一种重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白、ELISA检测试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白及用其制备的ELISA检测试剂盒。

背景技术：

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。截止到2015年，PED已蔓延到大多数养猪国家，在欧洲、东南亚、美洲地区(美国、加拿大、墨西哥)、日本、韩国等地成为世界性的养猪疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，PED已成为世界范围内养猪业共同关注并急需解决的问题。

目前，对PEDV的诊断方法主要有临床诊断、ELISA、RT-PCR等。其中，ELISA方法即酶联免疫吸附测定方法，即可检测抗原，能够直接检测出粪便中的抗原，也可以检测抗体，以评估猪场的PEDV疫苗免疫情况、感染猪的血清学诊断等，操作简单、便于大批样品的检测，适用于基层及实验室检测。

PDEV为单分子线状正链单股RNA，其5’端加帽，3’端为聚A尾，具有感染性。基因组包含有5’-UTR、3’-UTR和至少7个ORF。这7个ORF中有4个编码结构蛋白：纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、囊膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，另3个编码非结构蛋白：复制酶(replicase)1a、复制酶1b和ORF3蛋白。ORF3蛋白编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产生，与病毒的毒力有关。目前基于PEDV的M、N、S蛋白的ELISA诊断试剂盒均有报道，尚未有关于ORF3蛋白作为包被抗原的ELISA诊断盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白及用其制备的ELISA检测试剂盒。

本发明提供了一种重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了编码上述蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种重组质粒，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；优选地，所述重组质粒为重组pET-22b质粒。

本发明还提供了一种重组菌，它包含上述重组质粒；优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种制备权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于：它包含如下步骤：

a、取上述重组菌，接种到添加有终浓度为100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.6mmol/L，25～37℃诱导表达3～7h；

b、离心，收集菌体，分离纯化，即可。

本发明还提供了上述重组蛋白、上述核苷酸序列在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

本发明还提供了一种ELISA检测试剂盒，它是检测待检样品中的抗猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，以氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白为抗原。

其中，它还包括抗体包被液、洗涤液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液。

其中，所述抗体包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述封闭液为5％的脱脂牛奶；所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗；所述显色液为TMB显色液；所述终止液为浓度为2mol/L的H₂SO₄溶液。

本发明还提供了上述ELISA检测试剂盒在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

本发明提供的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，抗原性、免疫原性好；以ORF3蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测试剂盒，可以准确检测猪流行性腹泻病毒，同时本发明试剂盒的特异性强、灵敏度高、简单、快速，制备方法简单，成本低廉，为PEDV的诊断、普查和免疫检测提供一种新选择，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为ORF3基因产物RT-PCR鉴定结果图，M：DL2000；1：ORF3的RT-PCR产物；2：阴性对照。

图2为ORF3基因产物酶切鉴定结果图，M:DL10000；1:空载pET-22b(+)；2:pET-22b(+)-ORF3的酶切产物。

图3为ORF3蛋白二级结构图。

图4为ORF3蛋白不同诱导表达温度图，M：蛋白Marker；1：空载；2：37℃诱导；3：30℃诱导；4：25℃诱导。

图5为ORF3蛋白不同诱导表达IPTG浓度图，M：蛋白Marker；1：空载；2：0.8mm/L；3:1.0mm/L；4：1.2mm/L；5：1.4mm/L；6：1.6mm/L；

图6为ORF3蛋白不同诱导表达时间图，M：蛋白Marker；1：空载；2：3h；3：4h；4：5h；5：6h；6：7h。

图7为ORF3蛋白可溶性分析及纯化图，M：Marker；1：pET-22b(+)空载诱导后；2：重组蛋白诱导前；3：重组蛋白诱导后；4：破碎后上清；5：溶解后包涵体；6：纯化后ORF3蛋白。

图8为Western-blot结果图，M：Marker；1：目的蛋白；2：pET-22b(+)对照。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器如下：

1.1菌株及质粒

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)；pET-22b(+)原核表达载体均由本实验室保存；PEDV、TGEV、PRoV、PRSSV、APP、HPS阳性血清、PEDV阴性血清、发病猪血清均是由本实验室保存；

