本发明涉及凝血酶提取，特别涉及一种猪血凝血酶的制备方法。
背景技术：
凝血酶是参与机体凝血过程的一个重要的凝血因子，在体内以凝血酶原形式存在。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后，美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等。从动物血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副作用的优点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾病和血栓性疾病的临床检测。
目前，临床上应用的凝血酶产品，主要是从人血、猪、牛等动物血中分离提取的，其中，由于猪血的来源充分，原料成本低等因素，所以大部分凝血酶是从猪血中分离提取的，少部分是从人血及牛血等血液中分离提取的。
申请公开号为cn103160486a的专利公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括：首先分离猪血浆，将血浆进行化学法病毒灭活；按照猪血浆总重量的1.5％加入离子交换树脂进行凝血酶原的吸附，在室温下吸附40～60min后用滤布过滤收集离子交换树脂，洗涤离子交换树脂，弃去洗涤液，然后将经洗涤液洗涤的离子交换树脂，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析，去除多余的盐类物质，得到凝血酶原溶液，将凝血酶原溶液用孔径为20nm的过滤器进行过滤，收集滤液进行凝血酶原活化制备凝血酶的冻干保存。然而该制备方式仅仅在开始时候进行去病毒处理，这种处理方式在后期需要始终保持产品处于无菌状态下，增大了操作难度，不利于工业化生产，容易限制凝血酶产品的临床应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猪血凝血酶的制备方法，简化生产工艺，降低了猪血凝血酶提取的操作难度，使其适用于工业生产。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种猪血凝血酶的制备方法，包括如下步骤：
step1.在猪血中加入柠檬酸三钠溶液至柠檬酸三钠在混合液中的浓度为0.2～0.3g/l，搅拌均匀，调节ph至6.5-7.5之间，得猪血-柠檬酸三钠混合液；
step2.将step1所得猪血-柠檬酸三钠混合液在4℃下离心分层，滤去残渣，得到猪血血浆；
step3.向step2所得猪血血浆中加入干粉状的阴离子交换剂，搅拌吸附40～90min后，滤去上清液，得到吸附有凝血酶原的阴离子交换剂，将其洗涤后装入洗脱柱；
step4.配制浓度为2～3mol/lnacl-0.01～0.03mol/l柠檬酸三钠混合溶液作为洗脱液，向step3中装有阴离子交换剂的洗脱柱中加入洗脱液，对吸附有凝血酶原的阴离子交换剂进行洗脱，收集含凝血酶原的洗脱液；
step5.将sepharoseg-50经过预处理后装入脱盐柱，将step4所得含凝血酶原的洗脱液加入脱盐柱脱盐，除去溶剂，得到吸附有凝血酶原的脱盐柱；
step6向step5所得吸附有凝血酶原的脱盐柱中加入nacl溶液洗脱，监测从脱盐柱中洗脱下来的洗脱液的电导率，并收集电导率在0.3～0.4x104us/cm之间的脱盐液，得到含凝血酶原的脱盐液；
step7在step6收集到的脱盐液中加入cacl2溶液至cacl2溶液浓度稀释至0.03～0.08mol/l，静置至界面稳定，得到含凝血酶的激活液；
step8将step7所得含凝血酶的激活液离心至激活液分层，滤去残渣后，对滤去残渣的激活液进行去病毒处理，得到凝血酶溶液。
通过采用上述技术方案，将柠檬酸三钠溶液加入猪血中，与猪血中的钙离子络合，能够起到抗凝作用，避免猪血凝结成块，并使凝血酶以凝血酶原的形态存在，随后过滤，得到含有凝血酶原的上清液，通过deae-sepharosea-50吸附凝血酶原，用nacl溶液对deae-sepharosea-50进行清洗，以提高凝血酶原的纯度，之后通过nacl-柠檬酸三钠混合溶液进行洗脱，将凝血酶原洗脱，得到含有凝血酶原的洗脱液，通过将洗脱液脱盐，电导率在0.3～0.4x104us/cm之间的脱盐液即为未激活凝血酶原溶液，通过cacl2溶液将凝血酶原激活，即可得到激活后的凝血酶溶液，通过对激活液进行去病毒处理，即可得到纯度较高的凝血酶产品，通过上述步骤，能够有效降低凝血酶中的杂蛋白、病毒等杂质，提高凝血酶纯度，简化生产工艺，降低了猪血凝血酶提取的操作难度，使其适用于工业生产。
作为优选，一种猪血凝血酶的制备方法，包括如下步骤：
step1.在猪血中加入38g/l柠檬酸三钠溶液至柠檬酸三钠在混合液中的浓度为0.29g/l，搅拌均匀，调节ph至6.5-7.5之间，得猪血-柠檬酸三钠混合液；
step2.将step1所得猪血-柠檬酸三钠混合溶液在4℃下离心分层，滤去残渣，得到猪血血浆；
step3.优选deae-sepharosea-50作为阴离子交换剂，通过0.2mol/lnacl溶液浸泡处理20～40min后，沥干表面nacl溶液并冻干得到干粉状的deae-sepharosea-50；
