飞蝗节间膜表皮蛋白基因1及其在蝗虫防治中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)及在害虫防治中的应用。

背景技术：

飞蝗是我国重要农业害虫，由于其具有翅可以在陆地之间长距离迁移飞行，从而在觅食、求偶、避敌和扩大分布效率等方面都得到大幅度提高，对农业生产造成严重危害。飞蝗成虫的体长，雄虫为32.4～48.1毫米，雌虫为38.6～52.8毫米。在正常情况下，成虫羽化后平均7天左右即可交配，雌虫一生可进行多次交配，交配后4～7天即可产卵在土下，深度约为4～6厘米。卵产下时分泌粘液胶着卵粒形成卵囊。每头雌虫一般可产卵囊4～5块，每块一般含卵50～80粒，一生所产卵粒总数平均为200～400粒。飞蝗能够深入土下产卵是由于其雌虫节间膜具有延伸性。飞蝗共有9个附节，8个节间膜，节间膜中含有大量表皮蛋白。表皮蛋白是昆虫表皮重要组成成分，在表皮结构形成中具有重要作用，其成分的缺失或含量变化都会引起表皮功能异常甚至功能丧失，从而影响昆虫的生长发育。在飞蝗生殖中，当表皮蛋白含量减少后其节间膜结构可被破坏而不能延展，导致无法深入土下产卵，进而导致其后代种群数量减少。

目前对蝗灾的防治主要依靠化学防治，然而长期施用化学杀虫剂导致一系列问题，如环境污染，抗药性产生和对非靶标生物的危害等。因此，开发新型、可替代化学防治的方法变得极其紧迫。rna干扰(rnai)是一种由双链rna分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，rnai技术一直跻身于科技前沿。rnai不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过rna干扰进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)rna在自然界极易降解，无残留；3)对环境无毒无害，相对安全。因此学者将其称为第四代杀虫剂。基于rna干扰进行害虫防治的基础技术是筛选靶标序列获得具有高致死作用的dsrna。

针对飞蝗产卵生殖的特点，本发明基于rna干扰技术，选取飞蝗节间膜表皮蛋白基因为对象，利用其重要生物学功能来进行害虫防治，安全高效，是一种环境友好型、对人类无毒无害、特异性的新型分子靶标的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)全长序列及其合成的dsrna在蝗虫防治中的应用。

本发明提供一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因全长序列，其核苷酸序列分别为seqidno：1。该基因全长序列是基于飞蝗转录组数据库，搜索获得的片段通过genedoc软件结合飞蝗基因组序列对其进行拼接，然后经pcr全长扩增、克隆测序获得。该核苷酸长度为926bp，orf序列全长582bp，编码193个氨基酸，分子量为20.9kd，理论等电点为5.19，含有一个信号肽以及一个rr-1型几丁质结合域。

本发明提供的一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因，其核苷酸序列分别是seqidno：2，是根据seqidno：1通过primerpremier5.0软件设计含有t7启动子的上游引物seqidno：3和下游引物seqidno：4，通过pcr扩增获得seqidno：2，其产物含有t7启动子。产物经纯化后按照t7ribomax^tmexpressrnaisystem(promega)试剂盒说明体外转录分别合成dsrna(dslmabd1)。

seqidno：2合成的dsrna在飞蝗防治中的应用：通过微量进样器将seqidno：2合成的dsrna注射进入5龄2天飞蝗若虫体腔内。结果表明：和对照相比，seqidno：2合成的dsrna可以特异性地、极显著的沉默一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)的mrna表达，并导致成虫虫体出现蜕皮困难，节间膜无法闭合，最终导致害虫腹部无法深入土中产卵而导致卵囊数和卵粒数显著减少。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明经多次实验，表明注射dsrna能导致飞蝗后代卵粒数减少量达到31.7％以上。本发明的特异性及高效性，对于减少害虫产卵数和后代种群数量具有显著效果，可以为害虫防治提供新的途径。

附图说明

图1：一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)在飞蝗雌雄成虫不同位置节间膜中的表达差异，β-actin做为内参基因。

图2：飞蝗注射seqidno：2合成的dsrna24小时后，一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)的mrna沉默情况，β-actin做为内参基因，其中***p<0.001。