1.2主要试剂

MarkerⅢ、总RNA提取试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素、50mg/ml IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、2xTaqPCR Mastermix、TMB显色液、预染蛋白Marker III均购自天根生化有限公司；DL500、DL2000、DL5000、DL10000、Max DNA Polymerase、T4连接酶、PrimeScript RT reagent Kit、EcoR I和Xho I限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自OMEGA公司；SDS-PAGE试剂盒、5×蛋白上样缓冲液均购自北京索莱宝有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的兔抗猪IgG均购自上海生工有限公司；蛋白质印迹膜和滤纸、Precision Plus Protein^TMWesternC^TM、Clarity^TM Western ECL Substrate均购自Bio-Rad公司。

1.3主要仪器

Legend Micro 17R centrifuge离心机、Sorvall ST 16R高速冷冻离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司；MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、SmartspecTM Plus核酸蛋白仪、Model 680酶标仪，美国Bio-Rad公司；WaterPro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司。

实施例1本发明重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白的制备

一、实验方法

1.1ORF3基因的克隆及生物信息学分析

1.1.1引物设计

参照GenBank中CV777标准株，设计合成一对特异性引物，见表1，引物由上海英俊生物有限公司合成。

表1 ORF3表达引物

1.1.2 ORF3重组质粒的构建

以强毒阳性样品和弱毒疫苗株为材料，取小肠组织，按照总RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。

以提取的PEDV病毒总RNA为模板，以试剂盒中的Random 6mers为引物，进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：

反应程序：37℃，15min；85℃，5s；12℃保存。

以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR，PCR反应体系如下：

反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

扩增的PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳后，按照小量胶回收试剂盒的使用说明书进行DNA回收。

将胶回收的目的基因片段与pMD19-T simple vector在16℃过夜连接，反应体系如下：

将ORF3基因的连接产物转化DH5α感受态细胞，随机挑选Amp⁺LB平扳上的白色菌落，接种于5mL LB液体培养基(含Amp⁺100μL/mL)37℃培养过夜。进行RT-PCR鉴定，反应结束后取7μL PCR产物进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳分析，体系如下：

将ORF3扩增产物克隆于原核表达载体pET-22b(+)上，转化工程菌DH5α感受态细胞，得到阳性重组质粒。

将鉴定为阳性的菌液接种于5mL LB液体培养基(含Amp⁺100μL/mL)37℃培养过夜，按照OMEGA公司的小量质粒提取试剂盒提取重组质粒，经菌液PCR鉴定正确后，对重组质粒pET-22b(+)-ORF3进行EcoR I、Xho I双酶切鉴定，在37℃下进行酶切反应，反应时间3h，反应结束后取6μL酶切产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析，体系如下：

表2酶切反应体系

将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定。用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。

SEQ ID NO：2ORF3的核苷酸序列：

TTTTACTCCTGGCGCTATAAAAATGCGCTCTTTATTATTTTTAATACTACGACACTTTCTTTCCTCAATGGTAAAGCAGCTTATTATGACGGCAAATCCATTGTGATTTTAGAAGGTGGTGACCATTACATCACTTTTGGCAACTCTTTTGTTGCTTTTGTTAGTAGCATCGACTTGTATCTAGCTATACGTGGGCGGCAAGAAGCTGACCTACAGCTGTTGCGAACTGTTGAGCTTCTTGATGGCAAGAAGCTTTATGTCTTTTCGCAACATCAAATTGTTGGCATTACTAATGCTGCATTTGACTCAATTCAACTAGACGAGTATGCTACAATTAGTGAA

