有所描述。特别优选使用那些呈肉毒碱脱氢酶阴性的微生物，即例如没有或只有一个缺陷型的bcoE基因(后文中也被表示为bcoE′)。优选的肉毒碱脱氢酶阴性微生物的实例是已在EP-A-O158194中有所描述的A-grobacterium／Rhizobiumsp．HK13(DSM2903)和HK1331b(DSM3225)，或在EP-A-O543344中有所描述的Agrobacterium／Rhizobiumsp．HK1349(DSM3944)。通过例如对微生物进行转座子插入诱变并由此以合适的标记，如卡那霉素抗性标记γ-丁内铵盐-／巴豆甜菜碱-L-肉毒碱基因来在微生物的染色体上定位γ-丁内铵盐-／巴豆甜菜碱-L-肉毒碱代谢基因bcoA／B，bcoC，bcoD和bcoT。然后就可分离得到经如此标记的不能再利用丁内铵盐代谢中间体的突变体。以此方式，可进行γ-丁内铵盐-／巴豆甜菜碱-L-肉毒碱代谢基因的鉴定并与它们的功能关联起来。标记过的基因可以继而被克隆并用合适的限制酶进行更为详细的鉴定。然后，本发明的完整基因或DNA片段的分离可从一相应的未诱变过的微生物的基因库开始，通过已知方式用以上得到的诱变株的克隆基因与之杂交来从中分离和鉴定出bco基因或其片段。所得到的基因可被克隆入合适的载体并利用限制酶进行酶切分析。只知基因bcoA／B，bcoC和bcoD负责L-肉毒碱的生物合成。所以，只有这些基因的存在才是生产L-肉毒碱所必需的。根据选定的起始条件，例如选定的起始物或生产菌株，用于L-肉毒碱生产的DNA片段和载体可含有一个或多个L-内毒碱生物合成基因。如有必要，除了基因bcoA／B，bcoC和bcoD，本发明的DNA片段和载体还可包括潜在转运基因bcoT。L-肉毒碱酰基脱氢酶基因，即bcoE基因的存在是不合要求的，因为有它存在时会发生L-肉毒碱的降解。但是，缺陷型bcoE基因(bcoE′)的存在是无妨的。最好，用于L-肉毒碱生产的基因，即bcoC，bcoA／B和bcoD和可选的潜在转运基因bcoT一起位于一个DNA片段或载体分子中，例如最好在基因调控元素的常规的5＇-3′-方向下游，其顺序为bcoC，bcoA／B和bcoD或bcoC，bcoA／B，bcoD和bcoT，并在如上所述的单个转录单位中，对应于丁内铵盐-L-肉毒碱操纵子中的天然排列方式。可利用图2的限制性酶切图的相应部分来对这样一个转录单位的bcoC，bcoA／B，bcoD和bcoT基因进行鉴定。bco基因的转录和表达最好在一个合适的、最好是强启动子的调控下进行。启动子的选择取决于要求的表达情况，如要求是组成型表达还是诱导型表达，或进行表达的微生物。合适的启动子是，例如天然丁内铵盐-L-肉毒碱操纵子中的启动子Pbco。如果从例如具有缺陷型bcoE基因(bcoE′)的微生物中分离负责L-肉毒碱生物合成的bco基因，可较好地分离并克隆整个bco操纵子，而这些微生物的bcoE′基因及相关的基因调控元素可一起被分离及克隆，然后用在L-肉毒碱生产的合适微生物中。这种类型有一个如分离自例如A-grobacterium／Rhizobiumsp．HK1349的突变的bcoE基因的转录单位也可以利用图2所示的限制性酶切图来进行鉴定，如果bcoE的缺陷将只是因为例如一个点突变而与限制性酶切位置无关。另外，适用于表达的启动子是，例如PNm、PS1启动子(M．Labes等，Gene，89，37-46，1990)，trp启动子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)，lac启动子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)和tac启动子，可使用所述的trp启动子和lac启动子的杂交体作为组成型或诱导型启动子(Russell和Bennett，Gene，20，231-243，1982)。为了用于在合适的生产菌株中生产L-肉毒碱，包含所述的最好是一起存在于单个转录单位中的bco基因的本发明中的DNA片段最好借助于已知技术来插入已知的合适载体，特别是表达载体，如噬菌体或质粒。所用的载体可以是自主和自身复制载体或所谓的整合载体。