微小RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

我国恶性肿瘤发病率和死亡率逐年上升，越来越受到医学界的重视，亦然成为基础研究和临床研究的重大课题。虽然肿瘤治疗取得了一定的进展，但离生存期的根本提高对生活质量的要求仍有一定的距离，探求更为安全有效的辅助治疗仍需更多努力。目前，肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后的一种有效疗法而被广泛用于临床，尤其是基于免疫卡控点的阻断疗法。有效的抗肿瘤免疫治疗依赖于细胞毒性t淋巴细胞(ctls)的有效活化，而t细胞的有效活化和功能介导依赖于抗原递呈细胞和t细胞表面的配体/受体对提供的协同刺激信号。其中，b7-cd28是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，包括b7-1、b7-2、b7h、pd-l1(b7-h1)、b7-h2、b7-h3、b7-h4等配体与cd28、ctla-4、icos、pd-1、btla等受体提供的促进t细胞生长、分化和产生细胞因子的正性信号，以及限制、终止和/或减弱t细胞应答的负性信号。

pd-l1、b7-h3和b7-h4是近年发现的b7家族协同刺激分子的重要成员，均被发现在多种肿瘤组织中异常高表达，包括肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、尿路移形细胞癌、肾癌和前列腺癌等；且其高表达与患者预后差显著相关。大量研究亦已证实，通过抑制pd-l1、b7-h3或b7-h4表达可以获得很好的抗肿瘤效果；目前，已经上市的pd-l1单克隆抗体药物有罗氏的atezolizumab，用于治疗尿路上皮癌(膀胱癌)或靶向治疗和化疗失败的非小细胞肺癌患者，以及阿斯利康公司的durvalumab用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌患者。我们前期研究发现，pd-l1、b7-h3或b7-h4的表达均可被内源性微小rna抑制。

微小rna(microrna)是近年来发现于真核细胞中的一类长约22个核苷酸的内源性非编码小分子rna，其5’-端第2-9个碱基(seedregion)可通过与靶基因的3′-utr结合，在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。迄今为止，人类基因组中已明确的微小rna约有2588个(mirbase)，调控着至少30％基因的表达，而每一个微小rna可能参与调控100～200个靶基因的翻译。微小rna由于其广泛的调控作用参与了细胞的生长、分化、增殖和凋亡等生命过程，影响着几乎所有的信号通路，并参与各种生理病理过程，特别在肿瘤的发生和发展中发挥了极为重要的作用。

大量研究结果显示微小rna在肿瘤中呈现异常表达，其中有的微小rna表达升高而有的降低，分别通过抑制抑癌基因表达或上调癌基因表达，发挥着促癌或抑癌的作用。2002年，clain等发现两个微小rna基因mir-15和mir-16在慢性淋巴细胞白血病患者中常发生缺失，首次揭示了微小rna与肿瘤的密切关系。之后，越来越多的微小rna被发现在肿瘤中异常表达，如低表达的mir-34a、mir-143、mir-145和高表达的mir-21、mir-27a、mir-155等。业已证实，通过在肿瘤细胞中转入低表达微小rna的模拟物(mimic和agomir等)，或者转入高表达微小rna的抑制剂(inhibitor和antagomir等)，可以有效抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，从而发挥抗肿瘤效果。

在肿瘤治疗领域，进展最快的微小rna药物是mir-34amimic的两性霉素脂质体制剂mrx34。由于mir-34a在细胞和动物水平均显示出了很好的抗肿瘤活性和安全性，美国mirnatherapeutic公司于2013年推动了一项多中心的i期临床试验，用于治疗原发性肝癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤或肾细胞癌患者，也成为第一个进入临床试验的微小rna药物。随后，rg-101(n-乙酰-d-氨基半乳糖修饰的抗mir-122核酸片段)、rg-012(mir-21抑制剂)、rg-125/azd4076(n-乙酰半乳糖胺修饰的mir-103/107抑制分子)、mrg-201(mir-29mimic)和mrg-106(antimir-155锁核苷酸)等微小rna药物相继进入临床试验。尽管初步临床试验结果显示mrx34的疗效和安全性尚可，但由于其在5名患者中出现细胞因子风暴而中止了临床试验。因此，进一步研究抗肿瘤活性良好，而不产生不良免疫反应的微小rna仍是目前的研究热点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的微小rna抗肿瘤效果良好，且不引起细胞因子异常分泌。