step4.按照1l猪血血浆加入1.7g干粉状的deae-sepharosea-50的比例将step3所得的deae-sepharosea-50加入step2所得的猪血血浆中，搅拌吸附45min后，静置30min，然后倒入砂芯漏斗滤去上清液，得到吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50；
step5.选择0.2mol/lnacl溶液作为洗涤液，洗涤液的每次用量为step4所量取的猪血血浆体积的1/40，对吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50洗涤两次，将洗涤后吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50装入洗脱柱；
step6.配制2mol/lnacl-0.01mol/l柠檬酸三钠混合溶液作为洗脱液，向step3中装有deae-sepharosea-50的洗脱柱进行两次洗脱，收集两次洗脱液；
step7.将sepharoseg-50经过3g/lnacl溶液浸泡处理20～40min后，装入脱盐柱，将step6收集的洗脱液加入脱盐柱脱盐，除去溶剂，监测从脱盐柱中洗脱下来的洗脱液的电导率，并收集电导率在0.3～0.4x104us/cm之间的脱盐液，得到含凝血酶原的脱盐液；
step8.在step7收集到的脱盐液中加入1mol/lcacl2溶液至cacl2在总溶液中的浓度稀释至0.05mol/l，40℃静置20min，得到含凝血酶的激活液；
step9将step8所得含凝血酶的激活液离心分层后，滤去残渣，对滤去残渣的激活液去病毒处理，得到凝血酶溶液。
通过采用上述技术方案，从多次制备凝血酶得到的数据可知，依据上述含量调整的制备方法，能够在保证比活、纯度的前提下，提取到最大含量的凝血酶。
作为优选，step2中选用卧式离心机进行离心，设定离心转速为4020rpm，离心时间为15min。
通过采用上述技术方案，设定以上转速和离心时间能够减少凝血酶原在离心过程与沉淀物混合的量，从而提高上清液中凝血酶原的含量。
作为优选，step2中完成离心后的离心液用若干层叠的脱脂纱布进行过滤，所述脱脂纱布的层数位于2～4层之间。
通过采用上述技术方案，2～4层脱脂纱布的设计能够在保证过滤流量的前提下，滤净残渣。
作为优选，step4中阴离子交换剂洗脱后用质量为阴离子交换剂10倍的0.2mol/lnacl溶液洗涤后，浸泡于0.2mol/lnacl溶液中，在0℃下可保存20～30天。
通过采用上述技术方案，将阴离子交换剂浸泡于0.2mol/lnacl溶液能够用于deae介质的保存，减少损耗。
作为优选，step4中阴离子交换剂在未进行step5的情况下，在4℃环境中可保存20～30天。
通过采用上述技术方案，将洗脱液置于4℃保存，洗脱液的成分变化几乎恒定，能够使制备过程中更加灵活，无需一次性制备。
作为优选，step5中保持上样量体积为step5中脱盐柱体积的10～15％。
通过采用上述技术方案，将上样量控制在10～15％之间能够使树脂能够充分吸附凝血酶原。
作为优选，step8中设定离心转速为8000rpm，离心时间为30min。
通过采用上述技术方案，设定上述离心转速能够将固液完全分离，避免去病毒过程中离心液堵塞滤膜。
作为优选，step8中去病毒的处理方法包括有20nm过滤膜过滤后进行s/d法去病毒。
通过采用上述技术方案，超滤膜结合s/d法能够提高病毒的去除率，进而提高凝血酶的纯度。
作为优选，所述s/d法包括有s/d试剂，所述s/d试剂包括有tween-80和tnbp。
通过采用上述技术方案，tween-80和tnbp为s/d试剂，其对病毒的效果较好。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
该猪血凝血酶的制备方法通过deae-sepharosea-50层析和sepharoseg-50脱盐，并通过20nm滤膜和sd法去病毒，通过上述步骤，能够有效降低凝血酶中的杂蛋白、病毒等杂质，提高凝血酶纯度，简化生产工艺，降低了猪血凝血酶提取的操作难度，使其适用于工业生产，在保证产率的同时，具有较高的酶活效价，降低生产成本。
具体实施方式
实施例一
猪血预处理
step1配制浓度为38g/l的柠檬酸三钠溶液；
step2用洁净的玻璃容器收集离体时间小于10min的新鲜猪血，在收集猪血的同时，将step1配制的柠檬酸三钠溶液边搅拌边加入新鲜猪血中，控制玻璃容器中猪血与柠檬酸三钠的比例维持在猪血体积比：柠檬酸三钠体积比＝400:2.5～3.0之间；
step3至40l猪血收集完成后，继续加入柠檬酸三钠溶液，至柠檬酸三钠溶液在猪血-柠檬酸三钠混合液中的浓度为0.29g/l，测量ph为6.8；
step4将猪血-柠檬酸三钠混合液置于4℃环境下冷藏4h，取出后放入卧式离心机中，设定离心转速为4020rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min，离心后将离心液中的上清液通过双层脱脂纱布进行过滤，滤去残渣得到猪血血浆；
