一种快速获得和纯化人脐带间充质干细胞的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种获得和纯化干细胞的方法。具体地，涉及一种快速获得人脐带间充质干细胞，并在短期内获得高度纯化干细胞的方法。

背景技术：

间充质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)是广泛存在于机体组织器官间质中，具有自我增殖能力、多向分化能力的干细胞。大量文献报道，MSCs可以在不同条件下，向属于中胚层、内胚层甚至外胚层的终末细胞分化。因此广泛地被应用于细胞生物学、组织工程学等研究中。

在组织工程研究中，MSCs的来源一直是其发展的瓶颈。在既往使用的MSCs中，成体细胞来源的MSCs数量有限，取材会带来新的创伤，且获得的细胞增殖能力不强；胚胎来源的MSCs数目较多，增殖力强，但存在来源上的伦理问题；骨髓来源的MSCs虽然较多且增殖力较强、可方便地自体取材、不存在伦理问题，但骨髓中MSCs的数量非常少，与造血干细胞等其他细胞相比，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，骨髓腔干细胞数量急剧减少。因此，需要寻找更稳定可靠的MSCs来源。

近年来研究发现，在人的脐带中也发现了MSCs——人脐带间充质干细胞(human umbilical marrow stromal cells,hUMSCs)，因其来源稳定、易于获得、不存在伦理问题，有望成为组织工程理想的种子细胞。具有多向分化的潜能，在适当的条件下可分化为骨骼肌细胞、血管内皮细胞、中枢神经元和神经胶质细胞等。

hUMSCs是脐带华通氏胶样组织中所含有的一类多能干细胞，它能表达干细胞的相关标志，具有向终末组织细胞分化的能力。脐带为新生儿废弃组织，有来源广泛、自体取材、无排异反应等优势。但在研究中还存在一些问题，其中之一就是如何快速获得高纯度的hUMSCs。但是脐带是一个含有间充质干细胞、造血干细胞、成纤维干细胞等多种细胞的组织。在体外培养过程中，除了间充质干细胞的增殖外，造血系细胞、成纤维细胞的增殖也相当迅速.降低了所获取的脐带间充质干细胞纯度。因此，需要一种便捷、高效、经济的hUMSCs富集方法。我们将获取的脐带华通氏胶置于培养皿中，待细胞从胶块中爬出后，应用流式细胞仪对获得的原代贴壁细胞进行初步筛选，并用一种复合胶原酶进行差速消化法传代，以期能在较短时间内获得纯度较高的hUMSCs。

在先前获取hUMSCs的研究中，大多通常采用胶块酶消化法和差速贴壁法等来制备，但这些方法均存在一定不足。其中胶块酶消化法可获得较多干细胞，但此方法需将胶块长期浸泡在消化液中，对干细胞活力有较大影响，细胞贴壁能力及增殖能力往往达不到要求；而差速贴壁法获取hUMSCs的方法虽然要求低，易推广，但获为了提高干细胞纯度所需传代周期长，其速度往往达不到要求。而实验和临床研究需要一种便捷、高效、可靠的hUMSCs富集方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明目的是提供一种快速获得并纯化人脐带间充质干细胞(human umbilical marrow stromal cells,hUMSCs)的方法，在短时间内得到足够高纯度的可供研究和实际使用的hUMSCs。

为了实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

这种快速获得和纯化人脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1)在无菌条件下，收集人类新生儿脐带组织，用无菌PBS液冲洗，去除血污，将脐带中的血管组织通过机械分离法去除，得到华通氏胶块；