本发明提供了一种rna分子，mir-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u。

本发明还提供了与上述rna分子序列完全互补或部分互补的rna分子。

具体实施例中，所述部分互补形成的粘性末端为2bp。

具体实施例中，所述粘性末端位于互补rna分子的3’端。

本发明提供的rna分子中任意一个或多个碱基经修饰获得的rna分子。

本发明提供的rna分子在制备抑制pd-l1、b7-h3、b7-h4等蛋白水平的药物中的应用。

本发明提供的rna分子在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的应用。

本发明提供的所述rna分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤为星形细胞瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、b细胞淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉鳞状细胞癌、黑色素瘤、粘膜相关淋巴组织b细胞淋巴瘤、髓母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、脑膜瘤、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、高危骨髓增生异常综合征、间皮瘤、神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、口咽癌骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、神经鞘瘤、小细胞肺癌、唾液腺肿瘤、散发性乳头状癌、甲状腺癌、睾丸肿瘤或尿路上皮癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包括活性链和互补链；

所述活性链为rna分子或经修饰的该rna分子，该rna分子是mir-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u；所述互补链与活性链互补。

本发明提供的rna分子为mir-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u；采用该rna分子及其互补链能够抑制肿瘤细胞中pd-l1、b7-h3、b7-h4等蛋白水平，抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，从而起到抗肿瘤的作用。并且，研究表明，本发明提供的微小rna在抗肿瘤的同时，对血清中细胞因子的分泌均没有显著影响。

附图说明

图1示mir-449a与mir-34a-5p模拟物抑制肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图1-a示对hct-116肠癌细胞的抑制效果；图1-b示对hct-8肠癌细胞的抑制效果、图1-c示对caco-2肠癌细胞的抑制效果；图1-d示对sw480肠癌细胞的抑制效果；图1-e示对panc-1胰腺癌细胞的抑制效果；和图1-f示对hela宫颈癌细胞的抑制效果；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

图2示本发明的实施例中，微小rna(mir1a、mir2g、mir3a、mir4c、mir5u、mir6u、mir7a、mir8a、mir9c、mir10c、mir11a、mir12u和mir13a)模拟物与mir-34a-5p处理的hct-116结直肠癌细胞的相对生长能力检测结果；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

图3示本发明的实施例中，微小rna(mir1a和mir9c)和mir-34a-5p模拟物抑制肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图3-a示对hct-116肠癌细胞的抑制效果；图3-b示对hct-8肠癌细胞的抑制效果、图3-c示对caco-2肠癌细胞的抑制效果；图3-d示对sw480肠癌细胞的抑制效果；图3-e示对sgc-7901胃癌细胞的抑制效果；图3-f示对a549肺癌细胞的抑制效果；图3-g示对panc-1胰腺癌细胞的抑制效果；和图3-h示对hela宫颈癌细胞的抑制效果；

图4示本发明的实施例中，不同浓度(0.1、2.0、10、25、50、100nm)的微小rna(mir1a和mir9c)和mir-34a-5p模拟物抑制hct-116肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图4-a示mir-34a-5p的抑制效果；图4-b示mir1a的抑制效果、图4-c示mir9c的抑制效果；

图5示本发明的实施例中，平端或粘性末端的微小rna(mir1a和mir9c)和mir-34a-5p模拟物抑制hct-116肿瘤细胞生长的能力检测结果；其中，图5-a示平端mir-34a-5p与粘性末端mir-34a-5p的抑制效果；图5-b示平端mir1a与粘性末端mir1a的抑制效果、图5-c示平端mir9c与粘性末端mir9c的抑制效果；

图6示本发明的实施例中，微小rna(mir9cm)和mir-34a-5p激动剂抑制hct-116细胞裸鼠移植瘤生长的能力检测结果；其中，图6-a示移植瘤的生长曲线；图6-b示荷瘤裸鼠体重变化曲线；图6-c示荷瘤裸鼠摄食量变化曲线；

图7示本发明的实施例中，微小rna(mir9c)模拟物处理的hct-116细胞中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图7-a示il-2蛋白的检测结果；图7-b示il-4蛋白的检测结果；图7-c示il-6蛋白的检测结果；图7-d示il-10蛋白的检测结果；图7-e示tnf-α蛋白的检测结果；图7-f示ifn-γ蛋白的检测结果；

图8示本发明的实施例中，微小rna(mir9c)模拟物处理的hct-116细胞/t淋巴细胞共培养体系中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图8-a示il-2蛋白的检测结果；图8-b示il-4蛋白的检测结果；图8-c示il-6蛋白的检测结果；图8-d示il-10蛋白的检测结果；图8-e示tnf-α蛋白的检测结果；图8-f示ifn-γ蛋白的检测结果；

图9示本发明的实施例中，微小rna(mir9cm)激动剂处理的c57bl/6小黑鼠血清中细胞因子分泌水平的流式细胞术检测结果；其中，图9-a示il-2蛋白的检测结果；图9-b示il-4蛋白的检测结果；图9-c示il-6蛋白的检测结果；图9-d示il-10蛋白的检测结果；图9-e示tnf-α蛋白的检测结果；图9-f示ifn-γ蛋白的检测结果；