整合载体在本文中应被理解为以质粒为例，具有至少一段与接受株的基因组序列同源的序列并可通过该序列的同源重组在接受株的基因组中插入外源基因的载体。优选使用自主和自身复制载体。根据所选载体的特性，L-肉毒碱生物合成酶的基因可在多种微生物中表达。合适的载体可以是具有特异性宿主谱的，也可以是具有广宿主谱(较广的宿主范围)的，及上述整合载体。所用的广谱宿主载体可以是所有适用于革兰氏阴性菌的载体。这种广谱宿主载体的实例为pVK100(Kneuf和Nester，Plasmid，8，45-54，1982)，pME285(Haas和Itoh，Gene，36，27-36，1985)和pKT240(Bagdasarian等，Gene，26，273-282，1983)或其衍生物。可用的pVK100的衍生物为例如pVK1001，可用的pME285的衍生物为例如pAZ10，可用的pKT240的衍生物为例如pLO32(如EP-A-O543344中所述的)。用于Agrobacterium／Rhizobiumsp．株的整合载体可以是基于pACYC184或pBR322(Comai等，Plasmid，10，21-30，1983)而构建的。以这种方式可得到质粒pVK100q、pVK1011(图3)、pAZ7beu、pAZ101(图4)和pLO41。质粒pVK100q于1993年11月16日保藏于GermanCollectionforMicroorganismsandCellCultureGmbH，D-38124Braunschweig，Mascheroderweg1b，Rhizobium／AgrobacteriumHK．1349中，保藏号为DSM8726。为了得到发酵用生产菌株，即L-内毒碱生产菌株，必须将本发明的DNA片段或载体整合入合乎要求并适于表达的宿主菌株中。最好，为此目的用含有本发明DNA片段的载体转化微生物。微生物可由此含有在载体分子上或与其自身的染色体整合的本发明DNA片段。合适的生产菌株可以是所有能由巴豆甜菜碱和／或γ-丁内铵盐生产L-肉毒碱而其L-肉毒碱降解(分解代谢)能力被完全或部分抑制的微生物。L-肉毒碱的降解能力被抑制的微生物是，例如肉毒碱脱氢酶阴性株，即由突变或缺失造成肉毒碱脱氢酶基因bcoE缺失的菌株，和／或L，D-肉毒碱消旋酶阴性和L-肉毒碱脱氢酶阴性的菌株。合适的宿主菌株，最好是具有高底物和起始物耐受性的菌株，例如Escherichia，Pserdomonas，Agrobacterium，Rhizobium、Coma-monas和Rhizobium／Agrobacterium属的微生物，优选的是后者。前文已对Rhizobium／Agrobacteriumsp．HK13、HK1331b和HK1349进行了描述，HK1349．4(如EP-A-O543344中所述)仍是特别优选的。还发现，如果降低宿主菌株的重组能力，即重组倾向和重组频率，可以进一步提高L-肉毒碱的产率。因为由此抑制了基于染色体同源性的与载体的重组。例如，可通过recA基因的定点突变(recA突变)以已知方式来降低宿主菌株的重组能力。特别优选的重组能力受损的微生物是Rhizobium／Agrobacteriumsp．，例如后文中所描述的本发明的Rhizobium／AgrobacteriumHK1349．49菌株。所以，合适的生产菌株是，例如微生物Rhizobium／Agrobacteri-umHK1349、HK1349．4和HK1349．49，它们均含有质粒pVK100q、pVK1001、pAZ7、pAZ7beu、pAZ101或pLO41。由一选择培养基分离得到经转化的宿主菌株(生产株)，该培养基中加有菌株因具有一位于载体或DNA片段上的标记基因而具抗性的抗生素。如果将EP-A-O543344所述的微生物用作生产株，即其编码甜菜碱利用的染色体基因是突变过的而以含有编码甜菜碱利用的基因的质粒所转化的微生物，就甜菜碱的利用而言，它们也可被选用。就甜菜碱的利用而被选用的微生物实例为上述HK1349．4和HK1349．49，它们含有例如质粒pLO41、pAZ101、pAZ7beu或pVK1011。使用含有本发明DNA片段或载体的微生物来进行L-肉毒碱的生物技术生产。