一种响应番茄黄化曲叶病毒的SolyWRKY41基因的功能分析及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，涉及植物的一个wrkyiii类转录因子的应用。本发明从番茄中鉴定到一个响应番茄黄化曲叶病毒的wrkyiii类转录因子基因solywrky41，该基因有助于进行番茄响应番茄黄化曲叶病毒的抗性机制研究。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicuml.)属于茄科(solanaceae)，番茄属(solanum)，富含糖、食物纤维、矿物质、氨基酸及维生素等营养物质，在平衡人民饮食方面发挥着重要的作用。番茄不仅能降血脂降压，抗真菌，消炎，还能预防胃癌，特别是番茄红素具有抗氧化的功效，在化妆品及制药方面应用广泛。近年来，番茄栽培面积不断增加，对农民增收起着重要的作用，成为世界范围内广泛种植的主要蔬菜之一。

番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlyvirus，tylcv)是一类由烟粉虱进行传播的植物病毒，属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属。tylcv能够危害南瓜、烟草、番茄等多达20种不同的植物。感染2周后，感病症状开始出现，主要表现为叶片逐渐黄化卷曲，新生叶片变小，皱缩，植株矮化；后期植株生长变缓甚至停滞，花朵枯萎。早期发病会严重影响植株的产量，后期发病主要会影响植株花及果实，使产量降低，品质下降，从而造成严重的经济损失(glicketal.，plantprotectsci2009，45：81，97)。近年来，由于烟粉虱的大量爆发及难以控制，tylcv已广泛传播到世界各个地方，如地中海、日本、中国(lefeuvreetal.，plospathog2010，6：1-12)。

作为一类重要的转录因子，wrky转录因子参与了多种生物过程，包括种子发育及衰老、生物胁迫、非生物胁迫等(rushtonetal.，trendsinplantsci2010，15：247-258；eulgemetal.，curropininplantbiol2007，10：366-371；guoetal.，plantcellenviron2004，27：521-549；wuetal.，plantcellrep2009，28：21-30)。wrky转录因子家族可以分为i、ii、iii三个亚族，wrkyiii类转录因子可以参与不同的信号途径，从而提高植物的抗病性(kaldeetal.，molplantmicrobein2003，16：295-305；besseauetal.，jexpbot2012，63：2667-2679；gongetal.，plantcellenviron2015，38：2248-2262)。

技术实现要素：

本发明获得了一种番茄wrkyiii类转录因子基因solywrky41，同时开展了该转录因子响应tylcv的功能分析及应用研究。solywrky41基因响应tylcv的研究对于深入了解番茄响应tylcv的过程有着较为重要的意义，为培育抗性番茄品种提供信息。

附图说明

图1.番茄solywrky41的氨基酸序列与拟南芥wrky家族的进化树分析，方框标注的为番茄solywrky41转录因子。

图2.番茄solywrky41的亚细胞定位分析。

图3.番茄solywrky41基因在不同番茄品种中响应tylcv的表达分析。

图4.病毒诱导基因沉默验证番茄solywrky41基因功能。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，具体实验步骤如下：

1.番茄转录因子基因solywrky41基因的克隆

以番茄‘浙杂301’叶片的cdna为模板，设计一对特异引物(正向：5’-atggagaaagttaaaagtatgga-3’，反向5’-ttaaatgaagaattcttcaatgtc-3’)进行扩增。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min10s，共35个循环；72℃延伸10min。将目的条带进行回收、连接并转化大肠杆菌dh5α，挑取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

2.番茄转录因子solywrky41的亚细胞定位

通过核苷酸序列测定，获得了番茄转录因子基因solywrky41的序列。将该序列根据设计的特异引物构入pa7载体(中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心，北京)，正向：5’-caccatcaccatcacgccatgatggagaaagttaaaagtatgga-3’，反向：5’-cactagtacgtcgaccatggcaatgaagaattcttcaatgtc-3’。含有35s：：gfp(绿色荧光蛋白)的pa7空载作为对照，将构建好质粒导入烟草叶片细胞中，通过共聚焦显微成像系统lsm780(zeiss，oberkochen，germany)观察该蛋白所在位置。

3.实时定量pcr反应

将生长至2叶状态的抗病番茄品种‘浙杂301’(浙江省农科院蔬菜所，杭州)及感病番茄品种‘金棚1号’(西安金鹏种苗有限公司，西安)幼苗分别置于带有tylcv的烟粉虱防虫温室中。处理2、4、6、8、10d后取叶片样本并立即用液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。根据solywrky41基因序列设计表达检测引物，正向5’-gcaacaccaaaccataacgctgaa-3’，反向5’-aggaatttgaaatcgaagtcggagt-3’。实时定量pcr采用iqtm5pcr仪及其系统(bio-rad，hercules，ca，usa)，按照操作说明进行。以番茄tubulin基因的转录表达水平为内参，计算目的基因相对表达水平2^-δδct(chenetal.，plosone2013，8：e80816；yuaneta.，bmcbioinformatics2006，7：563-569)。

4.病毒诱导基因沉默及tylcv含量测定

病毒诱导基因沉默实验所需载体为ptrv1和ptrv2(liuetal.，plantj2002，30：415-429)。将扩增好的solywrky41基因片段克隆到ptrv2载体上。同时将重组质粒转化农杆菌gv3101(北京天恩泽基因科技有限公司，北京)。以ptrv1+ptrv2为阴性对照，ptrv1+ptrv2-pds(八氢番茄红素脱氢酶)为阳性对照，用菌液注射抗性番茄品种‘浙杂301’子叶。一周后取样提取rna测定基因沉默水平。将沉默后的番茄幼苗转移到带毒烟粉虱防虫温室中进行感病处理，一周后取样并提取dna。根据tylcv基因组序列设计检测引物(ncbi登录号：am282874.1)，正向：5’-agtaccgcaactgtgaagaatgatt-3’，反向5’-catacttggctgcctcctgatgat-3’。

5.试验结果：1)将番茄solywrky41基因编码的氨基酸序列与拟南芥wrky氨基酸序列构建同源进化树，结果表明番茄solywrky41和拟南芥wrkyiii类亚族转录因子归为一类，属于wrky转录因子家族iii类亚族成员(图1)。2)亚细胞定位结果表明，番茄solywrky41属于核蛋白(图2)。3)荧光定量pcr结果显示番茄solywrky41响应tylcv。在抗病品种‘浙杂301’中，solywrky41一直处于负调控的表达模式。感病品种‘金棚1号’中，solywrky41在处理4d时表达量达到峰值，表达量增加了1.5倍(图3)。4)病毒诱导基因沉默表明，番茄solywrky41基因在响应tylcv过程中起着负调控的作用，沉默后的solywrky41番茄植株与对照相比，tylcv病毒含量降低(图4)。