图10示本发明的实施例中，微小rna(mir1a和mir9c)和mir-34a-5p模拟物处理的hct-116细胞中pd-l1、b7-h3和b7-h4蛋白的westernbolt检测结果；

图11示本发明的实施例中，微小rna(mir9cm)激动剂处理的hct-116细胞移植瘤中蛋白表达的westernbolt检测结果；其中，图11-a示pd-l1蛋白的检测结果；图11-b示b7-h3蛋白的检测结果；图11-c示b7-h4蛋白的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明说明书中提及的术语定义如下：

本发明提供的rna分子为微小rna(microrna，或mirna)，其是指单链的寡核糖核酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。本发明提供的mirna的碱基有4种，a腺嘌呤、g鸟嘌呤、c胞嘧啶、u尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、5-硫尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

所述碱基，可以是无修饰碱基，也可以是修饰碱基。

所述修饰碱基，是指碱基连接基团包括但不限于nh2、生物素、胺基、低级胺基烷基、低级烷基、nhcoch3、乙酰基、2'-氧基-甲基(2'o-me)、dmto、荧光素、硫醇或吖啶。

所述修饰碱基，是指本发明提供的rna分子链或其互补链中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碱基连接修饰基团。

所述修饰，是指本发明提供的rna分子链或其互补链中的碱基连接任何一种或多种基团或其组合。

所述核糖，可以是无修饰核糖，也可以是修饰核糖。

所述修饰核糖，是指核糖连接基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、cl、br、cn、ocn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环氨基烷基、氨基烷基、聚氨基烷基、取代的甲硅烷基、rna裂解基团、嵌入剂、用于改善微小rna的药代动力学性质的基团或用于改善微小rna的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。另外的糖取代基包括2'-o-2-甲氧基乙基(2'-o-ch2ch2och3)、2'-二甲基氨氧基乙氧基[2'-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2]、烯丙基(-ch2-ch═ch2)、-o-烯丙基(-o-ch2-ch-ch2)、甲氧基(-o-ch3)、氨基丙氧基(-och2ch2ch2nh2)和氟(f)等。

所述修饰核糖，是指本发明提供的rna分子链或其互补链中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核糖连接修饰基团。

所述修饰，是指本发明提供的rna分子链或其互补链中的核糖连接任何一种或多种基团或其组合。

所述互补，又称互补配对，是指碱基通过氢键与它互补的碱基相连。互补碱基对a于u之间形成两对氢键，c与g之间形成三对氢键。

所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。

本发明所述突变是指一个碱基被另一个碱基所取代，突变后，rna分子中碱基的数量不发生改变。本发明中，所述突变不存在碱基被与自身相同碱基取代，即所述突变不存在a被a取代，c被c取代，g被g取代，u被u取代的情况。

本发明提供的rna分子为mir-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u。

本发明还提供了与上述rna分子序列完全互补或部分互补的rna分子。

具体实施例中，所述部分互补形成的粘性末端为2bp。

具体实施例中，所述粘性末端位于互补rna分子的3’端。

本发明中，提供的突变的mir-34a-5p记为活性链，与其完全互补或部分互补的rna分子记为互补链。

所述mir-34a序列如seqidno.26所示。

一些实施例中，所述完全互补的微小rna分子对包括seqidno:1所示序列的活性链和seqidno.27所示序列的互补链；或者包括seqidno:17所示序列的活性链和seqidno.28所示序列的互补链。

部分互补的微小rna分子对包括：

活性链序列如seqidno.1所示，其互补链序列如seqidno.2所示。

seqidno.1为mir-34a序列中5’端第10位碱基c突变为n，所述n为为a、g或u。具体实施例中，seqidno.1中所述n为a。seqidno.1中5’端第1～20位与seqidno:2中5’端第1～20位互补；seqidno.1的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.2的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.3所示，其互补链序列如seqidno.4所示。

seqidno.3为mir-34a序列中5’端第11位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.3中所述n为g。seqidno.3中5’端第1～20位与seqidno:4中5’端第1～20位互补；seqidno.3的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.4的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.5所示，其互补链序列如seqidno.6所示。

seqidno.5为mir-34a序列中5’端第12位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.5中所述n为a。seqidno.5中5’端第1～20位与seqidno:6中5’端第1～20位互补；seqidno.5的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.6的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.7所示，其互补链序列如seqidno.8所示。

seqidno.7为mir-34a序列中5’端第13位碱基a突变为n，所述n为为c、g或u。具体实施例中，seqidno.7中所述n为c。seqidno.7中5’端第1～20位与seqidno:8中5’端第1～20位互补；seqidno.7的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.8的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.9所示，其互补链序列如seqidno.10所示。