L-肉毒碱的生产过程以已知方法进行，例如EP-A-O158，194中所述，在合适的碳源和氮源存在下，从γ-丁内铵盐开始。所用的碳源和氮源可以是例如谷氨酸盐、乙酸盐和甜菜碱或甘油和甜菜碱。如果是利用就甜菜碱的利用而被选用的微生物进行生物技术生产，甜菜碱被用作唯一的氮源。可利用类似于EP-A-O158194中所述的方法进行发酵和其后的分离。通过改变培养基中的营养成分，及通过改变发酵条件以适应特定的微生物，可进一步提高L-肉毒碱的产率。将0．2ml的Tn5供体培养物E．coliS17-1／pSUP2021(R．Simon等，Biotechnology，1983，1，784-790〕与2ml受体培养物HK4混合并离心。在0．9％的生理盐水(NaCl溶液)中洗涤细胞并重悬于100μl0．9％的生理盐水中。在30℃，干的营养琼脂上将供体株与受体株的接合进行过夜。将收获的细胞稀释倒平皿在受体(SmR)和转座子(新霉素抗性(NmR))选择培养基上。使用Sm(1000μg／ml)和Nm(100μg／ml)可在营养琼脂上得到Tn5突变体。通过检测其在基本培养基上并不象图1那样利用丁内铵盐代谢中间体，可进行突变体的表型鉴定。将连接混合物的等分物用于转化E．coliED8654(Barek等，Mol，Gen．Genet．，146，199-207，1976)(Cohen等，1972，PNAS69，2110-2114)。在营养培养基中利用其氨苄青霉素(Ap100μg／ml)抗性和卡那霉素(Km25μg／ml)抗性筛选出转化子。所有筛选出的杂交质粒均带有以Tn5标记的一个HK4插入片段。根据限制性酶切图2以各种限制性酶进行这些插入体的酶切分析。限制性酶切图的比较可确定一系列具有不同表型的Tn5突变体中的相同基因组片段中转座子的插入。可通过利用均一酶切的DNA质粒的Southernblot杂交(“基因技术方法”，(基因工程方法)，S．Bertram和H．G．Gassen，G．FischerVerlag编，1991，219f．)和其后的电泳分离来证实上述结果。所用的探针是得自转座子突变体的克隆DNA的小片段。实施例3在lambda噬菌体中构建HK4基因组库为了使DNA可被lambda噬菌体包装，其长度须为40-52kb并有一个“cos位点”。为了在lambda噬菌体中构建HK4基因组库，可使用长度为23kb的cos质粒载体pVK100(Knauf和Naster，1982，Plasmid8，45-54)，由此可允许克隆17-29kb的DNA片段。以EcoRI消化pVK100，脱磷酸作用后并与被EcoRI部分消化的HK4DNA连接。通过测试0．58U／μgDNA或0．02U／μl反应混合物的消化度来测定理想的部分消化HK4DNA的EcoRI浓度，反应混合物中含8．5μg的HK4DNA。由琼脂糖电泳分离出大于17kb的DNA片段。在含有100μgcos质粒载体和400ng运载DNA的10微升(μl)体积溶液中进行连接反应。根据PromegaBiotec．提供的方案和在其混合试剂中进行“体外包装”，在25℃进行2小时。在转染E．coliS17-1后，利用Km抗性筛选带cos质粒载体。一批可获得5500个克隆(单个菌落)。将基因库保藏于-70℃，各含1000克隆的5批冷冻培养基(营养酵母培养基，NYB，Oxoid和50％甘油)中。每批取50μl在10mlNYB中培养过夜来进行基因库的扩增，并进行分份。具有合适的DNA序列的克隆表现出杂交信号并对每一种HK4突变体的缺陷型基因形成互补。来自各种突变体的DNA的杂交确定了一个10．6kb的DNA上的几个丁内铵盐代谢基因的“簇”(图2)。以常规方法进行克隆杂交(S．Bertram和H．G．Gassen，1991，ibid，221f．)。点杂交也以已知方法进行(S．Bertram和H．G．Gassen，1991，ibid，217f．)。通过与E．coliS17-1的接合将特定的表达载体pVK100HK-DNA引入实施例1中的Rhizobium／Agrobacteriumsp．HK4菌株中，其中含有不同代谢步骤(图1)的突变体。根据对供体的脯氨酸(pro)营养缺陷型的弥补和载体的抗生素抗性(KmRTc(四环素)R)进行筛选。根据EP-A-O534344的实施例3，以已知方法在E．