SEQ ID NO：1ORF3重组蛋白的氨基酸序列：

FYSWRYKNALFIIFNTTTLSFLNGKAAYYDGKSIVILEGGDHYITFGNSFVAFVSSIDLYLAIRGRQEADLQLLRTVELLDGKKLYVFSQHQIVGITNAAFDSIQLDEYATISE

1.1.3 ORF3基因编码蛋白的生物信息学分析

登录进入NCBI，采用Blastn和Blastx程序，进行同源性检索。同时对国内外PEDV ORF3基因的经典毒株和流行毒株进行核苷酸和氨基酸的比对。采用ProtScale、TMpred和PredictProtein蛋白质数据库对ORF3蛋白的跨膜区(transmembrane region)、亲水性(hydrophilic)、抗原性(antigenicity)和二级结构等理化性质进行分析。

1.2 ORF3蛋白的原核表达

1.2.1 ORF3蛋白的诱导表达

将正确插入目的基因的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养12h后，挑单克隆(同时设转化空载体质粒的大肠杆菌BL21为对照)置于5mL LB培养液中(含Amp⁺100mg/L)，37℃振摇过夜。次日，将其以1:100的比例振荡培养至OD₆₀₀＝0.5-0.7时，无菌取出lmL菌液作为诱导前对照，剩余的加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续振荡培养4h，12 000r/min离心2min收集菌体。弃上清，沉淀重悬后加入1/5总体积的5x蛋白上样缓冲液，充分混匀，沸水中加热5min，12 000r/min离心1min。

以未诱导菌体为对照，按照说明书进行SDS-PAGE电泳：

(1)分离胶的制备：制备5mL12％分离胶，含有以下成分：ddH₂O 1.75mL，30％Acr-Bis(29:1)2.0mL，分离胶缓冲液(4×)1.25mL，10％APS 0.05mL，TEMED 0.002mL。轻轻混匀，避免产生气泡。将其缓慢加入到已装配密封好的凝胶膜具中，当液面加至距前玻璃板顶端约1.5cm处时，在分离胶溶液上轻轻覆盖一层去离子水，使凝胶表面保持平整。静置30-60mmin，待分离胶凝固后(分离胶和水层之间出现一条清晰的界面)，去除覆盖在分离胶上的水层。

(2)浓缩胶的制备：制备2mL 5％的浓缩胶，含有以下成分：ddH₂O 1.14mL，30％Acr-Bis(29:1)0.34mL，浓缩胶缓冲液(4×)0.5mL，10％APS 0.02mL，TEMED 0.002mL。轻轻混合，避免产生气泡。将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端，将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置10-20min，，浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子，避免破坏加样孔。

(3)将凝胶模具固定于电泳装置上，置于电泳槽内，加入足够量的电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

(4)上样：用微量注射器在电泳孔中分别加入10μL蛋白样品。

(5)电泳：浓缩胶电泳时电压为80V，到分离胶后，将电压调至120V，继续电泳，当溴酚蓝跑到底部时停止电泳。

(6)卸下凝胶，考马斯亮蓝染色液染色2h，再用脱色液脱色过夜或沸水煮至条带清晰可见，凝胶成像仪拍照观察结果。

1.2.2 ORF3蛋白诱导表达优化

1.2.2.1诱导表达浓度的优化

将含重组质粒的表达菌以1:100的比列接种于含Amp⁺的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，分别加入IPTG，至其最终浓度为：0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L诱导培养4～6h左右，分别吸取菌液1mL，制备上样样本(12 000r/min离心1min，弃上清，用40μL超纯水重悬菌体，加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，煮沸10min，12 000r/min离心10min)，SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.2.2诱导表达时间的优化

将重组表达菌以1:100的比例接种于含Amp⁺的LB液体培养基中，待培养至OD₆₀₀＝0.6左右后，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳IPTG浓度，分别在诱导3h、4h、5h、6h、7h后，各取菌液1mL，制样，SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.2.3诱导表达温度的优化

将重组表达菌以1:100的比列接种于含Amp⁺的LB液体培养基中，待培养至菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，在上述试验得出的最佳IPTG浓度和最佳诱导时间时，分别在25℃、30℃、37℃诱导培养，分别取菌液1mL，制备样品，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

