本发明涉及一种体外活化人记忆性B细胞成浆细胞培养方法。
背景技术：
：记忆性B细胞是初次免疫应答后克隆消除保留下来的高亲和力细胞，它是机体重要的免疫细胞，在体液免疫中扮演着十分重要的角色，对浆细胞的产生、抗体的生成以及持久的免疫保护起关键的作用。记忆性B细胞的长期免疫记忆机制在临床治疗、疫苗研制以及全人源单抗药物研发方面起着重要的指导作用。由于人外周血淋巴细胞中浆细胞数量少，提取困难，即使能少量的被提取，但其提取方法繁琐，成本高，获得率低，不适宜推广，因此体外活化外周血记忆B细胞的研究成为了热点。在20世纪80年代，就有研究者使用人类同种异体辅助性T细胞来诱导B细胞增殖、分化。2002年，Bernasconi等发现TLR9激动剂CpG与IL-15可促进类别转换的记忆B细胞增殖。2004年，Crotty等应用美洲商陆丝裂原(PWM)、葡萄球菌A蛋白(SAC)以及CpG活化了记忆B细胞。2007年，Ertesvag等证实维生素A酸(RA)可增强CpG介导的CD27+记忆B细胞的增殖。2009年，Pinna等使用TLR7/8激动剂R848、IL-2、CD40L转染细胞可选择性地活化记忆B细胞。2011年，Wand等运用活化的树突状细胞、T细胞和B细胞之间相互作用诱导了抗原特异性抗体的产生。这些组合均不同程度的活化了记忆B细胞。虽然上述组合均成功的活化了记忆B细胞，但它们或多或少存在以下缺点：活化效率不高，活化质量低下，操作繁杂，成本昂贵。针对目前体外活化记忆B细胞的不足，本发明中，我们利用IL-2、IL-21、饲养细胞以及少量的记忆B细胞，在体外高效活化了记忆B细胞，为制备高亲和力、治疗性全人源单克隆抗体药物提供了牢固的研究基础。技术实现要素：本发明的目的在于针对目前体外活化记忆B细胞的不足，提供一种人记忆性B细胞的体外活化培养方法。本发明是利用辐照的3T3-CD40L细胞作为饲养层细胞，10％FBS的IMDM作为基础培养液，IL-2、IL-21作为生长因子，体外诱导记忆B细胞活化成浆细胞并分泌抗体的过程。本发明所述制备方法包括下列步骤：1.记忆性B细胞的获取：无菌环境下采集志愿者的全血，用淋巴细胞分离液从新鲜的抗凝全血中分离出人外周血单核细胞，再使用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒从外周血单核细胞中分离出记忆性B细胞。2.记忆性B细胞的体外活化培养：将分选所得的记忆B细胞按照0细胞/孔、5细胞/孔、20细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板，10％FBS的IMDM作为基础培养液，培养液中含30ng/mL的IL-2和60ng/mL的IL-21以及5000cGy的60Co照射灭活的3T3-CD40L细胞以10000/孔作为饲养层细胞，在37℃，5％CO2条件下培养13d，让记忆性B细胞活化成为抗体分泌细胞，收集上清用于下一步检测。3.ELISA检测记忆性B细胞体外活化培养后的分泌性抗体IgG：收集步骤(2)中的细胞培养上清，使用GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白包被酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测记忆性B细胞的培养基上清，确定IgG抗体的分泌量；具体步骤如下：(A)用包被液(50μL/孔)将GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶标板，4℃过夜，洗板机洗板5遍，洗液为含0.05％Tween的PBS；(B)用封闭液200μL/孔，37℃封闭2h，洗板5遍；(C)分别在对应孔中加入细胞培养上清，或者梯度稀释的IgG标准品，同时用水或PBS作为阴性对照，50μL/孔，37℃放置1h，洗板5遍；(D)分别在对应孔中加入1:5000稀释的HRP标记的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀释的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入显色液100μL/孔，室温避光显色15min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，终止显色反应，检测OD450nm，参考波长为630nm，表5为Elisa检测细胞培养上清IgG的OD值。本发明的有益效果：使用辐照的3T3-CD40L细胞作为饲养层细胞，10％FBS的IMDM作为基础培养液，IL-2、IL-21作为生长因子，体外诱导记忆B细胞活化并分化为分泌抗体的浆细胞的过程。本发明的优点是：操作简单，成本较低，所需记忆B细胞数量少，活化效率以及活化质量高。具体实施方式1.记忆性B细胞的获取：无菌环境下采集志愿者的全血，用淋巴细胞分离液从新鲜的抗凝全血中分离出人外周血单核细胞，再使用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒从外周血单核细胞中分离出记忆性B细胞，表1为人外周血单个核细胞数目；表2为B淋巴细胞数目；表3为记忆性B淋巴细胞数目。2.记忆性B细胞的体外活化培养：将分选所得的记忆B细胞按照0细胞/孔、5细胞/孔、20细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板，10％FBS的IMDM作为基础培养液，培养液中含30ng/mL的IL-2和60ng/mL的IL-21以及5000cGy的60Co照射灭活的3T3-CD40L细胞以10000/孔作为饲养层细胞，在37℃，5％CO2条件下培养13d，让记忆性B细胞活化成为抗体分泌细胞，收集上清用于下一步检测。3.ELISA检测记忆性B细胞体外活化培养后的分泌性抗体IgG，其中表4为Elisa检测一抗布局，具体步骤如下：(A)用包被液(50μL/孔)将GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶标板，4℃过夜。洗板机洗板5遍。洗液为含0.05％Tween的PBS；(B)用封闭液200μL/孔，37℃封闭2h，洗板5遍；(C)分别在对应孔中加入细胞培养上清，或者梯度稀释的IgG标准品，同时用水或PBS作为阴性对照，50μL/孔，37℃放置1h。洗板5遍；(D)分别在对应孔中加入1:5000稀释的HRP标记的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀释的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入显色液100μL/孔，室温避光显色15min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，终止显色反应，检测OD450nm，参考波长为630nm，表5为Elisa检测细胞培养上清IgG的OD值。表1样品编号细胞数目1号2.6×1072号4.5×1073号3.16×107表2样品编号细胞数目1号2.4×1062号3.82×1063号2.9×106表3样品编号细胞数目1号0.9×1052号1.5×1053号1.2×105表4样本123456789101112A水水水水水水水水水水水水B水B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)PBSC水B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)B(0)PBSD水B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)PBSE水B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)B(5)PBSF水B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)PBSG水B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)B(20)PBSHPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS表5当前第1页1 2 3