本发明涉及试剂盒检测
技术领域：
，具体的说涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴数字rt-pcr(rt-ddpcr)绝对定量检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现prrs，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典prrsv发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highlypathogenicprrs，hp-prrs)。目前为止，prrsv有两种型，欧洲型和美洲型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，而欧洲株在国内也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断prrsv的检测方法。传统的prrsv检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(ipma)、间接免疫荧光试验(ifa)和间接酶联免疫吸附试验(间接elisa)等。目前最常用核酸检测方法有反转录-聚合酶链反应试验(rt-pcr)等而荧光rt-pcr(realtimert-pcr)试验。传统的prrsv检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。rt-pcr和realtimert-pcr虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。数字化pcr(digitalpcr，dpcr)的概念早在1999年就由bertvogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字pcr的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。bio-rad公司的qx200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量pcr的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)。qx200ddpcr系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的pcr反应器。随后微滴转移至96孔pcr板上，开展终点pcr扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量pcr相比，数字pcr的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字pcr技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。癌症相关突变因浓度较低，往往逃过检测。凭借qx200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴数字rt-pcr检测方法和微滴数字rt-pcr测试剂盒，用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速精确检测。本发明的第一个技术目的是提供用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物和探针组合，包括1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：f：agtgggtcggagcaccagttcr：cgcagacacgaatccagaggctp：fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1。本发明提供了上述的特异性引物和探针组合在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒或检测试剂中的应用。本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒。所述试剂盒优选为微滴数字rt-pcr绝对定量检测试剂盒。本发明的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测试剂盒，其中包含1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：f：agtgggtcggagcaccagttcr：cgcagacacgaatccagaggctp：fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1。还包含病毒总rna提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无rna酶的蒸馏水，一步法rt-ddpcr探针法预混液，探针法rt-ddpcr微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。所述病毒总rna提取试剂含有trizol、氯仿或异戊醇、异丙醇。所述一步法rt-ddpcr探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分别为90μl，特异探针为40μl，引物和探针的浓度均为10μm，以及无rnase酶蒸馏水180μl。所述阳性对照为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组rna的提取液，阴性对照为无rna酶蒸馏水。本发明的试剂盒其工作原理是采用微滴式数字化rt-pcr(rt-ddpcr)，所述试剂盒的工作程序为：(1)配制rt-ddpcr反应液；rt-ddpcr反应液20μl配方为：一步法ddpcr探针法预混液18μl，待测样品rna模板为2μl；(2)制备微滴，然后将微滴转入pcr板，于pcr仪中进行扩增；(3)将完成pcr扩增的pcr板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。在本发明的一个优选实施例中，制备微滴的方法是采用bio-rad公司的qx200系统中的微滴发生器，按照说明书操作进行微滴制备即可。其中，步骤(2)中pcr的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，57～60℃退火60sec(优选58℃)，共40个循环；98℃10min结束反应，每步都设置2.5℃/sec的降温速度。本发明提供的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：100±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。本发明摸索了引物和探针的浓度，找到了最适rt-ddpcr的引物和探针的工作浓度。摸索了rt-ddpcr反应过程中最适的升降温速度，以提高rt-ddpcr的扩增效率，使本发明方法能够与bio-rad公司的qx200系统相结合。本发明试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标准曲线、操作简便、适合现场检测等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头控制疫情。具体表现在：(1)高特异性：本发明根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性极高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检出的特异性；(2)高灵敏度：检测浓度低至1/1,000,000的靶分子；能够直接定量待测样本中的拷贝数；(3)低模板：由于检测的灵敏度很高，可以检测出低丰度的目的基因，所以可以降低模板用量，稀释模板浓度，对于一些珍贵，稀少的样本可以有更多的研究。(4)可直接定量，无需标准曲线：与传统的prrsv检测方法相比，该试剂盒可直接定量，无需标准曲线，操作简便、准确无误，更加适合现场检测，有效预防猪疫病的大规模爆发。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1引物及探针的设计与筛选1、本发明引物、探针设计：根据genbank已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列，进行适用于rt-ddpcr的特异性引物和的设计。主要在变异序列段设计引物探针，以防止扩增出非prrsv美洲型变异株的病毒序列。本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下，见表1。表1名称序列f1cccactgatgacacctttg(seqidno.4)r1aacagaggctcatcctggt(seqidno.5)p1fam-cgcgtagaactgacaacaacgctga-bhq1(seqidno.6)f2agtgggtcggagcaccagttc(seqidno.1)r2cgcagacacgaatccagaggct(seqidno.2)p2fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1(seqidno.3)2、引物的筛选(1)引物随机配为四对：f1r1、f1r2、f2r1、f2r2；(2)然后用染料法做荧光定量rt-pcr，rt-pcr体系配方：2x一步法sybrgreensupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，rnasefreedh2o3μl，阳性模板5μl。