吸附洗脱
step5将deae-sepharosea-50浸泡在0.2mol/lnacl溶液40min后，过滤除去nacl溶液，并沥干deae-sepharosea-50表面的nacl溶液，将deae-sepharosea-50在冻干表面nacl溶液后得到干粉状的deae-sepharosea-50；
step6测量在step4得到的猪血血浆体积，按照每1l加入1.7g干粉状的deae-sepharosea-50的比例在猪血血浆中加入干粉状的deae-sepharosea-50，搅拌吸附45min后，静置30min，将猪血血浆和deae-sepharosea-50的混合物倒入砂芯漏斗中，滤去猪血血浆，留吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50；
step6.1剩余未进行step5但是已经过step5处理的deae-sepharosea-50浸泡在0.2mol/lnacl溶液中，放入4℃环境进行保存，可保存20～30天，使用时，沥干表面0.2mol/lnacl溶液，冻干成粉即可；
step7用0.2mol/lnacl溶液洗涤step6中吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50，洗涤两次，每次用量按照每1l血浆使用25ml0.2mol/lnacl溶液计算，将洗涤后吸附有凝血酶原的deae-sepharosea-50装入洗脱柱；
step8配制2mol/lnacl-0.01mol/l柠檬酸三钠混合溶液作为洗脱液，对step7中装有deae-sepharosea-50的洗脱柱进行两次洗脱，收集两次洗脱液；
step8.1对洗脱之后的deae-sepharosea-50可以用0.2mol/lnacl溶液清洗，0.2mol/lnacl溶液的用量为装入柱内deae-sepharosea-50质量的10倍，清洗后，将deae-sepharosea-50浸泡于0.2mol/lnacl溶液中，在0℃下可保存20～30天；
脱盐去病毒
step9将sepharoseg-50经过3g/lnacl溶液浸泡处理40min后，装入脱盐柱，将step8收集的洗脱液按上样量体积10％上脱盐柱脱盐，除去溶剂，监测从脱盐柱中洗脱下来的洗脱液的电导率，并收集电导率在0.3～0.4x104us/cm之间的脱盐液，得到含凝血酶原的脱盐液；
step10在step9收集到的脱盐液中加入1mol/lcacl2溶液至cacl2溶液浓度稀释至0.05mol/l，40℃静置20min，得到含凝血酶的激活液；
step11将step10所得含凝血酶的激活液置于4℃环境下冷藏4h，加入卧式离心机中，设定离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心分层后，滤去残渣；
step12对step11滤去残渣的激活液通过20nm的滤膜进行过滤去病毒处理，滤膜选为硝酸纤维素滤膜或醋酸纤维素滤膜，得到凝血酶成品溶液，之后添加占激活液总含量3％的tween-8和占激活液总含量1％的tnbp进行化学杀菌，得到纯化后的凝血酶溶液。
实施例一至实施例六的操作同实施例一
对实施例一～实施例六进行凝血酶效价测定：
1、精密称定纤维蛋白原30mg，用0.9％氯化钠溶液1.5ml溶解，加凝血酶0.1ml(3单位)，快速摇匀，室温放置约1小时至完全凝固，取出凝固物，用水洗至洗出液加硝酸银试液不产生浑浊，在105℃干燥3小时，称取重量，计算纤维蛋白原中含凝固物的含量(％)。然后用0.9％氯化钠溶液制成含0.2％凝固物的纤维蛋白原溶液，用0.05mol/l磷酸氢二钠溶液调节ph值至7.0～7.4，再用0.9％氯化钠溶液稀释成含0.1％凝固物的纤维蛋白原溶液，备用；
2、取凝血酶标准品，用0.9％氯化钠溶液分别制成每1ml中含5.0单位、6.4单位、8.0单位、10.0单位的标准品溶液；另取内径1cm、长10cm的试管4支，各精密加入0.1％凝固物的纤维蛋白原溶液0.9ml，置37℃±0.5℃水浴中保温5分钟，再分别精密量取上述4种浓度的标准品溶液各0.1ml，迅速加入上述各试管中，立即计时、摇匀，置37℃±0.5℃水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间，每种浓度测5次,求平均值(5次测定之最大值与最小值的差不得超过平均值的10％，否则重测)；标准品溶液的浓度应控制凝结时间在14～60秒为宜；在双对数坐标纸上，以每管中标准品实际效价(单位)为横坐标，凝结时间(秒)为纵坐标，绘制标准曲线；
3、取每实施例制得的凝血酶成品溶液0.1ml，稀释至实验所得数据落入标准曲线内，精密吸取0.1ml，按标准曲线的制备方法平行测定5次，求出凝结时间的平均值(误差要求同标准曲线)，在标准曲线上求得效价(单位)，按下式计算：凝血酶效价(u/ml)＝凝结时间对应标准品实际效价×10×稀释后凝血酶成品溶液体积÷1。
具体参数含量及凝血酶效价见下表：
表一：实施例一～实施例六参数含量及凝血酶效价表
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。