一种从动物软骨组织提取RNA的方法与流程

本发明涉及rna提取方法，特别涉及一种从动物软骨组织提取rna的方法。
背景技术：
：胫骨生长板基质较多，细胞较少，基质含有大量的胶原蛋白以及不少粘多糖，其中ii型胶原富含羟赖氨酸，而羟赖氨酸的羟基几乎全部与糖结合，因而糖化率高，故胫骨生长板基质主要成分有相当部分是多糖类物质，由于多糖的理化性质与核糖核酸rna非常相似，在沉淀rna时，蛋白多糖和rna一块无区分的沉淀下来，产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的rna沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，这样的rna由于多糖的干扰无法进行后续的各种分子生物学试验，并且组织rna含量相对较低（相比于机体其它组织，如肝，肾），去除多糖的同时rna也被带走，这就造成rna量过度减少，从胫骨生长板中提取高纯度、高质量rna非常困难，直接影响后续的研究工作。鸡是最广泛食用的肉禽之一，与人类关系尤为密切，人各种骨骼疾病的治疗一直是医学界面临的难题，由于鸡胫骨生长板发育特点，鸡是研究骨骼疾病很好的一个模式动物，因而研究鸡胫骨生长板中基因的功能至关重要，从基因水平对骨组织进行研究意义重大，而获得高质量、高纯度的rna是进行各种分子生物学研究的基础和关键。中国专利cn101182343动物关节软骨组织总rna提取方法，在用于提取胫骨生长板总rna时，由于过程繁琐，所以会导致rna得率降低，而有机试剂的频繁使用会造成rna有机溶剂残留，并且，plantrnaout试剂盒的使用，大大增加了提取成本。中国专利cn102250889从关节软骨中提取rna方法，在用于提取胫骨生长板总rna时，同样存在步骤过多，操作麻烦，成本过高，提取率低的缺点。为了解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种可高效的动物软骨组织，尤其适用于从胫骨中提取高纯度rna的方法。技术实现要素：为了解决胫骨由于多糖类物质含量高，rna提取困难的问题，而提供了一种从动物软骨组织提取rna的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：一种从动物软骨组织提取rna的方法，步骤为：从动物软骨组织用trizol试剂提取rna，加入氯仿和异戊醇混合液，取上清液，加入氯化钠溶液和异丙醇，获得沉淀rna后用depc水溶解，并加入乙醚，离心取下清液，再加入乙醚、氯化钠、和异丙醇，冰水浴沉淀后进行离心，乙醇清洗，用depc水溶解，沉淀即得。所述的动物软骨组织为鸡胫骨生长板、鸡关节软骨、小鼠胫骨生长板，优选为鸡胫骨生长板。所述的每0.1g动物软骨组织用1ml的trizol试剂提取，研磨后转移至离心管，再加入200ul氯仿混匀，室温静置5min，4℃下离心吸取上清液，加入氯仿和异戊醇混合液。氯仿和异戊醇混合液中的氯仿：异戊醇的体积比为24：1。所述的下清液加入乙醚、氯化钠、和异丙醇后，冰水浴沉淀时间和离心时间均为10min。所述的氯化钠溶液的浓度为5mol/l。基于酸酚/胍盐原理的总rna抽提方法是动物组织、细胞核酸分离的主要方法，如一步法、trizol法等，由于胫骨生长板的特殊结构与关节软骨类似，含有大量的细胞外基质蛋白与蛋白质多糖，因此发明人研发了从动物软骨组织，尤其是适用于胫骨生长板提取总rna的方法，以克服现有技术存在的上述不足。本发明提取动物软骨组织rna的步骤，首先组织加液氮研磨成粉末状态以后，加入trizol试剂继续研磨，以达到使软骨细胞充分从基质中释放出来的目的，将溶液转移至离心管中，加入氯仿混匀，室温静置5min，4℃下离心吸取上清液，加入氯仿，异戊醇混合液，混匀置于室温5min；4℃下离心，取上清液，加入氯化钠、异丙醇混合液，置于冰水浴上沉淀10min，离心10min，得到凝胶状rna和蛋白多糖混合沉淀，乙醇清洗一次，depc水溶解沉淀，加入乙醚；4℃下离心，取下清液，加入乙醚，氯化钠，异丙醇混合液，置于冰水浴上沉淀10min，离心5min，乙醇清洗一次，depc水溶解沉淀，得到总rna溶液。本发明加液氮研磨成粉末状态以后，加入trizol试剂继续研磨，已达到使软骨细胞充分从基质中释放出来的目的；用乙醇清洗，减少了盐离子以及有机溶剂的污染，depc水溶解沉淀后，加入乙醚进行多糖的去除，再次沉淀的同时加入乙醚，高浓度氯化钠，rna在高盐浓度环境下进入水相，沉淀，而多糖类物质进入乙醚相，从而获得高纯度rna。实验表明采用本发明方法可大大的提高提取rna的数量和质量，并且所得rna特性没有发生任何改变，同时，应用本发明方法也可以应用于鸡关节软骨总rna的提取，其中采用常规trizol法、经典加高盐法、和本发明方法提取鸡胫骨生长板rna的结果如表1所示，表1方法样品od260/280od260/230电泳图结果常规trizol法鸡胫骨生长板（0.05g）1.70.64如图1所示，无28s\18s条带，点样孔见荧光条蛋白多糖与蛋白污染经典加高盐法鸡胫骨生长板（0.05g）1.900.93如图2所示，无28s\18s条带，点样孔见荧光条蛋白多糖污染本发明方法鸡胫骨生长板（0.05g）1.952.15如图3所示，28s\18s条带清晰，28s无降解，点样孔未见荧光条无污染，完整性好，获得高质量的rna从表1可以看出，常规trizol法提取rna蛋白存在多糖污染，经典去除多糖法提取rna多糖污染，而本发明方法提取rna高质，高量，完整性好，符合分子生物学试验要求。综上所述，本发明方法简单，成本低廉，耗时短，提取数量和质量高，应用广泛，不仅适用于胫骨生长板rna提取，也可以应用于软骨组织或其他部位骨组织rna的提取。