pcr的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，60℃退火60sec读取荧光，共40个循环；65℃—95℃每5秒升高0.5℃溶解曲线，结束反应。(3)结果分析，选择没有非特异性扩增的引物对f2r2.3、探针的筛选(1)引物探针的组合为：1、f2r2+p1，2、f2r2+p2(2)然后在ddpcr平台上，rt-ddpcr体系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，探针0.5μl，rnasefreedh2o3.5μl，阳性模板4μl，总体积20μl(引物和探针的浓度均为10μm)。然后生成微滴。(3)上pcr仪扩增，为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，55℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字pcr检测仪检测。(4)分析结果：根据实验结果选择f2r2+p2引物探针组合。实施例2在ddpcr平台上检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的pcr方法退火温度的优化。1、选择引物探针的组合为：f2r2+p2。2、然后在ddpcr平台上，rt-ddpcr体系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermix10μl，上游引物，下游引物分别为1μl，探针0.5μl，rnasefreedh2o3.5μl，阳性模板4μl，总体积20μl(引物和探针的浓度均为10μm)。做8个复孔，然后生成微滴。3、上pcr仪扩增，为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，50～60℃(仪器自动分布8个温度梯度)退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字pcr检测仪检测。4、分析结果：根据实验结果选择57～60℃的退火温度，最优温度为58℃。实施例3引物、探针浓度的优化实验设计引物探针浓度均为10μm,组合为f2r2p2,体系配置方法见表2。表2然后在ddpcr平台上生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。上pcr仪扩增，pcr的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字pcr检测仪检测。分析结果：根据实验结果选择f2r2+p2引物探针配方，选择引物分别为1.8μl，探针为0.8μl。实施例4pcr扩增升降温速度的优化实验1、然后在ddpcr平台上，引物探针组合f2r2+p2(浓度为10μm),用ddpcr体系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes10μl，上游引物，下游引物分别为1.8μl，探针为0.8μl，rnasefreedh2o3.6μl，阳性模板2μl，总体积20μl。每台仪器做4个复孔。然后生成微滴，转移到pcr小管内。2、在两台同样的pcr仪平台上扩增，为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，一台设置升降温速度设置为5℃/sec，另一台上设置升降温速度设置为2.5℃/sec，扩增结束后，把pcr小管内的扩增产物转移到同一块96孔板内，封铝膜，上微滴数字pcr检测仪检测。3、分析结果：根据实验结果分析发现，升降温速度慢的最后检测的微滴数比升降温速度快的多，扩增效率高，升降温速度慢的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开，很容易区分，升降温速度快的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开，不容易区分，故选择2.5℃/sec升降温速度。实施例5病毒rna提取取100μl组织样品研磨上清液置1.5mleppendorf管中，加500μl溶液a，混匀，室温剧烈震荡15s，室温静置5min。加120μl溶液b，小心盖上帽盖，室温剧烈震荡15s，室温放置5min。12,000rpm，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含rna。转移水相至一新eppendorf管，加入等量溶液c(约500μl)，混匀，室温放置15min。12,000rpm，4℃，离心10min，离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样rna沉淀。洗rna：弃上清，加1000μl75％乙醇(使用前用溶液d加无水乙醇配置而成，-20℃预冷)漂洗沉淀，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清。室温充分干燥rna沉淀。加15μlrnasefreedh2o，即可用于pcr扩增。可以-20℃保存备用。实施例6检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-ddpcr方法的建立1、微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒的组装将试剂盒分为一步法微滴数字rt-pcr检测试剂，方便保存和运输。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等)。溶液a(rnasefreedh2o)1支，1ml；溶液b(一步法rt-ddpcr探针法预混液)一支，900μl；溶液c(探针法rt-ddpcr微滴发生油)一支，7ml；溶液d为rt-ddpcr探针法质控液，3.5ml；溶液e(阳性对照)一支，40μl；溶液f(阴性对照)一支，40μl；使用基因组rna为阳性模板，使用tris-edta缓冲液(0.01mph8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按400μl定量分装。使用rnasefreedh2o为阴性对照。上述一步法rt-ddpcr探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分别为90μl，特异探针为40μl，引物和探针的浓度均为10μm。rnasefreedh2o180μl。使用时，在18μl的rt-ddpcr探针法预混液中加入2μl的rna模板，得到20μl的rt-ddpcr反应液，用于制备微滴。2、rt-ddpcr方法的建立(1)制备rt-ddpcr反应液，总体积20μl。向pcr扩增管中加入下列反应物：单反应体系配方一步法rt-ddpcr探针法预混液18μl模板rna2μl空白对照：以rnasefreedh2o代替模板，同样条件下扩增。(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μl反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μl1×溶液d补足，建议使用8通道20μl排枪和20μl枪头(不能用200ul枪头)，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，同样不能有空着的孔。(4)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。(5)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。(6)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，优选使用8通道排枪和200μl枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。(7)转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜(膜亮面朝上，暗面向下)，推荐的运行程序为：180℃，10s，一般无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr，可在任意一台96孔pcr仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。推荐反应条件：(8)将之前完成pcr的96孔板放入plateholder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。(9)打开quantasoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。4、结果分析和判定本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：100±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。实施例7特异性检验用制备的试剂盒分别检测猪健康细胞培养物，prrsv美洲型经典株，prrsv欧洲型，猪圆环病毒，伪狂犬病病毒，猪细小病毒，猪传染性胃肠炎病毒各10份，结果全为阴性；检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的组织与细胞培养物各10份，结果全为阳性。以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12