seqidno.9为mir-34a序列中5’端第14位碱基g突变为n，所述n为为a、c或u。具体实施例中，seqidno.9中所述n为u。seqidno.9中5’端第1～20位与seqidno:10中5’端第1～20位互补；seqidno.9的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.10的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.11所示，其互补链序列如seqidno.12所示。

seqidno.11为mir-34a序列中5’端第15位碱基c突变为n，所述n为为a、g或u。具体实施例中，seqidno.11中所述n为u。seqidno.11中5’端第1～20位与seqidno:12中5’端第1～20位互补；seqidno.11的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.12的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.13所示，其互补链序列如seqidno.14所示。

seqidno.13为mir-34a序列中5’端第16位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.13中所述n为a。seqidno.13中5’端第1～20位与seqidno:14中5’端第1～20位互补；seqidno.13的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.14的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.15所示，其互补链序列如seqidno.16所示。

seqidno.15为mir-34a序列中5’端第17位碱基g突变为n，所述n为为a、c或u。具体实施例中，seqidno.15中所述n为a。seqidno.15中5’端第1～20位与seqidno:16中5’端第1～20位互补；seqidno.15的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.16的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.17所示，其互补链序列如seqidno.18所示。

seqidno.17为mir-34a序列中5’端第18位碱基g突变为n，所述n为为a、c或u。具体实施例中，seqidno.17中所述n为c。seqidno.17中5’端第1～20位与seqidno:18中5’端第1～20位互补；seqidno.17的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.18的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.19所示，其互补链序列如seqidno.20所示。

seqidno.19为mir-34a序列中5’端第19位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.19中所述n为c。seqidno.19中5’端第1～20位与seqidno:20中5’端第1～20位互补；seqidno.19的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.20的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.21所示，其互补链序列如seqidno.22所示。

seqidno.21为mir-34a序列中5’端第20位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.21中所述n为a。seqidno.21中5’端第1～20位与seqidno:22中5’端第1～20位互补；seqidno.21的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.22的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.23所示，其互补链序列如seqidno.24所示。

seqidno.23为mir-34a序列中5’端第21位碱基g突变为n，所述n为为a、c或u。具体实施例中，seqidno.23中所述n为u。seqidno.23中5’端第1～20位与seqidno:24中5’端第1～20位互补；seqidno.23的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.24的5’端第21～22位形成粘性末端。

活性链序列如seqidno.25所示，其互补链序列如seqidno.24所示。

seqidno.25为mir-34a序列中5’端第22位碱基u突变为n，所述n为为a、c或g。具体实施例中，seqidno.25中所述n为a。seqidno.25中5’端第1～20位与seqidno:24中5’端第1～20位互补；seqidno.25的5’端第21～22位形成粘性末端；seqidno.24的5’端第21～22位形成粘性末端。

本发明提供的rna分子中任意一个或多个碱基经修饰获得的rna分子。

本发明实施例中，对互补链进行修饰。所述修饰包括：在序列中的任意一个或多个核糖中连接2'-氧基-甲基基团、使任意一个或多个磷酸基团中的羟基被硫取代、使3’末端的核糖上的羟基连接胆固醇。

本发明提供的rna分子在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的应用。

通过实验验证，本发明提供的微小rna分子对对各种肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用，显示本发明提供的微小rna分子对具有很好的广谱抗肿瘤活性；且结果表明，本发明提供的微小rna分子对对肿瘤细胞的抑制作用优于mir-34a-5p。

本发明进行实验的肿瘤细胞包括结直肠癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞和/或宫颈癌细胞。

具体的，进行实验的肿瘤细胞为hct-116结直肠癌细胞、hct-8结直肠癌细胞、caco-2结直肠癌细胞、sw480结直肠癌细胞、sgc-7901胃癌细胞、a549肺癌细胞、panc-1胰腺癌细胞和hela宫颈癌细胞等肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。

进行实验的微小rna分子对中，一些对肿瘤细胞生长的抑制活性与mir-34a-5p相当，这些微小rna分子对中的活性链的序列如下任一种所示：seqidno.1、seqidno.11、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21。

具体的，这些分子对为：

mir1a：活性链序列如seqidno.1所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.2所示，其中n为u；

mir6u：活性链序列如seqidno.11所示，其中n为u，其互补链序列如seqidno.12所示，其中n为a；

mir9c：活性链序列如seqidno.17所示，其中n为c，其互补链序列如seqidno.18所示，其中n为g；

mir10c：活性链序列如seqidno.19所示，其中n为c，其互补链序列如seqidno.20所示，其中n为g；

mir11a：活性链序列如seqidno.21所示，其中n为a，其互补链序列如seqidno.22所示，其中n为u。

上述微小rna分子对，对肿瘤细胞生长的抑制活性与mir-34a-5p相当，但它们相对于mir-34a-5p而言，具有更高的用药安全性。实验结果显示，其中mir9c对实验小鼠血清中il-4、il-6、il-10、ifn-γ、tnf-α等5种细胞因子的分泌均没有显著影响。

