一种利用聚合酶扩增技术获得AgDREB3转录因子的方法与流程

本发明属于植物基因工程领域，涉及芹菜dreb类转录因子及其应用。本发明从芹菜中获得一个响应逆境胁迫的基因agdreb3，该基因能够用于植物转化，培育抗逆性提高的植物。

背景技术：

芹菜(apiumgraveolensl.)是伞形科(apiaceae)一年或多年生草本植物，是一种重要的蔬菜作物。芹菜含有丰富的营养成分，具有很高的食用价值和药用价值，特别是芹菜素、黄酮等生物活性物质能有效降低血压、调节血脂和血糖。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良地方品种，株高90厘米左右，颜色淡绿，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培。

植物的生长和发育受各种非生物胁迫的影响，如高温或低温极端天气、干旱、土壤盐渍化和重金属例子影响。不断变化的全球气候可能会加剧这些逆境环境。植物自身已经进化出多种策略来应对这些逆境环境得以生存(singhetal.，curropinplantbiol2002，5：430-436；zhu，annurevplantbiol2002，53：247-273；katagiri，curropinplantbiol2004，7：506-511)。因此，了解植物应对多种胁迫的反应模式是非常需要的。转录因子广泛参与植物的逆境调控网络(chinnusamyetal.，jexpbot2004，55：225-236；mizoietal.，bba-generegulmech2012，1819：86-96)。转录因子不仅可以直接参与逆境调控，还可以调节下游基因的表达(shinozakietal.，curropinplantbiol2003，3：410-417)。ap2/erf家族转录因子家族成员含有由60～70个氨基酸组成的ap2/erf结构域。主要分为ap2、rav、dreb/cbf、erf和其它类别，其中erf亚族又分b1～b6六个组，dreb亚族又分a1～a6六个组。近些年研究表明该家族成员参与多种生物学过程，包括植物生长、果实成熟、种子发育、响应各种逆境胁迫等(jofukuetal.，plantcell1994，6：1211-1225；mizoij，etal.，biochimbiophysacta2012，1819：86-96)。

技术实现要素：

本发明提供了一种芹菜转录因子agdreb3基因其制备方法和用途。该基因具有典型的ap2/erf保守结构域，并能够响应逆境胁迫。所获得的基因有利于深入了解芹菜逆境下的响应机制，同时也能用于植物转化，提高植物的抗逆性。

附图说明

图1.芹菜agdreb3蛋白序列与拟南芥ap2/erf家族的进化树分析。

图2.芹菜agdreb3基因在不同逆境胁迫下的表达分析。

图3.酵母单杂交验证agdreb3蛋白结合dre元件。

图4β-半乳糖苷酶活性测定芹菜agdreb3蛋白结合能力。

具体实施方式

1.芹菜总rna的提取及cdna的合成：采用rnasimpletotalrnakit(北京天根生化科技有限公司)分别从‘津南实芹’成熟叶片中分别提取总rna。用primescriptrtreagentkit(大连宝生物工程有限公司)将提取的总rna反转录成cdna。

2.芹菜转录因子agdreb1基因的克隆：基于芹菜转录组测序信息，以拟南芥ap2/erf转录因子家族为信息探针，进行检索分析，获得芹菜agdreb3的基因序列。根据该序列设计一对引物，正向：5’，atgaaaaactccataaagac-3’，反向5’，tcagtaattccataaagccatgcc-3’。以‘津南实芹’cdna为模板进行扩增，pcr反应体系(20μl)：cdna(2.5ng/μl)1μl，extaqdna聚合酶10μl，引物(10pmol/μl)各1μl，ddh2o7μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。pcr产物经质量体积分数1.2％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接到pmd18-t(大连宝生物工程有限公司)载体上并转化大肠杆菌dh5α，提取质粒经pcr鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

3.序列分析：通过核苷酸序列测定，获得了芹菜转录因子agdreb3基因的序列，对其编码的氨基酸序列进行分析。氨基酸组成与多序列比对采用clustalx软件，进化树分析使用mega4.0软件。

4.实时定量pcr反应：对生长期‘津南实芹’幼苗分别进行4种逆境胁迫处理：4℃低温处理，干旱处理(200g·l^-1的peg6000)、盐胁迫处理(200mmol·l^-1的nacl)、aba激素(0.1mmol·l^-1)处理。分别于处理后0、1、3、6、12、24和48h取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中。根据‘津南实芹’中扩增的agdreb3基因序列设计表达检测引物，正向为5’，ccatcatcaaccaatgccaaggat，3’，反向为5’-gtgccatctccgctatcaactgt，3’。实时定量pcr使用宝生物工程(大连)有限公司的sybrpremixextaq试剂盒，按照操作说明进行。采用芹菜的tub-b基因作为参考基因(lietal.，frontiersplantsci2016，7：313)，与目标基因一起扩增，引物序列为正向5’，tggtggcactggatctggtatgg-3’，反向为5’-actttcggaggagggaagactgaa-3’。相对定量使用参照基因的δδct法，表达差异水平为2^-δδct，δct＝ct目标基因-ctactin。

5.酵母单杂交体系和x-gal活性的测定：酵母菌株为egy48，鱼饵质粒g222(g221质粒载体插入3拷贝的dre顺式元件后构建成)载体由本实验室保存构建。将扩增好的agdreb3基因片段克隆在酵母系统ppc86载体的bamhi-saci位点上。同时将重组质粒转化菌株egy48，均匀涂于sd/-trp/-his双缺陷平板，30℃培养箱培养2～3d后，将转化子影印到无菌硝酸纤维素膜上，平铺于含有x-gal的sd培养基上，1d后观察是否显蓝色。并以onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside)(美国sigma公司)为底物，进行β-半乳糖苷酶活性检测。

6.试验结果：

1).从芹菜中克隆的agdreb3基因编码的蛋白序列具有典型的ap2/erf保守结构域，与拟南芥ap2/erf蛋白构建同源进化树，分析结果显示该基因属于ap2/erf转录因子中的dreb-a1亚族(图1)。

2).荧光定量pcr结果显示agdreb3基因在逆境胁迫下表达量变化，在冷胁迫和aba处理下反映迅速，冷处理下3h表达量达到峰值，aba处理下1h达到峰值且表达量上升了9倍以上，而在干旱和盐胁迫下6h后表达量才出现明显变化(图2)。

3).酵母转录激活实验证明agdreb3蛋白可以与dre顺式作用元件特异结合，并具有转录激活活性(图3和4)。