coliS17-1中进行克隆。为此，从HK1349基因库中分离出10．6kb的bco操纵子并将它连接入pVK100。由此制得质粒pVK100q(参见构建图，图6)。在NYBKm(25μg／ml)培养基上在E．coliS17-1中进行筛选。根据实施例5所述的方法在HK突变体中鉴定正确插入。电泳分离被EcRI酶切的得自HK1349的DNA，并从凝胶上分离得10．6kb的片段。将分离得的片段连入EcRI酶切的pVK100载体。利用该杂交质粒混合物，转化E．co1iS17-1(脯氨酸营养缺陷型)，并在含Km(25μg／ml)的营养培养基上进行筛选。在以0．2％(w／v)的丁内铵盐作为C源和N源的基本培养基上的含丁内铵盐-CoA脱氢酶阴性突变体(HK4V)的膜上进行“片状杂交”以鉴定出由载体和带bco操纵子的10．6kbDNA形成的正确的杂交质粒克隆。在将正确的克隆接合转入突变体后，可在对该C源的利用上与细胞互补。由此鉴定的克隆pVK100q可直接用作生产质粒或作为带bco操纵子的DNA片段保存以用于以后的次级克隆。6．2pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q，pLO41和pAZ7beu的构建根据构建6构建pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q。将bco基因(10．6kb的EcoRI／EcoRI片段)插入pLO32(EP-A-O543344)来构成pLO41，将beu基因(3kbPstI／PstI片段，EP-A-O543344)插入pAZ7(图6)来构成pAZ7beu质粒。根据制造商提供的细节，相应的限制性酶的用量为3-5U／μgDNA。将bco基因插入pVK100(Knauf和Nester，ibid)来构成pVK100q。由质粒pVK100s(EP-A-O543344)的EcoRI缺失克隆来制备起始质粒pVK100sl(构建图6)。根据测得的限制性酶切图，一个3．1kb的BglⅡ-NruⅠ酶切片段，该片段在Southernblot杂交中被recA探针标记过，被克隆入BglⅡ-HindⅢ酶切过的载体pWS233。pWS233是一个“基因置换”载体，其描述可见W．Selbitschka等，Ap-pl．Microbiol．Biotechnol．38，1993，615-618。得自Tn5(pSUP2021，R．Simon等，Biotechnology，1，1983，ibid)的、编码Km抗性的一段XhoⅠDNA片段被克隆入pCC45质粒的XhoⅠ酶切位置，由此制得pCC49质粒。与W．Selbitschka等，1993，ibid中所述的相似，如下进行“基因置换”将3ml指数期的HK1349．4培养物与1ml指数期的供体培养物(S17-1／pCC49)混合，离心并用0．9％的NaCl溶液洗涤。将细胞在30℃，在50μlNYB营养琼脂中培养过夜。然后将重悬于0．9％的NaCl溶液中的细胞适当稀释后涂布在选择培养基上。用Sm(100μg／ml)和Nm(150μg／ml)，在营养琼脂上可得到Sm抗性受体HK1349．4转移接合体，它们对复合培养基中5％的葡萄糖敏感，这与“置换”载体上的sacRB基因有关。将选得的转移接合体在营养琼脂上不加选择压力地进行培养后，可获得低频(10-8双重组。约1周后，可分离出可耐受培养基中5％葡萄糖的细胞，它们仍然具有Nm抗性，但已变得对艮它霉素敏感(载体标记)。这种表现型证实了等位的标记交换并指示出其为HK1349．4的recA突变体。可以观察到典型的recA突变体的表现型(如UV敏感性等)。在由此制得的HK1439．49菌株中，带有同源序列的质粒插入染色体的倾向(同源重组)显然被降低了。所以，这种菌株极适合作为实施例6．2中的杂交质粒的宿主。所用的生产菌是本发明的HK1349．4／pLO41、HK1349．4／pVK1011、HK1349．4／pAZ7beu、HK1349．4／pAZ101、HK1349／pVK100q和HK1349／pAZ7。结果以与从EP-A-O543344中已知的HK13的衍生物HK1349(DSM3944)和HK1349．