进行实验的微小rna分子对中，一些对肿瘤细胞生长的抑制活性显著优于mir-34a-5p，p<0.05，这些微小rna分子对中的活性链的序列如下任一种所示：seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.23、seqidno.25。

具体的，这些分子对为：

mir2g：活性链序列如seqidno.3所示，其中n为g；其互补链序列如seqidno.4所示，其中n为c；

mir3a：活性链序列如seqidno.5所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.6所示，其中n为u；

mir4c：活性链序列如seqidno.7所示，其中n为c；其互补链序列如seqidno.8所示，其中n为g；

mir5u：活性链序列如seqidno.9所示，其中n为u；其互补链序列如seqidno.10所示，其中n为a；

mir7a：活性链序列如seqidno.13所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.14所示，其中n为u；

mir8a：活性链序列如seqidno.15所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.16所示，其中n为u；

mir12u：活性链序列如seqidno.23所示，其中n为u；其互补链序列如seqidno.24所示；

mir13a:活性链序列如seqidno.25所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.24所示。

本发明提供的rna分子在制备抑制pd-l1、b7-h3、b7-h4等蛋白水平的药物中的应用。

本发明测定了微小rna分子对，对pd-l1、b7-h3和b7-h4等负性协同刺激分子表达的影响。通过实验验证，本发明提供的微小rna分子对显著抑制了hct-116细胞中pd-l1、b7-h3和b7-h4蛋白表达。

用于测定负性协同刺激分子表达的微小rna分子对中的活性链序列为seqidno.1或seqidno.17。

具体的，这些分子对为：

mir1a：活性链序列如seqidno.1所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.2所示，其中n为u；

mir9c：活性链序列如seqidno.17所示，其中n为c，其互补链序列如seqidno.18所示，其中n为g；

在裸鼠中接种hct-116细胞构建肿瘤模型。待肿瘤长至150-200mm³后，给予本发明提供的微小rna进行治疗。结果表明，微小rna显著抑制了裸鼠中hct-116细胞移植瘤的生长，但不影响小鼠的体重和摄食量；而且，在刚停药时本发明提供微小rna治疗组肿瘤体积明显小于mir-34a-5p组。

本发明提供的所述rna分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

本发明进行抗肿瘤实验的rna分子中，活性链的序列如seqidno.17所示，其中n为c；互补链的序列如seqidno.18所示，其中n为g。

进行抗肿瘤实验的rna分子中，互补链经过修饰。所述修饰为，seqidno.18中每个核糖分子皆连接2'-氧基-甲基基团，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇。

所述肿瘤为星形细胞瘤、间变性大细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、b细胞淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉鳞状细胞癌、黑色素瘤、粘膜相关淋巴组织b细胞淋巴瘤、髓母细胞瘤、套细胞淋巴瘤、脑膜瘤、骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、高危骨髓增生异常综合征、间皮瘤、神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、口咽癌骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、神经鞘瘤、小细胞肺癌、唾液腺肿瘤、散发性乳头状癌、甲状腺癌、睾丸肿瘤或尿路上皮癌。

本发明进一步验证了完全互补的微小rna分子对及部分互补的微小rna分子对的抗肿瘤活性。结果表明，所有粘性末端微小rna的抗肿瘤活性均显著强于与之对应的平端微小rna，表明粘性末端微小rna具有更强的抗肿瘤活性。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包括活性链和互补链；

所述活性链为rna分子或经修饰的该rna分子，该rna分子是mir-34a-5p序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u；所述互补链与活性链互补。

本发明实施例中，所述抗肿瘤药物中，包含的活性链序列为：seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21、seqidno.23、seqidno.25。

具体的，包括如下微小rna分子对：

mir1a：活性链序列如seqidno.1所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.2所示，其中n为u；

mir2g：活性链序列如seqidno.3所示，其中n为g；其互补链序列如seqidno.4所示，其中n为c；

mir3a：活性链序列如seqidno.5所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.6所示，其中n为u；

mir4c：活性链序列如seqidno.7所示，其中n为c；其互补链序列如seqidno.8所示，其中n为g；

mir5u：活性链序列如seqidno.9所示，其中n为u；其互补链序列如seqidno.10所示，其中n为a；

mir6u：活性链序列如seqidno.11所示，其中n为u，其互补链序列如seqidno.12所示，其中n为a；

mir7a：活性链序列如seqidno.13所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.14所示，其中n为u；