2)将步骤1)中获得的华通氏胶块用无菌剪制成小块，并用细胞培养液重悬后，接种于培养皿中，然后在培养箱中孵育，得到贴壁细胞；

3)将步骤2)培养皿中的培养液及悬浮细胞弃去，用复合胶原酶差速消化，将贴壁细胞消化下来，加入PBS清洗、重悬后得到细胞悬液：P1代hUMSCs；

4)将步骤3)得到的P1代hUMSCs用滤网过滤，去除华通氏胶块，收集过滤细胞液，离心后弃上清，再用无血清DMEM液清洗2次，用流式细胞仪进行细胞筛选；

5)将步骤4)中流式细胞仪筛选后得到的细胞再次用培养液重悬后，接种于培养皿中，然后在培养箱中孵育，得到贴壁细胞；

将步骤5)培养皿中再次用复合胶原酶差速消化，将贴壁细胞消化下来，得到的细胞悬液进行流式细胞仪鉴定，即可得到高纯度的P2代hUMSC。

作为优选：步骤1)中获取的脐带须以与胎盘连接处为起点，长度在40-50cm；所进行的操作均在无菌条件下进行，不额外使用抗生素。

作为优选：步骤2)中制成的华通氏胶块为2-3mm³左右，细胞培养液为：含体积分数为20-25％FBS的DMEM；培养箱孵育条件为：在37℃、5％CO₂、95％湿度的条件下，10cm培养皿中孵育，时间为72-96h。

作为优选：步骤3)中用于差速消化贴壁细胞、以提高所获脐带基质干细胞纯度的消化液为collegenase NB4复合胶原酶溶液，采用浓度为0.125-0.25％；添加胶原酶溶液后，将培养皿放入细胞培养箱内，37℃孵育15-20min后，加入0.05-0.1％的trypsin-EDTA终止复合胶原酶消化，加含体积分数为10％FBS的DMEM培养液终止trypsin-EDTA消化，加入PBS反复吹打后，收集所得细胞，以1000-1500r/min离心5min，去上清，用PBS重悬后再次离心，以洗去残留消化液。

作为优选：步骤4)中滤网为150-200目，洗涤细胞所用离心速度为600-800g，时间为3-5min；用流式细胞仪进行细胞筛选前，用带有一种荧光的干细胞表面CD标记抗体和带有另一种荧光的非干细胞表面CD标记抗体对细胞进行标记。

作为优选：步骤5)中流式细胞仪进行筛选后，细胞培养液采用的是含体积分数为8-10％FBS的DMEM，按细胞密度1×10⁴/cm²－2×10⁴/cm²接种于10cm培养皿中，培养箱孵育条件为：在37℃，5％CO₂、95％湿度的条件下，孵育时间为48-72h。

作为优选：步骤2)和步骤5)中，需待贴壁细胞长满至培养皿底的85％-90％后，再进行复合胶原酶差速消化。

本发明的有益效果是：1)全过程采用不含有抗生素的液体进行操作，避免抗生素对细胞的毒性影响hUMSCs的增殖活力；2)直接采用华通氏胶块进行培养，制成的华通氏胶块为2mm³左右，避免制作过小胶块所需的机械剪切使干细胞受到损伤，或者胶块过大使干细胞不易爬出；3)胶块所用培养液为：含体积分数为25％FBS的DMEM，有利于干细胞从胶块爬出；4)所用滤网可将胶块滤除，而干细胞得以滤过，采用的消化酶为复合酶，利用其对基质干细胞和成纤维细胞的胞外基质不同消化速度，实现差速消化分离；5)用干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记作为流式细胞仪筛选标记，一次筛选就大大提高干细胞表面CD标记阳性、非干细胞表面CD标记阴性的hUMSCs比例；6)经过2次复合胶原酶差速消化和1次流式细胞仪双CD抗原筛选，就可实现快速纯化并获得大量用于进一步研究所需的hUMSCs。

附图说明

图1为本发明的实施例1细胞培养示意图，2mm³左右的华通氏胶块置于含体积分数为25％FBS的DMEM培养72h后，有大量细胞从胶块中爬出(×40)；

图2为本发明的实施例1流式细胞仪筛选示意图，经复合胶原酶消化后得到的P1代hUMSCs经流式细胞仪筛选，得到61％左右的细胞，其表面CD标记阳性、非干细胞表面CD标记阴性；

