新型FXR激动剂的合成和应用的制作方法

本发明涉及新型FXR激动剂的合成和应用，属于化学药物领域。
背景技术：
：法尼酯受体(FXR)属于核受体家族的一员，作为一种配体激活性转录因子，FXR直接或者间接地参与了超过四十种下游靶基因的转录调控。FXR和人体体内的胆汁酸稳态、糖脂代谢的平衡以及药物的代谢调控和转运有着重要的关系。FXR主要有α和β两种亚型，广泛分布于肝脏、肠道和肾脏等组织器官。FXR参与了体内多条重要的代谢通路，从而对机体的胆汁酸、脂质和糖等的代谢起到调控的作用。除了维持机体胆汁酸稳态、调控糖脂的代谢，FXR对于药物的代谢和转运也有着重要的作用。FXR可以调控多种I相和II相代谢酶和转运体。正常剂量下，对乙酰氨基酚可以通过肝脏的UGT和SULT酶发生葡萄糖醛酸化和硫酸化。但是当剂量过大时，额外的对乙酰氨基酚可以导致肝脏毒性，而FXR可以上调多种II相代谢酶的表达水平，促进药物代谢，起到保肝作用。正因为FXR在机体内的诸多重要作用，FXR被视为是治疗糖尿病、肥胖、肝炎和肝癌等疾病的重要靶点。作为内源性物质胆汁酸的受体，FXR已经成为多种代谢性疾病药物的热门靶点，针对FXR这一靶点已经报道了多种激动剂，包括GW406420，Fexaramine，CDCA22，XL335等。其中，Fexaramine已经被证实是一种肠道限制性FXR激动剂，可以有效地治疗肥胖和缓解胰岛素抵抗等疾病。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供新型FXR激动剂的化学合成策略。本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案是：新型FXR激动剂的化学合成策略，包括以下步骤；(1)4-二甲氨基溴苯(化合物1，10g，49.8mmol)和联硼酸频哪醇酯(16.5g，64.97mmol)溶于1，4-二氧六环溶液(60ml)，加入醋酸钾(12.26g，124.95mmol)，PdCl2(dppf)(1.83g，2.50mmol)，氮气保护，85℃反应4小时后将反应物倒入250ml水中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化铵溶液(100ml×2)洗涤，再用饱和食盐水(100ml)洗涤，加入无水硫酸钠干燥，浓缩后得到棕色胶状粗产品(18g)，硅胶柱色谱分离得到化合物2粗产品(6.5g)。加入石油醚(10ml)，抽滤并收集滤饼旋干得到化合物2(5.60g)，白色固体，产率45.34％。(2)3-硝基溴苯(化合物3，10.00g，49.50mmol)，丙烯酸甲酯(12.79g，148.51mmol)，三乙胺(20.9ml)，Pd(OAc)2(222.28mg，0.99mmol)和三苯基膦(519mg，1.98mmol)，在N，N-二甲酰胺(50ml)体系中氮气保护反应18小时。将反应液倒入水(250ml)中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化铵溶液(100ml×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，硅胶柱色谱分离，得到化合物4(5.2g)，黄色固体，产率50.7％。(3)化合物4(5.2g，25.10mmol)，锌粉(8.2g，125.49mmol)和氯化铵(6.71g，125.49mmol)在甲醇-水(50ml，v/v＝4∶1)的体系中反应3小时。用饱和碳酸氢钠溶液调pH至8，抽滤，旋干滤液，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取剩余物，合并有机相，用饱和食盐水(100ml)洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干溶液，得到化合物5粗品(4.25g，，95.56％)，黄色固体，产率94.53％。(4)化合物5(2.5g，14.11mmol)和4-溴苯甲醛(2.61g，14.11mmol)溶于二氯甲烷(30ml)中，加入乙酸(42.36mg)，20℃反应4小时后加入NaBH(OAc)3(4.49g，21.16mmol)，10-20℃反应16小时。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液(50ml)、饱和氯化铵溶液(50ml)和饱和食盐水(50ml)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤出去硫酸钠，有机相浓缩旋干，硅胶柱色谱分离得到化合物6(3.6g)，产率73.7％。(5)化合物6(3.5g，10.11mmol)，化合物2(2.75g，11.12mmol)，PdCl2(dppf)(369.85mg，0.505mmol)，碳酸钠(3.21g，130.33mmol)溶于1，4-二氧六环-水(50ml，v/v＝4∶1)中，氮气保护，85℃反应16小时后将反应液倒入水(80ml)中，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液(50ml×2)和饱和食盐水(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，硅胶柱色谱分离，得到化合物7(2.4g)，黄色油状，产率61.43％。(6)化合物7(2.4g，6.21mmol)，三乙胺(2.62mL，18.63mmol)，4-二甲氨基吡啶(75.87mg，0.62mmol)溶于二氯甲烷(30ml)，10-20℃加入6-溴-2-萘酰氯(1.92g，7.14mmol)，20℃下搅拌反应16小时，硅胶柱色谱分离，得到化合物8(2.2g)，黄色固体，产率57.18％。(7)化合物8(2.2g，3.55mmol)，甲胺四氢呋喃溶液(8.88ml，17.75mmol，2MinTHF)，Pd(OAc)2(40mg，0.177mmol)，碳酸钠(940.9mg，8.88mmol)溶于1，4-二氧六环(50ml)中，氮气保护，100℃下反应16小时后将反应液倒入水(80ml)中，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有机相，依次用饱和氯化铵溶液(50ml×2)和饱和食盐水(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱色谱分离得到棕色油状粗产品900mg，使用制备薄层色谱分离得到化合物Fex-4(300mg)，产率14.83％，产物为淡黄色固体。