图3：5龄飞蝗注射seqidno：2合成的dsrna，蜕皮后成虫节间膜出现发育异常的表型。左为注射dsgfp的对照；右为注射dslmabd1节间膜异常的表型图。

图4：飞蝗注射seqidno：2合成的dsrna，雌虫卵囊数和卵粒数相比于对照组dsgfp显著减少。a为雌虫卵囊数和卵粒数，从左到右分别为注射dsgfp的对照，注射seqidno：2合成的dsrna；b为注射dsgfp的对照和注射seqidno：2合成的dsrna后的平均卵粒数。

具体实施方式

实施例1：一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因全长序列获得

1、一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因全长序列获得

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗表皮蛋白基因进行搜索，经过序列分析并结合飞蝗基因组序列拼接及比对后，获得一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)序列，采用primerpremier5.0软件设计上、下游引物序列并送往生工生物工程(上海)有限公司合成。选取生长健康，大小一致的飞蝗雌雄成虫，解剖节间膜组织，并冷冻于液氮中。6头一个生物学重复，设4个生物学重复，依照takaratrizol试剂盒提取总rna。采用m-mlv反转录酶将所提总rna反转录成第一链cdna，以此做为模板，结合设计的上下游引物，通过pcr扩增获得lmabd1基因全长片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往上海英潍捷基生物有限公司进行测序，其序列为seqidno：1。

2、一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因在飞蝗雌雄成虫节间膜组织表达差异

选取生长健康，大小一致的飞蝗雌雄成虫，按顺序解剖各个节间膜组织，并冷冻于液氮中。6头一个生物学重复，设4个生物学重复，利用1中总rna提取方法并获得不同雌雄成虫节间膜cdna模板，通过实时荧光定量pcr(rt-qpcr)检测一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因(lmabd1)在雌雄成虫不同节间膜中的表达差异，结果显示lmabd1在雌虫第4、5和6节间膜组织中的表达量较高且均极显著的高于对应位置雄虫节间膜中的表达量(图1)，说明lmabd1可能在雌虫第4、5和6节间膜中具有重要作用。

3、一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因特异性dsrna合成

1)一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因dsrna引物的设计

基于一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因序列(seqidno：1)，采用primerpremier5.0软件设计dsrna引物，其引物序列分别为上游引物seqidno：3和下游引物seqidno：4。上下游引物均携带t7启动子序列。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2)一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因dsrna的合成

以上述一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因提取的质粒为模板，利用上游引物seqidno：3和下游引物seqidno：4进行pcr扩增。将扩增的pcr产物，经gelextractionkit(sigma)试剂盒纯化后按照t7ribomax^tmexpressrnaisystem(promega)试剂盒说明分别体外转录合成dsrna。使用nanodrop2000(thermoscientific)进行定量，使其终浓度达到2μg/μl。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

实施例2：一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因dsrna致死飞蝗实验

1、一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因dsrna注射

选取生长健康、大小一致的30头5龄第2天雌性若虫进行实验。将5μl(10μg)的dsrna用25μl规格微量注射器顺着血流方法轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时选取30头雌性若虫设立为对照组。注射相同体积和浓度的dsgfp至对照组体内。挑取生长健康、大小一致的等量雄虫分别与注射后的雌性飞蝗混合置于30℃恒温生化培养箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

2、一种飞蝗节间膜表皮蛋白基因沉默检测

收集注射dsgfp和dslmabd124h后的若虫各15头，解剖节间膜组织进行总rna提取，并反转录成第一链cdna，每组设置3个生物学重复，每个生物学重复5头若虫，采用rt-qpcr方法分别检测目的基因(lmabd1)和管家基因(β-actin)的相对表达量，计算其沉默效率。结果表明，与对照组比较，处理组lmabd1表达量均极显著降低(图2)。

3、注射dsrna后成虫表型观察

5龄若虫经注射dsgfp和dslmabd1后，注射dsgfp对照组6天后开始蜕皮并全部成功蜕至成虫，蜕至成虫后虫体形态活力正常，并于半天后开始正常进食。注射dslmabd1的处理组雌性若虫共15头，与对照组若虫相比，其中大约40％成虫节间膜无法正常闭合(图3)，交配后无法正常深入土中产卵，其中卵囊数和卵粒数均显著减少(图4)。

序列表

<110>山西大学

<120>飞蝗节间膜表皮蛋白基因1及其在蝗虫防治中的应用

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<213>飞蝗(locustamigratoria)

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