图3为本发明的实施例1细胞培养示意图，用0.05％复合胶原酶覆盖皿底，在37℃培养箱中消化15min后，得到大量形态已成圆形的P2代hUMSCs(×40)；

图4为本发明的实施例1流式细胞仪鉴定示意图，P2代hUMSCs经过流式细胞仪鉴定，细胞表面CD标记阳性、非干细胞表面CD标记阴性的基质干细胞比例可达到95％左右。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

本发明提供了一套获得并纯化脐带干细胞的方法，其包括下述操作步骤：

1)在无菌条件下，收集人类新生儿脐带组织，用无菌PBS液冲洗，去除血污，将脐带中的血管组织通过机械分离法去除，得到华通氏胶块；

2)将步骤(1)中获得的华通氏胶块用无菌剪制成小块，并用细胞培养液重悬后，接种于培养皿中，然后在培养箱中孵育，得到贴壁细胞；

3)将步骤(2)培养皿中的培养液及悬浮细胞弃去，用复合胶原酶差速消化，将贴壁细胞消化下来，加入PBS清洗、重悬后得到细胞悬液(P1代hUMSCs)；

4)将步骤(3)得到的P1代hUMSCs用滤网过滤，去除华通氏胶块，收集过滤细胞液，离心后弃上清，再用无血清DMEM液清洗2次，用流式细胞仪进行细胞筛选；

5)将步骤(4)中流式细胞仪筛选后得到的细胞再次用培养液重悬后，接种于培养皿中，然后在培养箱中孵育，得到贴壁细胞；

6)将步骤(5)培养皿中再次用复合胶原酶差速消化，将贴壁细胞消化下来，得到的细胞悬液进行流式细胞仪鉴定，即可得到高纯度的P2代hUMSCs。

在上述步骤中，所进行的操作均在无菌条件下进行，所用液体为灭菌液体，无添加任何抗生素。

在上述步骤中，步骤1)获取的脐带须以其与胎盘连接处为起点，长度在40-50cm。

在上述步骤中，步骤2)中华通氏胶块不宜剪切得过小，制成2-3mm³左右的小块为宜，采用的培养液为含体积分数为20-25％FBS的DMEM，接种于培养皿后在37℃，5％CO₂、95％湿度的条件下，培养箱中孵育72-96h。

在上述步骤中，步骤3)中用于差速消化贴壁细胞、以提高所获脐带基质干细胞纯度的消化液为collegenase NB4复合胶原酶溶液，采用浓度为0.125-0.25％；添加胶原酶溶液后，将培养皿放入细胞培养箱内，37℃孵育15-20min后，加入0.05-0.1％的trypsin-EDTA终止复合胶原酶消化，加含体积分数为10％FBS的DMEM培养液终止trypsin-EDTA消化，加入PBS反复吹打后，收集所得细胞，以1000-1500r/min离心5min，去上清，用PBS重悬后再次离心，以洗去残留消化液。

在上述步骤中，步骤4)中滤网为150-200目，滤过后的细胞用无血清DMEM液清洗，离心条件为600-800g，离心时间3-5min，以上步骤重复两次洗涤杂质。用流式细胞仪进行细胞筛选前，用带有一种荧光的干细胞表面CD标记抗体和带有另一种荧光的非干细胞表面CD标记抗体对细胞进行标记。

在上述步骤中，步骤5)筛选后的细胞所用培养液为含体积分数为8-10％FBS的DMEM，按细胞密度1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²接种于10cm培养皿中，在37℃、5％CO₂、95％湿度的条件下，培养箱中孵育48-72h。

在上述步骤中，步骤2)和步骤5)需待贴壁细胞长满至培养皿底的85％-90％后，再进行复合胶原酶差速消化。

在本发明中，用流式细胞仪对获得P1代hUMSCs进行筛选及P2代hUMSCs进行鉴定，包括以下步骤：

a.带有一种荧光的干细胞表面CD标记抗体和带有另一种荧光的非干细胞表面CD标记抗体进行标记，IgG2a-CY5、IgG1-PE进行阴性对照标记。

b.4℃暗室中孵育30min，加无血清DMEM以600g-800g离心3-5min漂洗2遍，重悬成1mL悬液。

c.用流式细胞仪在无菌条件下分选带有一种荧光的CD抗体标记(标记了干细胞表面表达的特异性CD抗原)的细胞，以及带有另一种荧光的CD抗体标记(标记了非干细胞表面表达的特异性CD抗原)的细胞。