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)：7.69(s，1H)，7.59(s，1H)，7.42～7.47(m，6H)，7.37(d，J＝6Hz，1H)，7.28～7.31(m，3H)，7.08～7.14(m，2H)，6.96(d，J＝6Hz，1H)，6.84～6.86(m，1H)，6.72(d，J＝6Hz，2H)，6.47～6.52(m，2H)，6.15(t，J＝3Hz，1H)，5.14(s，2H)，3.64(s，3H)，2.87(s，6H)，2.68(d，J＝3Hz，3H)；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：170.05，168.20，166.41，158.43，156.44，149.75，148.98，144.04，143.67，138.98，135.71，135.17，134.79，129.63，129.26，129.07，128.34，127.65，127.18，126.91，125.81，125.37，124.81，124.38，118.57，112.58，101.04，52.35，51.46，29.44；HRMS(ESI)m/zcalcdforC37H35N3O3[M+H]+：570.2757；found：570.2663.采取同样的合成方法，由化合物8制备化合物Fex-4，产率45.11％，淡黄色固体。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)：7.80(s，1H)，7.45-7.56(m，6H)，7.35-7.38(m，3H)，7.27(s，1H)，7.22(d，J＝6Hz，1H)，7.07-7.13(m，2H)，6.97(m，2H)，6.77-6.83(m，3H)，6.21(d，J＝12Hz，1H)，5.19(s，2H)，3.75(s，3H)，3.01(d，J＝8.1Hz，12H)；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：170.01，167.10，166.41，149.74，149.31，143.95，143.65，139.00，135.12，134.99，134.79，129.63，129.24，129.04，128.41，128.35，127.18，126.91，125.85，125.69，125.37，124.94，124.55，118.57，116.48，112.57，104.91，52.32，51.45，39.99；HRMS(ESI)m/zcalcdforC38H37N3O3[M+H]+：584.2913；found584.2774合成路线如图1所示。聚合酶链式反应(PCR)验证化合物Fex-3和Fex-4可以激动FXR下游靶基因。具体过程如下：1.原代肝细胞给药浓度为50μM，给药24h后将细胞板从培养箱中取出，弃去原培养基并用PBS荡洗3次，而后加入1.0ml的RNAisoPlus，吹至液体澄清且无细胞团块，室温静置5min；2.向上述匀浆裂解液中加入氯仿160μl(RNAisoPlus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5min。而后于4℃，12000g离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min。12000g，4℃离心10min。离心后，试管底部出现白色沉淀，即为总mRNA。3.小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇(DEPC水配制)1.0ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，于4℃，12000g离心5min后小心弃去乙醇。4.室温干燥沉淀2-5min(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)，加入适量的DEPC水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，定量、逆转录或于-80℃保存。5.在UV板上，取200μlDEPC水加入空白孔中作为空白对照，其余各孔加入198μlDEPC水，再分别加入样品TotalRNA2μl，振荡混匀，以全波长荧光酶标仪中测定260nm，280nm，230nm，320nm等波长下的吸光值OD260，OD280，OD230，OD320。按照以下公式计算RNA纯度：RNA纯度＝OD260/OD280，该值在1.8-2.2范围内时认为RNA提取纯度较高，且没有降解；按照以下公式计算RNA浓度：RNA浓度＝(OD260-OD320)。6.逆转录(1)在冰浴环境中配制逆转录反应液，操作参照试剂盒说明书，引物序列如表1所示。表1PCR引物序列基因引物序列(正向)引物序列(反向)FXRTGGACTCATACAGCAAACAGAGAGTCTGAAACCCTGGAAGTCTTTTSHPCCTGGAGCAGCCCTCGTCTCAGAACACTGTATGCAAACCGAGGABSEPCACTGGCCTTCTGGTATGGTGCTTGTAGCCGTCTCCTGACCYP7A1CAGCCGAGTCCCTTAGCACCATCACCGCACAAGAATA注：10μl的反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。(2)逆转录反应条件37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。得到的逆转录反应液(即cDNA溶液)于-20℃保存备用，待RealTime-PCR实验用。聚合酶链式反应证明本发明中化合物Fex-3和Fex-4可以有效地激动FXR和其下游靶基因SHP、BSEP和CYP7A1。FXR是一种转录因子，可以调控下游多种基因，其中就包括了SHP、BSEP和CYP7A1。激动FXR可以下调CYP7A1的表达，上调SHP和BSEP基因的表达可以作为FXR的激动剂。实验结果如图2所示：Fex-3、Fex-4和Fex(fexaramine)相对于空白组(DMSO)可以作为激动剂显著性地调控FXR的三种下游靶基因。这说明，Fex-3和Fex-4都是FXR的激动剂。附图说明图1是新型FXR激动剂Fex-3和Fex-4的合成路线。图2是Fex-3、Fex-4和Fex(fexaramine)对FXR及其下游靶基因表达水平的影响。当前第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