4的比较形式列于表1。用Bergmeyer(H．K．Bergmeyer，1974，Methodenderenzyma-tischenAnalyse(酶分析法)，VerlagChemie，Weinheim，1810f．)中描述的DTNB(5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸酯)法来测得由γ-丁内铵盐开始的L-肉毒碱的形成。表1<tablesid="table1"num="001"><table>菌株MM培养基和甘油比活性(nmol／l／h／OD)HK1349(非本发明)HK1349／pVK100qHK1349／pZA7加甜菜碱加甜菜碱加甜菜碱0．240．360．49HK1349(非本发明)HK1349．4(非本发明)HK1349．4／pLO41加L-谷氨酸盐加L-谷氨酸盐加L-谷氨酸盐0．140．110．29HK1349(非本发明)HK1349．4／pVK1011HK1349．4／pAZ7beuHK1349／pZA101加氨加甜菜碱加甜菜碱加甜菜碱0．120．540．471．08</table></tables>权利要求1．生产L-肉毒碱的生物学方法，它包括a)在合适的碳源和氮源存在下，利用以表达载体转化的微生物发酵生产巴豆甜菜碱和／或γ-丁内铵盐，所述载体含有一段DNA片段，所述的DNA片段含有生物合成L-肉毒碱基因bcoC、bcoA／B和bcoD中一个或多个，所述的DNA片段是插入在质粒pVK100q中的一段10．6kb的EcoRI片段，该质粒保藏在根瘤菌／农杆菌HK1349中，保藏号为DSM8726，其中bcoC编码γ-丁内铵盐-CoA脱氢酶，bcoA／B编码γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱-CoA合成酶，bcoD编码巴豆甜菜碱水解酶；和b)分离产生的L-肉毒碱。2．根据权利要求1所述的方法，其中的DNA片段还包含编码γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱代谢中潜在转运蛋白的基因bcoT。3．根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA片段所含的基因的排列顺序为bcoC、bcoA／B和bcoD，或者是bcoC、bcoA／B、bcoD和bcoT。4．根据权利要求1所述的方法，其中的DNA片段与表达所需的基因调控元件操作性连接。5．根据权利要求4所述的方法，其中的基因调控元件包含天然bco操纵子的启动子Pbco。6．根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA片段如图2所示。7．根据权利要求1所述的方法，其中的载体选自pVK100q、pVK1011和pAZ101。8．根据权利要求1所述的方法，其中的载体是pVK100q，该质粒保藏在保藏号为DSM8726的根瘤菌／农杆菌HK1349中。9．根据权利要求1所述的方法，其中的微生物属于根瘤菌／农杆菌属。10．根据权利要求1所述的方法，其中的微生物是保藏号为DSM8726的根瘤菌／农杆菌HK1349。11．微生物用于发酵生产巴豆甜菜碱和／或γ-丁内铵盐的用途，所述的微生物被表达载体转化，所述载体含有一段DNA片段，所述的DNA片段含有生物合成L-肉毒碱基因bcoC、bcoA／B和bcoD中一个或多个，所述的DNA片段是插入在质粒pVK100q中的一段10．6kb的EcoRI片段，该质粒保藏在根瘤菌／农杆菌HK1349中，保藏号为DSM8726，其中bcoC编码γ-丁内铵盐-CoA脱氢酶，bcoA／B编码γ-丁内铵盐／巴豆甜菜碱-CoA合成酶，bcoD编码巴豆甜菜碱水解酶。全文摘要本发明描述了含有L－肉毒碱生物合成的酶的编码基因的DNA片段和载体,含有这些DNA片段或载体的微生物以及使用所述微生物的L－内毒碱的微生物生产法。文档编号C12N15/52GK1282791SQ9912070公开日2001年2月7日申请日期1994年10月7日优先权日1993年10月8日发明者T·齐默尔曼,J·韦尔朗申请人:瑞士隆萨股份公司