1.2.3表达蛋白可溶性分析

将含有重组质粒的表达菌接种于1000mL含Amp⁺的LB肉汤中，37℃振荡培养(220r/min)至OD₆₀₀＝0.6左右，在最佳诱导条件下诱导培养。将培养后的菌液4℃8000r/min离心10min，弃上清，沉淀用pH8.0 50mMTris-HCl洗涤并悬浮2～3次。冰浴条件下，超声破碎菌体(超声5min，超2s，停3s，功率200W，破碎8次)。将破碎后的菌体在4℃条件下12000r/min离心10min，分离沉淀与上清；沉淀用适量包涵体洗涤液重悬后，搅拌20-30min，于4℃12 000r/min离心15min，弃上清重复二次。在用适量pH8.0 50mM Tris-HCl溶液洗涤1～2次，于4℃12 000r/min离心15min，弃上清。将洗涤后的沉淀加入适量的包涵体溶解液溶解。对上清和沉淀(溶解于8M尿素后，以12 000r/min离心10min后离心取上清)各取40μL，分别加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸10min，12 000r/min离心10min，小心吸取上清进行SDS-PAGE电泳，分析pET-22b(+)-ORF3蛋白在菌体中是表达为包涵体或是可溶物。

1.2.4重组蛋白的纯化

将含重组质粒的BL21菌落接入含有Amp⁺(100μg/mL)的1L LB培养液中，在25℃、IPTG1.4mm/L条件下诱导培养4h后，对重组菌诱导表达，获得重组蛋白菌液，进行蛋白纯化。具体步骤如下：

(1)取已经过夜压实的镍离子亲和层析柱，用含8M尿素的上样Buffer平衡5-10个床体积；

(2)将溶于8M尿素的样品于0.22μm滤膜过滤；

(3)用上样Buffer洗5-10个床体积；

(4)用含不同梯度的咪唑洗脱液(含8M尿素)进行洗脱，并收集各洗脱峰；

(5)用1M NaOH洗脱液清洗值平衡，再用20％的乙醇洗涤，将柱子于4℃保存。

(6)将蛋白用超滤管进行超滤和浓缩，期间加入灭菌PBS进行Buffer的置换，以除去原先的Buffer中的尿素和咪唑等杂质；

(7)蛋白浓缩后，用核酸蛋白仪对蛋白质进行定量，并冻存于-80℃。超滤管以0.2M的NaOH进行清洗后，再以超纯水进行清洗、浸泡保存。

1.2.5 Westernblot检测

按照1.2.1方法制备蛋白质电泳凝胶，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。

(1)SDS-PAGE电泳结束后，切取相应的凝胶部位，置于超纯水中清洗。

(2)将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)甲醇激活30s，再和滤纸置于Transfer Buffer中平衡15min。

(3)按照阴极电极板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸顺序放置于Bio-Rad半干式转印槽内，各层之间保证对齐，并用玻棒排除所有气泡，后盖上阳极电极板。

(4)将电转移装置接到电转仪上，25V转移25min。

(5)转移结束后，逐一揭开各层，取出PVDF膜，浸泡在适量的封闭缓冲液中，于4℃封闭过夜。

(6)封闭结束后，按每平方厘米0.1mL滴加经一抗液1：500稀释的一抗(猪PEDV阳性血清)，室温孵育2h，弃一抗并用TBST Buffer洗膜3次，5min/次。

(7)按每平方厘米0.1mL滴加1:2000稀释后的HRP标记的兔抗猪IgG(其中加了化学发光试剂1:10 000)，室温孵育2h，弃一抗并用TBST Buffer洗膜3次，5min/次。

(8)准备Western working solution(Western ws)：试剂A和试剂B1:1混匀，以0.1mL Western ws/cm²浸透PVDF膜，孵育1min。

(9)在凝胶成像仪上进行照相。

二、实验结果

2.1 pET-22b(+)-ORF3重组质粒鉴定

用设计的1对特异性引物分别进行RT-PCR，产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为342bp的特异性扩增片段，与预期结果一致(图1)。将ORF3扩增产物克隆于原核表达载体pET-22b(+)上，转化工程菌DH5α感受态细胞，得到阳性重组质粒。经双酶切鉴定后出现2条带，一条与扩增带大小一致，另一条约为5.5kb、为pET-22b(+)载体带(图2)。

