一种来源于解淀粉芽孢杆菌的碱性角蛋白酶KerT及其脱毛用途的制作方法

本发明属于制革脱毛技术和酶的应用领域，具体涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tccc11319(保藏编号：cgmccno.11218)的碱性角蛋白酶kert及其脱毛应用。

背景技术：

角蛋白(keratin)是一类具有极强抗性,一般蛋白酶难以降解的纤维状硬蛋白质，应用于制革业时，用羽毛水解产物对牛皮面革进行填充，能大幅度提高坯革的柔软度和伸长率。在皮革加工过程中，传统的理化方法在处理皮面的同时也会对环境造成很大的污染。随着环境污染的加剧,传统的高污染皮革加工工艺面临着巨大的压力,整个行业必须进行技术的升级,转而寻求一些绿色的加工工艺。角蛋白酶(keratinase)是一种特殊的可以降解角蛋白的蛋白酶类，可由细菌、真菌、放线菌等多种微生物产生，其具有相对广泛的底物降解能力,且对胶原蛋白和弹性蛋白几乎没有任何作用。因此，角蛋白酶可以用于皮革的脱毛，在脱毛的过程中，角蛋白酶选择性地降解一些毛囊内的角蛋白组织，使毛松动，这样就可以使毛发得以从毛囊中拔除而不影响皮革的弹性，从而有望取代传统的理化脱毛工艺，在制革行业展现出诱人的前景。

专利申请cn105087448a公开了一株产胶原蛋白酶的菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.11218。本发明菌株的发酵液中胶原蛋白酶活力达到518.01u/ml，在37℃条件下发酵液24h内能够有效水解铬革屑，处理后水解液中游离铬含量为处理前铬屑中铬含量的30-40％，发酵液对铬离子的耐受度为0.8mg/ml，可用于工业含铬革屑废弃物的处理。

杨连(中国农业科学院)硕士论文《解淀粉芽孢杆菌来源角蛋白酶的高效表达及羽毛降解工程菌的构建》，公布一株解淀粉芽孢杆菌k11(bacillusamyloliquefaciensk11),可在发酵的24h将羽毛几乎完全降解。并以k11为出发菌株，通过选用遗传稳定性高的pub110载体，增加角蛋白酶基因kerk的拷贝数，获得了质粒稳定存在的重组k1127菌株，该重组菌株在羽毛发酵培养基中其kerk的表达量约为原始k11菌株的6倍(酶活1500u/ml)，且其在发酵的12h羽毛几乎完全降解。

技术实现要素：

本发明提供一种来源于解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tccc11319(保藏编号：cgmccno.11218)的角蛋白酶kert，该基因长度为1149bp，编码383个氨基酸，核苷酸序列如seqidno:1所示，氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌tccc11319，在含有羽毛的培养基中摇瓶发酵48h角蛋白酶kert活力可达到445.37u/ml。

本发明提供的角蛋白酶kert，以可溶性角蛋白为底物，最适温度为60℃，最适ph为10，在30-60℃和ph8-10范围内具有良好的稳定性。

本发明提供的角蛋白酶kert能在体外(50ml酶液+0.5g羽毛)12h内快速将羽毛完全降解，利用高效液相色谱(hplc)对羽毛酶解液分析显示，羽毛酶解液中游离氨基酸浓度为14.59μmol/ml。

本发明提供的角蛋白酶kert应用于动物皮快速酶解脱毛。角蛋白酶kert在300u/ml，18-20℃，160rpm，2h内能完全脱除牛皮上的牛毛，通过测定脱毛水解液中羟脯氨酸的含量及扫描电子显微镜观察脱毛牛皮表面发现，kert在脱去毛的同时对皮面几乎不造成损伤，并且在6h时脱毛水解液中羟脯氨酸的含量仅为80.56μg/ml。

有益效果：

本发明提供的角蛋白酶kert应用于动物皮快速酶解脱毛，并且在碱性环境下具有良好的稳定性，能更好的应用于制革脱毛行业。以i型胶原为底物，检测角蛋白酶kert的胶原蛋白酶活力几乎为零，脱毛后的牛皮表皮胶原成分几乎没有损伤。

本发明提供的角蛋白酶kert脱毛废液中不含硫化物，绿色环保，有望替代传统灰碱法脱毛给环境带来的污染，在羽毛废弃物综合开发和皮革生物脱毛中有较大的应用潜力。

附图说明

图1：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tccc11319羽毛降解图；

图2：角蛋白酶kert的酶学性质；其中：(a)温度对kert活性的影响，(b)kert热稳定性，(c)ph对kert活性的影响，(d)kertph稳定性；

图3：不同时间脱毛水解液中羟脯氨酸的含量；

图4：角蛋白酶kert牛皮脱毛图；

图5：角蛋白酶kert和灰碱法脱毛扫描电子显微镜图；其中：(a)灰碱法脱毛，(b)酶法脱毛。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：羽毛降解菌株的筛选

将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tccc11319接种于筛选培养基中，菌株在24h内可快速降解羽毛，结果见图1。