在本发明中，用流式细胞仪进行所述的筛选及鉴定，所使用的干细胞表面CD标记和非干细胞表面CD标记可以是表1中的任意组合，抗体所携带的有机荧光物为荧光为CY5、PE或FITC。

在本发明中，经流式细胞仪筛选后的细胞可按照细胞密度1×10⁴～2×10⁴/cm²的密度接种于10cm培养皿。

在本发明中，一次采到的新生儿脐带组织，用上述方法在单个10cm培养皿中培养，经过6-7d后，所得到的hUMSCs数可达1×10⁶以上，细胞纯度可达95％以上(图4)。

本发明所使用的材料，如无特别说明，均为市售产品。

表1为干细胞表面CD抗原，可在列表任选一个干细胞表面CD抗原和一个非干细胞表面CD抗原组成筛选标记：

实施例1

1、获取新生儿脐带

在无菌条件下，以脐带与胎盘连接处为起点获取长度在45cm的健康新生儿脐带组织，用PBS反复冲洗去除血污，用显微器械小心将脐带中的血管组织通过机械分离法去除，得到华通氏胶，将其剪切成2mm³左右的碎块。

2、获得P1代hUMSCs

1)将获得的华通氏胶碎块再次用PBS洗涤后，用体积分数为25％FBS的DMEM培养液重悬后，接种于10cm培养皿中，然后在37℃，5％CO₂、95％湿度的条件下，培养箱中孵育84h，得到贴壁细胞(图1)。

2)培养液及悬浮细胞弃去，并用PBS液洗涤后，加入0.125％复合胶原酶覆盖皿底，在37℃培养箱中消化15min后，加入0.05％的trypsin-EDTA终止复合胶原酶消化，加含体积分数10％FBS的DMEM培养液终止trypsin-EDTA消化，加入PBS反复吹打得到P1代hUMSCs细胞悬液。

3)将悬液用150目的滤网过滤，600g离心5min，再用无血清的DMEM洗涤2次。

3、用流式细胞仪对P1代hUMSCs进行筛选

1)分别在2个Eppendof管中，加入100μL buffer(含2％FBS)制成含有1×10⁵个细胞的悬液。1号管分别加入CD90-CY5、CD45-PE(各1μL)；2号管加入IgG2a-CY5、IgG1-PE(各1μL)作为阴性对照。4℃暗室中孵育30min，加buffer以800g离心3min漂洗2遍，加入buffer 10mL制成悬液，用流式细胞仪在无菌条件下分选表达CD90+、CD45-干细胞标记的细胞(约占61％，图2)。

2)获得分选细胞后再次离心后弃上清，加入含体积分数10％FBS的DMEM培养液,吹打形成悬液后,按细胞密度1×10⁴/cm²接种于10cm培养皿中。在37℃、5％CO₂、95％湿度的条件下孵育。

4、P2代hUMSCs的收获及鉴定

1)待60h后，细胞长满至10cm培养皿底的85％，用浓度为0.05％的collegenase NB4复合胶原酶溶液，对贴壁细胞进行差速消化(图3)。37℃孵育10min后，加入0.05％的trypsin-EDTA终止collegenase NB4消化，加含体积分数10％FBS的DMEM培养液终止trypsin-EDTA消化，获得的P2代hUMSCs。

2)收集吹打后所得细胞，以600g离心5min，去上清，用无血清的DMEM洗涤2次，去残留消化液，重悬后细胞计数达1×10⁶，流式细胞仪进行P2细胞纯度鉴定，纯度达95％(图4)。