2.2 ORF3基因编码蛋白的生物信息学分析

2.2.1 ORF3遗传进化分析

将国内外已经发表的15株PEDV(表3)序列进行核苷酸和推导的氨基酸序列比较。结果表明，ORF3基因在核苷酸和氨基酸序列比对后，ORF3基因核苷酸同源性为95％-99.9％，氨基酸同源性为93.3％-100％。

表3用于序列遗传进化分析的PEDV参考毒株信息

2.2.2 ORF3蛋白理化性质

ORF3蛋白理化性质分析结果表明：分子量为25.2023KD，等电点理论值为6.71。原子总数为3584，原子组成为C:1173；H:1803；N:281；O:319；S:8，分子式为C₁₁₇₃H₁₈₀₃N₂₈₁O₃₁₉S₈，氨基酸组分如表所示(表4)。其中Leu(13.4％)、Ala(8.5％)、Ile(8.5％)、Phe(8.5％)、Val(7.6％)、Ser(7.1％)等含量较高，而His(0.9％)、Met(0.9％)、Pro(0.9％)、Trp(0.4％)等含量相对较少。不稳定系数是25.46，是一个稳定蛋白。

表4ORF3蛋白的氨基酸组分分析

2.2.3 ORF3蛋白跨膜区及亲水性分析

ORF3蛋白跨膜区结果表明，ORF3蛋白存在5个跨膜区域，且得分都高于预测阈值500分(表5)；ORF3蛋白亲水性预测结果表明在氨基酸序列从第15位到220位之间都存在亲水区域，但是在第64-65位、114-116位、137-139位、176-179位极易形成亲水区域(表6)。

表5ORF3蛋白跨膜区分布

表6 ORF3蛋白亲水性分布

2.2.4 ORF3蛋白抗原表位分析

ORF3蛋白在线分析，结果显示该蛋白有9个抗原表位(表7)，该蛋白平均预测值为1.0736，高于该软件说明的1.0，表明该蛋白这些区段具有抗原性。

表7 ORF3蛋白抗原表位分布

2.2.5 ORF3蛋白二级结构预测

预测结果表明(图3)，在氨基酸序列的第1-5位、16-27位、37-38位、42-44位、61-67位、90-93位、117-118位、126位、134位、138-143位、149-150位、157-158位、166-167位、176-181位、191-193位、200-202位、209-212位、217-224位易形成无规则卷曲，占32.6％；在氨基酸序列的第13-15位、28-36位、39-41位、68-69位、111-116位、119-125位、127-133位、135-137位、144-148位、151-156位、159-165位、168-175位、182-190位、194-199位、203-208位、213-216位易形成β-片层，占40.6％；在氨基酸序列的6-12位、45-60位、70-89位、94-110位易形成α螺旋，占26.8％。

2.3 ORF3蛋白的原核表达鉴定

2.3.1表达条件优化

将振荡培养至OD600＝0.5-0.7时的空载及含重组质粒的菌液分别取1mL，观察分析用pET-22b(+)在不同条件下诱导表达该蛋白，将pET-22b(+)空载作为空白对照。目的蛋白分别在25℃(图4)、IPTG浓度1.2mmol/L(图5)、诱导时间4h(图6)条件下诱导时，蛋白表达量最大。

2.3.2 ORF3截短蛋白的亲和层析纯化

经过优化后，选定25℃、诱导时间4h、诱导浓度1.2mmol/L条件进行大量诱导表达，蛋白主要以包涵体形式存在，收集菌体后用相关溶液与方法将包涵体蛋白溶解；根据Ni+-NTA亲和层析说明书进行纯化，得到纯化的目的蛋白18KDa左右，质量浓度3mg/mL。(图7)。

2.3.3重组蛋白Western-blot鉴定分析

利用半干式电转仪，在25V、30min条件下进行Western-blot，分析可见，在Mr＝20KDa下方可见一条清晰的条带(图8)，与预期蛋白大小相符。2.3.4重组蛋白含量测定