附图说明图1为常规trizol法提取鸡胫骨生长板rna电泳图；图2为经典加高盐法提取鸡胫骨生长板rna电泳图；图3为本发明方法提取鸡胫骨生长板rna电泳图；图4为本发明方法提取小鼠胫骨生长板rna电泳图；图5为本发明方法提取鸡关节软骨rna电泳图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1鸡胫骨生长板总rna提取（1）将存储于-80℃低温下的鸡胫骨生长板0.05g放入盛有液氮的研钵中，进行充分研磨至粉末状，随后加入0.5mltrizol试剂（invitrogen、tankara等），待转变为溶液时继续充分研磨，时间为1min；转移研钵中溶液至1ml离心管（无rnase、无菌）中，用力混匀，静置5min后，加入100ul氯仿，剧烈震荡混匀，静置5min，于4℃，12000r/min，离心15min，小心取上清，转移至另一个离心管，加入100ul氯仿、异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比为24：1），充分混匀，静置5min；（2）于4℃，12000r/min，离心15min，将上清转移至另一个离心管，加入上清液0.5倍体积5mol/l氯化钠溶液，等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10min，于4℃，12000r/min，离心10min，小心弃掉上清，加入0.5ml75%乙醇，将沉淀悬浮，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入150uldepc水充分溶解，得到胶状溶液，加入200ul乙醚，充分混匀，静置5min；（3）于4℃，12000r/min，离心5min，将下清液转移至另一离心管中，加入下清液0.5倍体积5mol氯化钠溶液，等体积乙醚，等体积异丙醇，充分混匀后，静置10min，于4℃，12000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入0.5ml75%乙醇，悬浮沉淀，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，干燥5min，加入15uldepc水充分溶解，保存于-80℃，即得。实施例2鸡关节软骨rna提取（1）将存储于-80℃低温下的鸡关节软骨0.05g放入盛有液氮的研钵中，进行充分研磨至粉末状，随后加入0.5mltrizol试剂（invitrogen、tankara等），待转变为溶液时继续充分研磨，时间为1min；转移研钵中溶液至1ml离心管（无rnase、无菌）中，用力混匀，静置5min后，加入100ul氯仿，剧烈震荡混匀，静置5min，于4℃，12000r/min，离心15min，小心取上清，转移至另一个离心管，加入100ul氯仿、异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比为24：1），充分混匀，静置5min；（2）于4℃，12000r/min，离心15min，将上清转移至另一个离心管，加入上清液0.5倍体积5mol/l氯化钠溶液，等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10min，于4℃，12000r/min，离心10min，小心弃掉上清，加入0.5ml75%乙醇，将沉淀悬浮，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入150uldepc水充分溶解，得到胶状溶液，加入200ul乙醚，充分混匀，静置5min；（3）于4℃，12000r/min，离心5min，将下清液转移至另一离心管中，加入下清液0.5倍体积5mol氯化钠溶液，等体积乙醚，等体积异丙醇，充分混匀后，静置10min，于4℃，12000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入0.05ml75%乙醇，悬浮沉淀，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，干燥5min，加入15uldepc水充分溶解，保存于-80℃，即得。实施例3小鼠胫骨生长板总rna提取（1）将存储于-80℃低温下的小鼠胫骨生长板0.05g放入盛有液氮的研钵中，进行充分研磨至粉末状，随后加入0.5mltrizol试剂（invitrogen、tankara等），待转变为溶液时继续充分研磨，时间为1min；转移研钵中溶液至1ml离心管（无rnase、无菌）中，用力混匀，静置5min后，加入100ul氯仿，剧烈震荡混匀，静置5min，于4℃，12000r/min，离心15min，小心取上清，转移至另一个离心管，加入100ul氯仿、异戊醇混合液（氯仿：异戊醇体积比为24：1），充分混匀，静置5min；（2）于4℃，12000r/min，离心15min，将上清转移至另一个离心管，加入上清液0.5倍体积5mol/l氯化钠溶液，等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10min，于4℃，12000r/min，离心10min，小心弃掉上清，加入1ml75%乙醇，将沉淀悬浮，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入[t2]depc水充分溶解，得到胶状溶液，加入200ul乙醚，充分混匀，静置5min；（3）于4℃，12000r/min，离心5min，将下清液转移至另一离心管中，加入下清液0.5倍体积5mol氯化钠溶液，等体积乙醚，等体积异丙醇，充分混匀后，静置10min，于4℃，12000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，加入0.5ml75%乙醇，悬浮沉淀，小心反复吹打，于4℃，8000r/min，离心5min，将上清小心弃掉，干燥5min，加入15uldepc水充分溶解，保存于-80℃，即得。从表2可以看出，本发明方法可用于各种动物软骨组织rna的提取，且高质，高量，完整性好，符合分子生物学试验要求。当前第1页12