mir8a：活性链序列如seqidno.15所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.16所示，其中n为u；

mir9c：活性链序列如seqidno.17所示，其中n为c，其互补链序列如seqidno.18所示，其中n为g；

mir10c：活性链序列如seqidno.19所示，其中n为c，其互补链序列如seqidno.20所示，其中n为g；

mir11a：活性链序列如seqidno.21所示，其中n为a，其互补链序列如seqidno.22所示，其中n为u。

mir12u：活性链序列如seqidno.23所示，其中n为u；其互补链序列如seqidno.24所示；

mir13a:活性链序列如seqidno.25所示，其中n为a；其互补链序列如seqidno.24所示。

本发明提供的rna分子为mir-34a序列5’端第10位～第22位中的任一碱基突变为n，所述n为a、c、g或u；采用该rna分子及其互补链能够抑制肿瘤细胞中pd-l1、b7-h3、b7-h4蛋白水平，抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，从而起到抗肿瘤的作用。并且，研究表明，本发明提供的微小rna在抗肿瘤的同时，对血清中细胞因子的分泌均没有显著影响。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

10×taqbuferwithkcl、mgcl2、dntps、taqdna聚合酶、generuler100bpdnaladder(thermo，美国)，西班牙琼脂糖(sunshinebio)，6×dnaloadingdye、反转录试剂盒(takara，日本)，pcr引物(苏州金唯智生物科技有限公司)，gelrednucleicacidgelstain(biotium，美国)，triton-100、mgcl2·6h2o、edta、nacl、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、十二烷基磺酸钠(sds)、吐温-20、二甲亚砜、甘氨酸、盐酸、蔗糖、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，胎牛血清、opti-mem(gibco，美国)，脂质体2000、trizol(invitrogen，美国)，dmem培养基、胰蛋白酶(hyclone，美国)，切胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒(axygen，美国)，bca蛋白定量试剂盒；氨卞青霉素(北京索莱宝科技有限公司)，酵母提取物、蛋白胨(oxoid，英国)；cck8(东仁化学科技(上海)有限公司，日本)，蛋白酶抑制剂(roche，瑞士)，proteingsepharosebeads(ge，美国)，ripa裂解液、sds-page蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所，中国)，proteinladder和二抗(santacruz，美国)，pd-l1、b7-h3、b7-h4蛋白一抗(santacruz，美国)；ecl化学发光试剂盒、nc膜、pvdf膜(密理博，德国)，去离子水(由上海和泰master-s超纯水机制备)，微小rna(上海吉玛基因有限公司化学合成；hplc纯化，纯度>97％)；matrigel(bd，美国)；流式细胞因子检测试剂盒bdcytometricbeadarray(cba)humanth1/th2/th17cytokinekit(bd，美国)。

枪尖、1.5mlep管(axygen，美国)，细胞培养皿及培养板、离心管(corning，美国)，电子天平(scountse，中国)，微波炉(media，中国)；pcr仪、水平电泳仪、垂直电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统(bio-rad，美国)；流式细胞仪(beckman，美国)；移液枪、高速离心机(eppendorf，德国)，紫外分光光度计(q5000，美国)，平行震荡仪、高速低温离心机、细胞培养箱、-80℃超低温冰箱(thermoscientific，美国)，常速离心机(joμan，法国)，倒置显微镜及荧光显微镜(o1ympμs，日本)，微量紫外可见光分光光度计(q5000，美国)，电热恒温培养箱(pyx-dhs，中国)，电热恒温水浴箱(hh-s型，中国)，恒温振荡培养箱(hzq-x100，中国)，酶标仪(tecan，瑞士)，游标卡尺，1ml注射器(江苏正康医疗器械有限公司，中国)。

人结直肠癌细胞(hct-116、hct-8、caco-2、sw480)、sgc-7901胃癌细胞、a549肺癌细胞、panc-1胰腺癌细胞和hela宫颈癌细胞(atcc，美国)，大肠杆菌top10(novagen，美国)，细胞株经检测，无支原体污染。

裸鼠(balb/cathymicnu+/nu+)和c57bl/6小黑鼠，4周龄，体重18～22g，订购于上海斯莱克实验动物有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

进行实验的rna序列如表1：

表1微小rna序列

本发明的实验方法包括：

1、细胞培养

所有细胞株均采用含10％胎牛血清的rpmi-1640或dmem培养基进行培养，培养条件为37℃、5％co2、饱和湿度。细胞生长至80％左右，用0.25％胰酶消化传代。每天观察细胞的形态及生长速度，及时更换新鲜培养基。