筛选培养基：羽毛1％、kh2po40.14％、na2hpo40.07％、mgso40.02％、nacl0.05％、cacl20.001％，其余为水，ph7.0。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌tccc11319发酵产酶

将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tccc11319过夜活化，接种于种子培养基当中，37℃，220rpm，培养12h，再2％接种于发酵产酶培养基当中，37℃，220rpm，发酵48h，离心，获取粗酶液。

优选的种子培养基：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％，其余为水。

优选的发酵产酶培养基：羽毛1％、蛋白胨2％、酵母粉1％、葡萄糖1％、kh2po40.3％、na2hpo40.6％、mgso40.03％、nacl0.05％、cacl20.01％，其余为水，ph7.0。

粗酶液中角蛋白酶活力测定：发酵48h酶活力达到445.37u/ml

实施例3：角蛋白酶活力测定方法

将发酵液离心10min(12000rpm，4℃)取发酵上清液，吸取250μl适当稀释的酶液，加入250μl0.05mol/lgly-naoh缓冲液(ph10.0)溶解1％的底物(角蛋白)，60℃反应10min，加入500μl0.4mol/l三氯乙酸溶液终止反应。反应物12000rpm离心5min，吸取500μl上清液移入到新的试管中，后依此加入2.5ml0.4mol/lna2co3溶液和500μl福林酚试剂，60℃显色20min。以零时间的反应液作为空白，在680nm处检测吸光值。

角蛋白酶活力定义：1g固体酶粉(或者1ml液体酶)，在一定温度和ph值条件下，每分钟水解角蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。

实施例4：角蛋白酶kert的酶学性质研究

(1)角蛋白酶kert作用的最适温度和热稳定性

分别在不同温度(30、40、50、60、70、80℃，ph10)条件下测定角蛋白酶kert活力，并在以上温度条件下保温1h后测定剩余酶活力并分析其热稳定性，以未作处理的酶液为对照。

(2)角蛋白酶kert作用的最适ph和ph稳定性

在不同ph值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，温度60℃)条件下分析角蛋白酶kert活力变化，将酶液分别在以上ph值环境条件下保持1h后测定剩余酶活力并分析其ph值稳定性，以未作处理的酶液为对照。

研究表明，角蛋白酶kert最适温度为60℃，最适ph为10，在30-60℃和ph8-10范围内具有良好的稳定性，如图2所示。

实施例5：牛皮脱毛试验

(1)牛皮取样于牛的背腹部，前期经浸水及去脂处理，25g牛皮+50ml实施例2获得的角蛋白酶酶液(300u/ml)，18-20℃，160rpm，2h处理后毛基本上全部脱去，剩余少量残留小毛用机械力除去，脱毛效果如图4所示。

(2)等量牛皮用化学灰碱法脱毛为对照，脱去毛的牛皮过夜冷冻干燥后通过扫描电子显微镜观察表面胶原成分是否有损伤。

结果如图5所示，酶法脱毛与化学灰碱法脱毛对比，可以看出(b)角蛋白酶kert脱毛后的牛皮表层毛孔依旧很清晰可见，对牛皮表层的胶原成分几乎不造成损伤，可达到良好的脱毛效果，可替代硫化物脱毛。

实施例6：脱毛水解液中羟脯氨酸含量的测定

(1)本研究使用venusilaa氨基酸分析法，以pitc(异硫氰酸苯酯)为衍生剂来对脱毛水解液进行液相分析，通过测定不同时间脱毛水解液中羟脯氨酸的含量来判定角蛋白酶kert对胶原皮质的水解程度。

具体操作方法：1)实施例5脱毛后的水解液，12000rpm，10min，取上清液和氨基酸标准液(添加羟脯氨酸)各200μl，置于1.5ml离心管中；2)往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20μl；3)分别加入三乙胺乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液至每个离心管中，混匀，室温放置1h；4)然后加入正己烷400μl至各离心管中，振荡后放置10min；5)取下层溶液，用0.45μm针式过滤器过滤；6)取滤液200μl，加800μl水稀释，摇匀，进样10μl。

色谱柱：venusilaa氨基酸分析柱4.6×250mm，5μm；柱温40℃；进样量10μl；波长254nm；流速1.0ml/min；其中nle为正亮氨酸内标，流动相梯度为如表1所示。

表1流动相梯度

脱毛水解液中羟脯氨酸浓度(μmol/ml)＝f1/f2×c

其中：f1＝脱毛水解液中羟脯氨酸峰面积/内标峰面积

f2＝混合氨基酸标准溶液中羟脯氨酸峰面积/内标峰面积

c＝羟脯氨酸对照品浓度(μmol/ml)

(2)通过高效液相色谱(hplc)确定脱毛水解液中羟脯氨酸的浓度，通过与标准氨基酸图谱对比，脱毛水解液6h时羟脯氨酸的浓度仅为80.56μg/ml，如图3所示。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种来源于解淀粉芽孢杆菌的碱性角蛋白酶kert及其脱毛用途

<141>2017-11-03

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)

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