将纯化后的重组蛋白1:50稀释后，经紫外分光光度法测得OD₂₈₀＝0.082，OD₂₆₀＝0.065，OD₂₈₀/OD₂₆₀＝1.26<1.5。

蛋白含量mg/mL＝(1.45×OD₂₈₀nm-0.74×OD₂₆₀nm)×稀释倍数＝3.54mg/mL。

申请人前期进行了ORF3全长原核表达研究，进行了外部诱导条件及多种载体的选择，表达效果都不理想，几乎不能进行表达。而本发明根据特定引物扩增并得到的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，表达良好，且该蛋白具有良好的抗原性。

实施例2本发明ELISA检测试剂盒的制备

一、实验方法

1.1间接ELISA检测方法的建立

1.1.1间接ELISA方法的操作程序

(1)包被：将重组蛋白抗原用碳酸盐缓冲液((pH9.6，配制方法如下：取1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加去离子水定容至1000mL)稀释到一定倍数，100μL/孔加入到96孔聚苯乙烯酶联反应板中，4℃包被过夜。拍干包被液，用PBST洗涤包被板3次，250μL/孔，每次3min，用吸水纸拍干。

(2)封闭：用5％脱脂牛奶封闭反应孔，100μL/孔，于37℃作用120min，拍干封闭液，用PBST洗涤包被板3次，250μL/孔，每次3min，用吸水纸拍干。

(3)加样：加入用抗体稀释液PBS(PBS配制如下：取NaCl 8g，KCl 0.2g,KH₂PO₄0.2g,Na₂HPO₄ 2.84g，加入去离子水定容至1000mL，调节pH至7.4)稀释到一定倍数的血清，100μL/孔，于37℃作用30min后拍干，用PBST洗涤包被板3次，250μL/孔，每次3min，用吸水纸拍干。

(4)加酶标二抗：加入用抗体稀释液稀释到一定倍数的酶标二抗，100μL/孔，于37℃作用30min后拍干，用PBST洗涤包被板5次，250μL/孔，每次3min，用吸水纸拍干。

(5)加底物：加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应10min。

(6)终止反应：加入终止液(即2mol/L H₂SO₄)终止反应，50μL/孔。

(7)OD₄₅₀值的测定：将96孔酶联反应板置于酶标仪上，由系统自动检测结果。

1.1.2间接ELISA检测方法条件优化

1.1.2.1抗原包被浓度与血清稀释比的优化

采用方阵滴定法确定重组蛋白的最佳工作浓度和待检血清的最佳稀释倍数。纯化后的ORF3蛋白用碳酸盐缓冲液稀释到浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL，按100μL/孔包被酶联反应板，每个稀释度重复8孔。PEDV阴、阳性血清分别按1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的比例倍比稀释，每个血清稀释度对应5个抗原包被浓度。将辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG稀释2000倍。按照间接ELISA方法的操作程序，用酶标仪测定每孔OD₄₅₀读数，计算P/N(阳性/阴性)值。

1.1.2.2酶标二抗工作浓度的优化

以重组蛋白的最佳工作浓度包被ELISA板，封闭，加入最适稀释倍数的阴性、阳性血清，将酶标二抗按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000的比例倍比稀释，按照间接ELISA方法的操作程序，检测已知的PEDV阴阳性血清，每个二抗稀释度重复两孔，酶标仪测定每孔OD₄₅₀值，计算P/N值，以确定酶标二抗最佳稀释度。

1.1.2.3封闭液的选择

分别用5％脱脂牛奶、1％明胶、1％BSA作封闭液，进行ELISA检测，根据P/N值评价封闭效果

1.1.2.4 ORF3重组蛋白间接ELISA检测程序的确定

根据间接ELISA原理，确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数和最佳封闭液，建立ORF3蛋白的间接ELISA程序。