2、转染微小rna

按5×10⁴个细胞/孔的量在24孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞80％汇片。24小时后，将一定浓度的微小rna稀释至25μl不含血清和抗生素的rpmi1640培养基中，用移液枪轻轻混合均匀；将1μl脂质体2000(invitrogen公司)悬液加入25μl不含血清和抗生素的rpmi1640培养基中，室温孵育5min；最后将两者混合在一起，充分混匀，室温静置20min，使微小rna与脂质体充分结合。最后，将此混合物加入细胞培养孔中。

3、蛋白免疫印迹检测

标准免疫印迹方法检测目的蛋白表达。25pg蛋白上样，sds-page(聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离，蛋白电转至硝酸纤维素膜。pd-l1、b7-h3、b7-h4蛋白一抗孵育，然后用1:1000酶标二抗孵育，发光试剂显色检测；gapdh作为内参蛋白。

4、流式细胞术检测细胞因子

在hct-116细胞中转染微小rna。48小时后，将其与新分离t细胞共培养16小时，收集上清，流式细胞仪检测细胞因子。首先，各取il-2、il-4、il-6、il-10、ifn-γ、tnf-α共6种细胞因子的磁珠120μl至流式管中，避光静置30min。取650μl检测缓冲液，用250μl稀释液稀释。取出5只流式管，分别加入40μl稀释后的检测缓冲液、40μl混合均匀的磁珠、40μl按照1：256、1：128、1：64、1：32和1：16稀释的标准品，制作标准曲线。另取流式管，分别加入40μl稀释后的检测缓冲液、40μl混合均匀的磁珠和40μl样品。避光静置2h，每隔30min震荡一次。每管依次加入1ml清洗缓冲液，200g离心5min，弃上清。再加入300μl鞘液与底部磁珠形成混悬液，流式仪检测。

5、动物实验

hct-116人结直肠癌细胞与基质胶1:1冰上混合，接种于裸鼠左侧腋部皮下。每只鼠注射100μl混合液，约500万细胞。接种后2周成瘤。待肿瘤长至150-200mm³后，将实验动物随机分为3组，每组6只鼠；溶剂对照组、阴性对照组、给药组分别给予生理盐水、阴性对照核酸序列、受试微小rna。每只裸鼠静脉注射给药体积设置为50μl，剂量为2nmol/鼠/次；每两天注射一次，一共给药五次。从给药第一天开始，每3天测定肿瘤大小和裸鼠体重一次；肿瘤大小使用公式v＝(a×b²)/2计算，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。

6、cck8法检测细胞活性

向细胞培养孔中加入cck-8溶液，在培养箱中继续培养0.5小时后，酶标仪检测450nm处吸光值(a)，计算抑制率＝(样品a值-空白a值)/(对照a值-空白a值)×100％。

本发明的实验结果为：

从seqidno.1-22中随机选择13条微小rna，测定其抑制hct-116结直肠癌细胞生长的活性。结果如图2所示，这些微小rna抑制肿瘤细胞生长的活性均显著高于mir-34a-5p(包含seqidno.26：5’-uggcagugucuuagcugguugu-3’和seqidno.24：5’-aaccagcuaagacacugccauu-3’)，如mir2g、mir3a、mir4c、mir5u、mir7a、mir8a、mir12u和mir13a等，或与之相当(如mir1a、mir6u、mir9c、mir10c和mir11a等)。再选取两对微小rna(mir1a：包含seqidno.1和seqidno.2，其中n分别为a和u；mir9c：包含seqidno.17和seqidno.18，其中n分别为c和g)进一步研究其在hct-116结直肠癌细胞、hct-8结直肠癌细胞、caco-2结直肠癌细胞、sw480结直肠癌细胞、sgc-7901胃癌细胞、a549肺癌细胞、panc-1胰腺癌细胞和hela宫颈癌细胞等肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。结果如图3所示，各种肿瘤细胞的生长均被显著抑制，显示微小rna具有很好的广谱抗肿瘤活性。

此外，我们还分别比较了活性链序列完全相同的粘性末端mir1a和mir9c与平端mir1a(包含seqidno.1和seqidno.27：5’-acaaccagcuaauacacugcca-3’)和平端mir9c(包含seqidno.17和seqidno.28：5’-acaagcagcuaagacacugcca-3’)抑制hct-116细胞生长的作用，同时也比较了粘性末端mir-34a-5p(包含seqidno.26和seqidno.24)与平端mir-34a-5p(包含seqidno.26和seqidno.29：5’-acaaccagcuaagacacugcca-3’)的活性差异。结果如图5所示，在这三对微小rna中，所有粘性末端微小rna的抗肿瘤活性均显著强于与之对应的平端微小rna，表明粘性末端微小rna具有更强的抗肿瘤活性。

我们在裸鼠中接种hct-116细胞构建肿瘤模型。待肿瘤长至150-200mm³后，给予微小rna(mir9cm：序列包含seqidno17和seqidno18，其中n分别为c和g；seqidno18包含22个连接2'-氧基-甲基基团的核糖的核苷酸，其5’端第1、2、19、20、21和/或22个磷酸基团中的羟基被硫取代，3’末端核糖上的羟基连接胆固醇)进行治疗。结果如图6所示，mir9cm显著抑制了裸鼠中hct-116细胞移植瘤的生长，但不影响小鼠的体重和摄食量；而且，在刚停药时mir9cm治疗组肿瘤体积显著小于mir-34a-5p组，p<0.05。

我们采用体内外实验研究了微小rna的安全性。首先，我们将微小rna直接作用于肿瘤细胞，观察其对肿瘤细胞分泌细胞因子的影响；结果如图7所示，微小rna(mir9c)下调了hct-116细胞培养液中il-2、il-4、il-6、il-10、ifn-γ等5种细胞因子的水平。然后，我们将转染有微小rna的hct-116细胞与t细胞共培养，观察微小rna作用后肿瘤细胞诱导t细胞分泌细胞因子的影响。结果如图8所示，mir9c作用于肿瘤细胞后不会诱导t细胞分泌il-2、il-4、il-6、il-10、ifn-γ、tnf-α等细胞因子。最后，在小鼠中静脉注射高剂量微小rna(mir9cm)后，测定小鼠血清中细胞因子水平；结果如图9所示，除il-2外，mir9cm对小鼠血清中il-4、il-6、il-10、ifn-γ、tnf-α等5种细胞因子的分泌均没有显著影响。

为了研究微小rna的抗肿瘤机制，我们测定了微小rna对pd-l1、b7-h3和b7-h4等负性协同刺激分子表达的影响。结果如图10所示，两对微小rna(mir1a和mir9c)均显著抑制了hct-116细胞中pd-l1、b7-h3和b7-h4蛋白表达。此外，在经mir9cm治疗后的裸鼠接种肿瘤中，pd-l1、b7-h3和b7-h4的蛋白表达水平均低于阴性对照组(图11)。本发明首次发现并证实pd-l1、b7-h3和b7-h4是微小rna(mir1a和mir9c)的作用靶点。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>苏州大学

<120>微小rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130>mp1723085

<160>29

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（10）=a、g、u

<400>1

uggcagugunuuagcugguugu22

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（11）=a、g、u

<400>2

aaccagcuaanacacugccauu22

<210>3

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（11）=a、g、u

<400>3

uggcagugucnuagcugguugu22

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（10）=a、g、u

<400>4

aaccagcuangacacugccauu22

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（12）=a、g、u

<400>5

uggcagugucunagcugguugu22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（9）=a、g、u

<400>6

aaccagcunagacacugccauu22

<210>7

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（13）=a、g、u

<400>7

uggcagugucuungcugguugu22

<210>8

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（8）=a、g、u

<400>8

aaccagcnaagacacugccauu22

<210>9

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（14）=a、g、u

<400>9

uggcagugucuuancugguugu22

<210>10

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（7）=a、g、u

<400>10

aaccagnuaagacacugccauu22

<210>11

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（15）=a、g、u

<400>11

uggcagugucuuagnugguugu22

<210>12

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（6）=a、g、u

<400>12

aaccancuaagacacugccauu22

<210>13

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（16）=a、g、u

<400>13

uggcagugucuuagcngguugu22

<210>14

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（5）=a、g、u

<400>14

aaccngcuaagacacugccauu22

<210>15

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（17）=a、g、u

<400>15

uggcagugucuuagcunguugu22

<210>16

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（4）=a、g、u

<400>16

aacnagcuaagacacugccauu22

<210>17

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（18）=a、g、u

<400>17

uggcagugucuuagcugnuugu22

<210>18

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（3）=a、g、u

<400>18

aancagcuaagacacugccauu22

<210>19

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（19）=a、g、u

<400>19

uggcagugucuuagcuggnugu22

<210>20

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（2）=a、g、u

<400>20

anccagcuaagacacugccauu22

<210>21

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（20）=a、g、u

<400>21

uggcagugucuuagcuggungu22

<210>22

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（1）=a、g、u

<400>22

naccagcuaagacacugccauu22

<210>23

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（21）=a、g、u

<400>23

uggcagugucuuagcugguunu22

<210>24

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

aaccagcuaagacacugccauu22

<210>25

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（22）=a、g、u

<400>25

uggcagugucuuagcugguugn22

<210>26

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

uggcagugucuuagcugguugu22

<210>27

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>n（13）=a、g、u

<400>27

acaaccagcuaanacacugcca22

<210>28

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

acaagcagcuaagacacugcca22

<210>29

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

acaaccagcuaagacacugcca22