1.1.2.5间接ELISA阴阳性判定标准的确定

取实验室保存的48份猪阴性血清用建立的间接ELISA方法进行检测，每个样品重复2次，测定OD₄₅₀值，取其平均值。根据统计学原则48份阴性血清平均OD₄₅₀值(X)加上3倍标准差(S)即为阴阳性的临界值(根据下述文献确定：郑逢梅，PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立，中国兽医学报，2014年03期)，当样本的OD₄₅₀大于阴阳性临界值时，可在99.9％的水平上判为阳性，反之则为阴性。

1.1.2.6特异性检测

按本实验建立的间接ELISA方法，在同一条件下分别对TGEV、PRoV、PEDV、PRSSV、APP、HPS的标准阳性血清及猪阴性血请进行检测，同时设PEDV的阳性、阴性血清和空白对照。测定OD₄₅₀，进行结果判定。

1.1.2.7敏感性实验

取PEDV阳性血清做1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释，用已建立的间接ELISA方法检测PEDV阳性血清效价。

1.1.2.8重复性检测

(一)批内重复性试验

用同一批ELISA板，应用建立好的ELISA方法对6份阳性血清，1份阴性血清进行检测，每份样品重复3孔，记录OD₄₅₀值并计算出平均值(X)和标准差(SD)，由此计算批内变异系数(CV＝SD/X×100％)，若CV<5％，则判定重复性好。

(二)批间重复性试验

用4块不同批次的ELISA板，应用建立好的ELISA方法同时对6份PEDV阳性血清，1份PEDV阴性血清进行检测，记录OD₄₅₀值并计算出平均值(X)和标准差(SD)，由此计算批间变异系数(CV＝SD/X*100％)，若CV<10％，则判定重复性好。

1.1.2.9保存期试验

按照最佳抗原浓度包被酶标板，封闭后4℃保存，一个月后对已知阳性、阴性样品进行检测，根据OD₄₅₀的变化确定试剂盒的保存期。

1.1.2.10间接ELISA方法的临床应用

对采集自四川的467份血清样品用建立的间接ELISA方法检测，并设PEDV阴、阳性血清对照，在酶标仪上读出OD₄₅₀值。

二、实验结果

2.1 ELISA检测方法的建立

2.1.1抗原与血清最佳工作浓度的确定

用稀释度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL的重组ORF3蛋白分别与稀释倍数为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640的待检血清进行方阵滴定试验，结果显示：当包被抗原浓度0.625μg/mL，待检血清稀释倍数为1:20时，检测得到的P/N值高达3.161，为最佳检测效果。因此，抗原的最佳工作浓度定为0.625μg/mL，待检血清的最佳稀释倍数定为1:20(表8)。

表8抗原和血清最佳工作浓度的确定

2.1.2最佳封闭液的确定

按照上述确定好的条件包被抗原，分别用5％的脱脂牛奶、1％的BSA和5％的明胶进行封闭，结果显示最佳的封闭液为5％的脱脂牛奶(参见表9)。

表9最佳封闭液的确定

2.1.3 HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度的确定

以最佳包被浓度的抗原包被酶标板，加入最佳稀释倍数的阴阳性血清进行反应，分别选择HRP-兔抗猪IgG的稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行反应。结果显示最佳的HRP-兔抗猪IgG稀释度为1:2000(参见表10)。

表10酶标二抗最佳稀释倍数的确定

2.1.4最佳封闭时间的确定

在其他反应条件都不变的情况下，利用浓度为1％的BSA分别封闭30min、60min、90min、120min后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示最佳的封闭时间是2h(参见表11)。

表11最佳封闭时间的确定

2.1.5最佳血清孵育时间的确定

在其他反应条件均不变的情况下，将血清分别孵育30min、60min、90min、120min后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示血清的最佳孵育时间为30min(参见表12)。

表12最佳抗体孵育时间的确定

2.1.6 HRP-兔抗猪IgG最佳孵育时间的确定

在其他反应条件均不变的情况下，将HRP-兔抗猪IgG分别孵育30min、60min、90min、120min后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示最佳的HRP-兔抗猪IgG孵育时间为30min(参见表13)。

表13酶标兔抗猪IgG最佳孵育时间的确定

2.1.7判断标准的确定

用本实验建立的间接ELISA方法检测48份猪阴性血清，由表14可以计算出阴性血清的平均值X＝0.084，标准方差S＝0.010，则X+3S＝0.114，所以当样本的OD₄₅₀≥0.114时为阳性，反之则为阴性。

表14判断标准的确定

2.1.8特异性试验

以本实验构建的间接ELISA检测方法，在相同条件下分别对TGEV、PRoV、PEDV、PRSSV、APP、HPS的标准阳性血清、猪阴性血清进行检测，结果显示除PEDV阳性血清外，其余血清的OD₄₅₀值皆小于0.114，表明所构建的间接ELISA检测方法无血清学交叉反应(参见表15)，特异性好。

表15特异性试验

2.1.9灵敏性试验

取PEDV阳性血清做1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释，用已建立的间接ELISA方法检测PEDV阳性血清效价，最低可检测到1:1280，灵敏性高。

表16敏感性试验

2.1.10重复性试验

(一)批内重复性试验

由表17显示：6份阳性血清以及1份阴性血清的变异系数在2.07％～2.90％，均小于5％，这表明用同一批ELISA板检测同一样品时变异程度较小，重复性良好。

表17批内重复性试验结果

(二)批间重复性试验

用不同批次的ELISA板检测6份阳性血清以及1份阴性血清，变异系数在1.96％～4.20％，均小于10％，这表明用不同批次ELISA板检测同一样品时变异程度较小，重复性良好。

表18批间重复性试验结果

2.1.11间接ELISA的临床应用

用本研究建立的间接ELISA方法对本实验室从2015年-2016年采集四川地区的467份血清样品进行检测，结果显示血清的总阳性率为78.8％(表19)。

表19 PEDV临床样品检测结果

实验结果说明，本发明重组ORF3蛋白组成的试剂盒可以准确检测临床样品中的猪流行性腹泻病毒。

实施例3本发明重组ORF3的免疫原性检测

一、实验方法

1.1蛋白乳剂苗的制备

在波长260nm和280nm处，核酸蛋白仪测得光密度值，OD₂₈₀/OD₂₆₀<1.5时，用Lowry-Kalokar公式计算：蛋白含量mg/mL＝(1.45×OD₂₈₀nm-0.74×OD₂₆₀nm)×稀释倍数。蛋白与佐剂1：1的比例混合后与冰浴中超声，得到油包水形式的疫苗。

1.2免疫程序

将乳化好的蛋白油乳剂苗按如下方式免疫家兔：

1.3间接ELISA检测高免血清的效价

按照常规间接ELISA步骤进行高免血清的效价测定。抗原包被酶标版，每孔100μL，4℃过夜，取出后洗涤3次，5min/次。再用含5％脱脂牛奶的PBST 100μL/孔，37℃封闭2h，洗涤同前。加一抗(为来自生工公司的兔抗猪IgG)100μL/孔于37℃放置1h，取出后洗涤同前。接着加入羊抗兔酶标二抗(浓度作1:2000稀释)100μL/孔，于37℃作用1h，随后洗涤同前。继而向每孔中加入100μLTMB，于37℃作用15min，最后加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。在酶标仪上检测OD₄₅₀值。

二、实验结果

2.1多抗高免血清效价测定

将免疫家兔第四次后获得的高免血清用已经建立的ELISA检测方法测定效价，将高免血清进行倍比稀释(1:1000～1:32768000)，根据(样品OD₄₅₀一空白OD₄₅₀)/(阴性OD₄₅₀一空白OD₄₅₀)≥2.1即为阳性，表20显示最高可测得的效价为1:256000。

表20多抗血清效价测定结果

本实验表明，制备得到的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，具有良好的免疫原性。

本发明的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，可以与免疫学上可接受的辅料组合，制备成疫苗使用。

综上，本发明提供的重组猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白，抗原性、免疫原性好；以ORF3蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测试剂盒，可以准确检测猪流行性腹泻病毒，同时本发明试剂盒的特异性强、灵敏度高、简单、快速，制备方法简单，成本低廉，临床应用前景良好。